Bakterienvesikel blockieren die Virusreplikation in Makrophagen über die TLR4-TRIF-Achse

Abstrakt

Gramnegative Bakterien sezernieren auf natürliche Weise nanogroße äußere Membranvesikel (OMVs), die wichtige Vermittler der Kommunikation und Pathogenese sind. Die Aufnahme von OMV durch Wirtszellen aktiviert die TLR-Signalübertragung über transportierte PAMPs. Als wichtige residente Immunzellen befinden sich Alveolarmakrophagen an der Grenzfläche zwischen Luft und Gewebe und bilden dort die erste Verteidigungslinie gegen inhalierte Mikroorganismen und Partikel. Bisher ist wenig über das Zusammenspiel zwischen Alveolarmakrophagen und OMVs pathogener Bakterien bekannt. Die Immunantwort auf OMVs und die zugrunde liegenden Mechanismen sind noch unklar. Hier untersuchten wir die Reaktion primärer menschlicher Makrophagen auf bakterielle Vesikel (Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica, Streptococcus pneumoniae) und beobachteten eine vergleichbare NF-κB-Aktivierung über alle getesteten Vesikel hinweg. Im Gegensatz dazu beschreiben wir eine differenzielle IFN-Signalübertragung vom Typ I mit verlängerter STAT1-Phosphorylierung und starker Mx1-Induktion, die die Replikation des Influenza-A-Virus nur für Klebsiella-, E. coli- und Salmonella-OMVs blockiert. OMV-induzierte antivirale Wirkungen waren bei endotoxinfreien Clear coli-OMVs und mit Polymyxin behandelten OMVs weniger ausgeprägt. Die LPS-Stimulation konnte diesen antiviralen Status nicht nachahmen, während TRIF-Knockout ihn aufhob. Wichtig ist, dass Überstände von OMV-behandelten Makrophagen eine antivirale Reaktion in Alveolarepithelzellen (AEC) induzierten, was auf eine OMV-induzierte interzelluläre Kommunikation schließen lässt. Abschließend wurden die Ergebnisse in einem Ex-vivo-Infektionsmodell mit primärem menschlichem Lungengewebe validiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Klebsiella-, E. coli- und Salmonella-OMVs über TLR4-TRIF-Signalisierung eine antivirale Immunität in Makrophagen induzieren, um die Virusreplikation in Makrophagen, AECs und Lungengewebe zu reduzieren. Diese gramnegativen Bakterien induzieren durch OMVs eine antivirale Immunität in der Lunge, mit möglicherweise entscheidendem und enormem Einfluss auf die Ergebnisse bakterieller und viraler Koinfektionen.

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Schlüsselwörter

Extrazelluläre Vesikel, Vesikel der äußeren Membran, bakterielle und virale Koinfektion, Lungenentzündung, Makrophage, Alveolarepithelzelle, antivirale angeborene Immunität

Einführung

Äußere Membranvesikel (OMVs) werden auf natürliche Weise von gramnegativen Bakterien freigesetzt und haben einen Durchmesser von bis zu 300 nm. Grampositive Bakterien sind ebenfalls in der Lage, Membranvesikel (MVs) freizusetzen. Aufgrund ihrer Biogenese enthalten diese Lipiddoppelschichtmembranstrukturen neben periplasmatischen Inhalten auch Hauptbestandteile der bakteriellen (äußeren) Membran wie Lipide, Proteine ​​und im Fall gramnegativer Bakterien Lipopolysaccharide (LPS). [1]. Zusätzlich zu ihrer Rolle in der bakteriellen Kommunikation wurden OMVs mit pathogenen Wirkungen und dem Transport von Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht, z. B. VacA von Helicobacter pylori, Shiga-Toxin von Shigella dysenteriae oder ClyA von enterohämorrhagischen Escherichia coli [2]. Es wurde gezeigt, dass diese OMVs Epithelzell- und Immunantworten manipulieren. Das Vorhandensein von bakteriellem Endotoxin auf der OMV-Oberfläche zusammen mit anderen transportierten pathogen-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs) macht sie zu wirksamen Stimulatoren für Immunzellen, da sie immer noch von ihren jeweiligen Rezeptoren erkannt werden können [3]. Die Aktivierung von Tolllike-Rezeptoren (TLRs) und Nod-like-Rezeptoren in angeborenen Immunzellen kann die Freisetzung entzündungsfördernder und immunregulatorischer Zytokine auslösen, einschließlich der Rekrutierung von Neutrophilen oder der Störung enger Verbindungen in Epithelzellschichten [4]. Ein wichtiger residenter Immunzelltyp in der Lunge sind Alveolarmakrophagen (AMs), die sich an der Luft-Gewebe-Grenzfläche in den Alveolen befinden. Durch die Aufnahme inhalierter Partikel stellen AMs durch Phagozytose und Abbau die erste Verteidigungslinie gegen Mikroorganismen und Partikel dar. Bei der Begegnung mit Krankheitserregern präsentieren Makrophagen den adaptiven Immunzellen Antigene und setzen entzündungsfördernde Zytokine frei. Dadurch können sie auf Alveolarepithelzellen (AECs) vom Typ I und II und andere Immunzellen einwirken (Zusatzdatei 1: Abb. S1A). AMs können durch mehrere PAMPs aktiviert werden, um intrazelluläre Signale und die Induktion unterschiedlicher Genexpressionsmuster über verschiedene Immunrezeptoren zu induzieren (5, 6), was zu MyD88- oder TRIF-Signalen führt, die wiederum unterschiedliche Untergruppen von Genen induzieren (Zusatzdatei 1). : Abb. S1B). Darüber hinaus erfüllen sie weitere Funktionen in der Lungenhomöostase und Pathogenese, was sie zu einem zentralen Signalknoten und Orchestrator der Lungenimmunität macht. Influenzaviren gehören zur Familie der Orthomyxoviridae und verursachen leichte bis schwere Infektionen der oberen und unteren Atemwege. Während die meisten saisonalen Influenzavirus-Infektionen selbstlimitierend verlaufen, entwickeln einige Patienten eine Lungenentzündung und ein akutes Atemnotsyndrom, was schätzungsweise zu bis zu 650 000 jährlichen Todesfällen weltweit führt [7]. Das Influenza-A-Virus (IAV) infiziert hauptsächlich Epithelzellen der Atemwege und vermehrt sich darin. Die Virusinfektion führt zur Aktivierung und Signalübertragung des Mustererkennungsrezeptors (PRR) über mehrere Transkriptionsfaktoren, nämlich den Kernfaktor Kappa B (NF-κB) und den Interferon-Regulierungsfaktor (IRF)-3/7, die Typ I und III induzieren Produktion von Interferonen (IFN). Diese ausgeprägte IFN-Reaktion induziert folglich auf auto- und parakrine Weise einen zellulären „antiviralen Zustand“ [8]. Darüber hinaus werden bei einer Infektion mehrere andere Zytokine und Chemokine ausgeschüttet. Dieses streng regulierte Zytokinnetzwerk der Wirtsabwehr rekrutiert Immunzellpopulationen an den Infektionsort und orchestriert angeborene und adaptive Immunantworten [9]. Allerdings kann IAV auch AMs infizieren, was bei einer akuten Infektion zu einer drastisch reduzierten Anzahl von AMs führt, die zur Beseitigung der Infektion wiederhergestellt werden müssen. Die Aktivierung angeborener Immunzellen und die Sekretion entzündungsfördernder Zytokine führen zur Rekrutierung zusätzlicher angeborener Zellen, kontrollieren die Infektion und initialisieren die Gewebereparatur [10, 11]. Hier analysieren wir die Reaktion von Makrophagen auf bakterielle extrazelluläre Vesikel und ihren Einfluss auf die nachfolgende IAV-Infektion.

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Material und Methoden

Chemikalien und Antikörper

Das F12-Medium von Ham wurde von GE Healthcare Europe (Freiburg, Deutschland) bezogen. RPMI-1640, DMEM, GlutaMAX, Penicillin/Streptomycin und FCS wurden von Life Technologies (Darmstadt, Deutschland) bezogen. PBS wurde von der Capricorn Scientific GmbH (Ebsdorfergrund, Deutschland) übernommen. Opti-MEM wurde von Thermo Fisher Scientific (Frankfurt, Deutschland) bezogen. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) wurde von Sigma-Aldrich Chemie (München, Deutschland) geliefert. LPS (Salmonella Minnesota R595, TLR-Qualität) wurde von Enzo Life Sciences (Lausen, Schweiz) bezogen. Pam3CSK4 wurde von Invivogen (San Diego, USA) gekauft. Der JAK-Inhibitor Ruxolitinib wurde von der Biozol Diagnostics Vertrieb GmbH (Eching, Deutschland) bezogen. Polymyxin B wurde von Merck Millipore (Billerica, USA) bezogen. Antikörper wurden von Abcam (Cambridge, UK) erhalten: Mx1 (ab95926), Influenza-Nukleoprotein (9G8); Zellsignalisierung (Cambridge, UK): Phospho-IRF-3 (Ser396)(4D4G), Phospho-TBK-1 (Ser172)(D52C2), TBK-1 (61223S), Phospho- STAT1 (Tyr)(58D6), STAT1 (D1K9Y), Maus-Anti-Kaninchen (L27A9), IRAK-1 (4359S), Phospho-p38 (Tr180/Tyr182)(9211S), p38 (9212S); Thermo Fisher Scientific: Ziegen-Anti-Maus (Alexa für 488); ProteinTech: Anti-IRF-3 (66670-1) oder Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg, Deutschland): -Actin (C4), Anti-Maus (mIgGκBPHRP, sc-516102). Alle anderen verwendeten Chemikalien hatten analytische Qualität und wurden aus kommerziellen Quellen bezogen.

Bakterienkultur und OMV/MV-Präparation

Der Wildtyp des L. pneumophila-Stammes Corby wurde wie zuvor beschrieben gehandhabt [12]. K. pneumoniae (#700721/ MGH78578), E. coli (#25922) und S. enterica Serovar Typhimurium (#14028) wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) bezogen. ClearColi™ BL21 stammte von der BioCat GmbH (Heidelberg, Deutschland). S. pneumoniae D39 Δcps wurden freundlicherweise von Sven Hammerschmidt zur Verfügung gestellt. Bakterien wurden über Nacht auf Agarplatten gezüchtet (MacConkey: Kp, Ec, Sal; LB: Clear coli; Blutagarplatten: Sp) und dann zum Beimpfen von flüssigen Medien (LB: Kp, Ec, Sal, Clear coli; THY: Sp) verwendet. . Die Bakterien wurden bis zur späten logarithmischen Phase bei 37 Grad unter ständigem Schütteln gezüchtet (MaxQ 6000, Thermo Fisher Scientific, Karlsruhe, Deutschland; außer Sp). Anschließend wurden die Bakterienkulturen dreimal zentrifugiert (4.500 × g, 15 Min., 4 Grad; Multifuge X3R, Thermo Fisher Scientific). Die verbleibenden Bakterien wurden durch Sterilfiltration durch Poren von 0,22 µm entfernt. Der Überstand wurde mit 100-kDa-Molekulargewichts-Cut-Off-Filtern (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) konzentriert und die Vesikel entweder durch Ultrazentrifugation oder durch Größenausschlusschromatographie (SEC) gereinigt. Für die Ultrazentrifugation wurde der Überstand bei 100.000 × g, 3 Stunden, 4 Grad ultrazentrifugiert. Nach dem Waschen des erhaltenen OMV/MV-Pellets mit sterilem PBS wurde die Ultrazentrifugation wiederholt und das Vesikelpellet in sterilem PBS gelöst. Der Proteingehalt wurde mit dem Pierce BCA Protein Assay Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) bestimmt und gleiche Proteinmengen wurden für Stimulationsexperimente verwendet. Für die SEC wurde der Überstand auf 500 µL konzentriert und auf Original-/70-nm-Gen-2-Säulen (IZON Science LTD, Lyon, Frankreich) geladen, die gemäß dem Protokoll des Herstellers mit 10 ml PBS vorgewaschen wurden. Vesikel wurden mit sterilem PBS eluiert und Fraktionen von 500 µL gesammelt. Vesikel wurden in den Fraktionen 7–12 eluiert, was durch Nanodurchflusszytometrie (nFCM; NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK) bestimmt wurde. Die gepoolten vesikelhaltigen Fraktionen wurden unter Verwendung von Molekulargewichts-Cut-Off-Filtern (Merck KGaA) auf 200–400 µL konzentriert. Die Vesikelkonzentration aller Präparate wurde mittels nFCM bestimmt und gleiche Mengen an Vesikel wurden für Stimulationsexperimente verwendet. Die OMV/MV-Zubereitung beider Reinigungsmethoden wurde durch Ausplattieren und Lagern in Aliquots bei -20 Grad auf kontaminierende Bakterien überprüft.

NFC

Für nFCM wurde ein Nanoanalysator (NanoFCM Co., Ltd, Nottingham, UK), ausgestattet mit einem 488-nm-Laser, mit 200 nm großen Polystyrolkügelchen (NanoFCM Co.) mit einer definierten Konzentration kalibriert 2,08×10^8 Partikel/ml und wird auch als Referenz für die Partikelkonzentration verwendet. Darüber hinaus wurden monodisperse Silicakügelchen (NanoFCM Co.) in vier verschiedenen Größen als Größenreferenzstandard zur Kalibrierung der Vesikelgröße verwendet. Frisch gefiltertes (0,1 µm) 1×PBS wurde als Hintergrundsignal analysiert und von den anderen Messungen abgezogen. Jedes Verteilungshistogramm oder Punktdiagramm wurde aus Daten abgeleitet, die eine Minute lang bei einem Probendruck von 1 kPa gesammelt wurden. OMV-Proben wurden mit gefiltertem (0,1 µm) 1×PBS verdünnt, was zu Partikelzahlen im optimalen Bereich von 2.500–12,000 Ereignissen führte. Partikelkonzentration und Größenverteilung wurden mit der nFCM-Software (NF Profession V1.08) berechnet.

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

Kohlenstoffbeschichtete Kupfergitter (400 Mesh) wurden durch Glimmentladung hydrophilisiert (PELCO easiGlow, Ted Pella, USA). Fünf µL Proben wurden auf die hydrophilisierten Gitter aufgetragen und nach einem kurzen Waschschritt mit doppelt destilliertem Wasser mit 2 % (Gew./Vol.) Uranylacetat angefärbt. Die Proben wurden mit einem JEOL JEM-2100-Transmissionselektronenmikroskop unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung von 120 kV analysiert. Die Bilder wurden mit einer F214 FastScan CCD-Kamera (TVIPS, Gauting, Deutschland) aufgenommen.

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Zellkultur

Menschliche Zelllinien (THP-1, A549, BEAS2B, Calu-3, HCC827) wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Madin-Darby Canine Kidney II-Zellen (MDCK II) wurden von ECACC-Sigma-Aldrich (Darmstadt, Deutschland) bezogen. THP-1 Dual™ (Dual) und THP-1 Dual™ TRIF-KO (TRIF−/−) Zellen wurden von Invivogen Europe (Toulouse, Frankreich) erworben. Die Zellen wurden in Ham's F12, DMEM oder RPMI-1640, ergänzt mit 1 mM Natriumpyruvat, 2 mM Glutamin sowie 10 % hitzeinaktiviertem FCS, unter Zellkulturbedingungen kultiviert. THP-1 Dual™-Zellen wurden in RPMI-1640, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin, 2 mM Glutamin, 10 % hitzeinaktiviertem FCS, 100 µg/ml Normocin™ und 25 mM HEPES-Puffer, kultiviert. THP-1-, Dual- und TRIF-/--Zellen wurden durch Zugabe von 20 nM PMA für 24 Stunden in makrophagenähnliche Zellen differenziert.

Klonierung von Mx1 in den SparQ-Vektor

Die kodierende Sequenz von Mx1 wurde aus THP-1-cDNA durch Phusion PCR unter Verwendung von Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (New England Biolabs, Ipswich, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers generiert. Ein HAtag wurde hinzugefügt, indem die HA-Kodierungssequenz mit dem Reverse-Primer fusioniert wurde (Sense: 5'-atcggaTTCGAAATGGTTGTT TCCGAAGTGGAC-3′, Antisense: 5'-tccgatGCGGCC GCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAA CCGGGGAACTGGGCAAG-3′). Das PCR-Fragment sowie der SparQ-Vektor (Addgene, Watertown, USA) wurden mit den Restriktionsenzymen BstbI und NotI (Thermo Fisher Scientific) verdaut und mit T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in den SparQ-Vektor ligiert.

Transfektion von HEK293T-Zellen und Lentivirus-Produktion

HEK293T-Zellen wurden mit dem in Opti-MEM verdünnten SparQ-Vektor, der die Sequenz für Mx1 und eine GFP-Sequenz enthielt, dem viralen Verpackungsvektor psPAX2 und dem Hüllplasmid pVSV-G (Addgene) mit Lipofectamine 2000 (Thermo) transfiziert Fisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers. Lentivirus wurde produziert und virushaltiger Überstand wurde 72 Stunden lang täglich gesammelt. Der Überstand wurde mit einem 0,45-µm-Filter filtriert und THP-1-Zellen wurden transduziert (siehe unten). Für die Transduktion von Zellen wurde ein leerer SparQ-Vektor ohne Mx1-Sequenz verwendet, um eine entsprechende Kontrollzelllinie (VC=-Vektorkontrolle) zu erzeugen.

Transduktion von THP‑1-Zellen

THP-1-Zellen wurden mit dem Lentivirus aus dem gefilterten Überstand der HEK293T-Zellkultur transduziert (siehe oben). Polybrene (4 µg/ml, Sigma-Aldrich) wurde hinzugefügt, um die Transduktionswirksamkeit zu verbessern. Die Zellen wurden bis zu sechs Tage lang inkubiert. GFP-positive Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie sortiert.

Isolierung und Differenzierung von BDMs

Menschliche Monozyten von gesunden Spendern wurden durch magnetische CD14-positive Selektion aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes isoliert und in Gegenwart von 1 % menschlichem AB-Serum in blutabgeleitete Makrophagen (BDM) differenziert, wie zuvor beschrieben [13].

OMV/MV-Stimulation von Makrophagen

Primäre menschliche Makrophagen oder differenzierte THP-1-Zellen wurden mit gereinigten OMVs/MVs inkubiert (jeweils 1 µg/ml für Vesikel, die durch Ultrazentrifugation gereinigt wurden, und einer Vesikelvielfalt (MOV) von 1,000 für SEC-gereinigte). Vesikel) für bis zu 20 Stunden in Komplettmedien. Eine zusätzliche Inhibitoranwendung erfolgte 1 Stunde vor der Vesikelbehandlung. Te-stimulierte Makrophagen wurden entweder zur Protein- oder RNA-Isolierung oder für nachfolgende Infektionsexperimente verwendet. Der erhaltene zytokinhaltige Überstand wurde für die ELISA- oder LDH-Analyse verwendet oder steril filtriert und zur Stimulation der Epithelzellen verwendet.

Virusreinigung und Virustitration

Die Virusreinigung und Virustitration wurden in MDCK II-Zellen wie zuvor beschrieben durchgeführt [14]. Der Virustiter wurde durch Plaque-Assay wie zuvor beschrieben bestimmt [15]. Kurz gesagt, konfluente MDCK II-Zellen wurden mit einem seriell verdünnten Virus- oder Gewebeüberstand (in einem MDCK II-Kulturmedium ohne FCS) infiziert. Man ließ das Virus 1 Stunde lang bei 37 Grad an die Zellen adsorbieren. Zehntens wurde das Inokulum durch frisches Medium ersetzt (ergänzt mit 1 ug/ml TPCK-behandeltem Trypsin (für IAV) und 1 % Avicel® PH-101 (Sigma-Aldrich)). MDCK II-Zellen wurden mit Kristallviolett gefärbt oder virusinfizierte Zellen wurden mit primärem Antikörper (1:2, 000) (Maus-Anti-Influenza-A-Nukleoprotein, MCA400, Bio-Rad, Deutschland) und dem sekundären Antikörper ( 1:4,000) (Goat Anti-Mouse IgGHRP, 170–6516, Bio-Rad, Deutschland) für den Plaque-Assay. Die Plaques wurden manuell gezählt und als Plaque-bildende Einheiten (pfu) pro ml ausgedrückt.

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Virusinfektion

Nach 20-stündiger Vorstimulation mit Bakterienvesikeln oder zytokinhaltigem Überstand wurden die Zellen mit IAV oder dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) infiziert. Makrophagen wurden mit H1N1 (A/WSN/33) oder VSV infiziert, während Epithelzellen mit H1N1 (A/Hamburg/2009/PDM) infiziert wurden, jeweils in frischen Medien ohne FCS. Nach einer Stunde Inokulation wurde das freie Virus entfernt und das Medium durch TPCK-Trypsin-haltiges Medium für IAV oder leeres Medium für VSV ersetzt. Die Zellen wurden bis zu 48 Stunden lang inkubiert, um eine multizyklische Replikation zu ermöglichen.

Vorbereitung von menschlichem PCLS

Lungengewebe wurde von Patienten gewonnen, die sich einer Lungenlappenresektion aufgrund von Lungenkrebs an der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH, Hannover, Deutschland) unterzogen hatten. Für die Experimente wurde ausschließlich Gewebe aus makroskopisch und mikroskopisch krankheitsfreien Teilen der Lunge verwendet. Menschliche präzisionsgeschnittene Lungenschnitte (PCLS) wurden wie zuvor beschrieben hergestellt [16]. Zwei Gewebeschnitte pro Vertiefung wurden in einer 24--Wellplatte unter Tauchbedingungen (DMEM/F12 ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C und 5 % CO2 über Nacht kultiviert.

IAV-Infektion von PCLS

PCLS wurden mit 1 µg/ml OMVs, gereinigt aus L. pneumophila oder K. pneumoniae, verdünnt in DMEM/F12, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin, bei 37 Grad, 5 % CO2 für 2{19}} Stunden stimuliert. Das Medium wurde entfernt und PCLS wurden mit 25,000 pfu/Well in 250 µL Influenzavirus A/California/04/2009(H1N1pdm) beimpft. PCLS wurden bei 35 Grad inkubiert und während der Inokulation alle 15 Minuten geschüttelt, um eine homogene Virusinfektion zu ermöglichen. Anschließend wurde das Inokulum verworfen und durch DMEM/F12, ergänzt mit 1 % Penicillin/Streptomycin, ersetzt. Nach 48-stündiger Inkubation wurde der Überstand zum Virusnachweis, zur LDH-Freisetzung und zur Zytokinquantifizierung gesammelt. Proben für die Zytokinmessungen wurden mit einem 0,2 %igen Proteaseinhibitor-Cocktail (P1860, Sigma-Aldrich, München, Deutschland) ergänzt und bis zur Analyse bei 80 Grad gelagert. PCLS wurden eingefroren und bis zur RNA-Reinigung wie zuvor beschrieben bei 80 Grad gelagert [17].

LDH

Der LDH-Freisetzungstest wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung des Pierce™ LDH Cytotoxicity Assay Kit von Roche (Mannheim, Deutschland) oder des Cytotoxicity Detection KitPLUS (LDH) (Roche, Merck) durchgeführt. Die Absorption wurde mit einem Mikroplattenlesegerät Infinity F200Pro (Tecan, Männedorf, Schweiz) gemessen.

ELISA

Die Zytokine CXCL8/IL-8, CXCL10/IP-10 und IL-1 wurden aus zellfreiem Überstand mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) nach Angaben des Herstellers quantifiziert Anweisungen.

QUANTI-blue™-Assay

Zur Bestimmung der Reporteraktivität von SEAP im Zellkulturüberstand von THP-1 Dual™ und entsprechenden TRIF-/−-Zellen wurde der QUANTI-Blue™-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, der Zellkulturüberstand wurde nach Stimulation der Zellen mit OMVs gesammelt. Zunächst wurden die QUANTI-Blue™-Lösung und der Zellkulturüberstand in eine 96-Well-Platte mit dickem Boden gegeben. Nach 150-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die optische Dichte bei 630 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät Infinity F200Pro bestimmt.

QUANTI-luc™-Assay

Um die Reporteraktivität von Lucia-Luciferase im Zellkulturüberstand von THP{{0}} Dual™ und entsprechenden TRIF-/−-Zellen zu bestimmen, wurde der QUANTI-Luc™-Assay gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, der Zellkulturüberstand wurde in eine weiße Wellplatte mit Fettboden (BRAND GmbH & Co. KG, Wertheim, Deutschland) verteilt. Die QUANTI-Luc™-Assaylösung wurde hinzugefügt und die Lumineszenzmessung wurde sofort mit einer Lesezeit von 0,1 s in einem Mikroplatten-Lesegerät Infinity F200Pro durchgeführt.

westlicher Fleck

Zur Bestimmung der Proteinexpression oder Phosphorylierung wurde Western Blot wie zuvor beschrieben durchgeführt (18).

RNA-Vorbereitung und Echtzeit-PCR

Zur Genexpressionsanalyse wurde die RNA-Isolierung durch Phenol-Chloroform-Extraktion durchgeführt und wie zuvor beschrieben revers transkribiert [12]. Anschließend wurde eine quantitative Echtzeit-PCR in einem ViiA7 (Thermo Fisher Scientific) mit Luna Universal qPCR Master Mix (New England BioLabs) und spezifischen Primerpaaren durchgeführt. Mithilfe der 2−ΔΔCT-Methode [19] wurde die x-fache Induktion berechnet und die Ergebnisse auf entsprechende Kontrollzellen normiert. 18S: vorwärts: 5′-GACTCTTTCGAGGCCCTGTA-3′, rev: 5′-CACCAGACTTGCCCTCCAAT-3′ CXCL8: vorwärts: 5′-ACTGAGAGTGATTGAGAG TGGAC-3′, rev: 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTC{ {20}}′ IFI44: vorwärts: 5′-TATCCAGACAGAGCAGCTACC-3′, rev: 5′-ATAGAGAAGGCTAAGCCGCTTC-3′ IFIT1: vorwärts: 5′-ATGCAGGAAGAACATGACAACC-3′, rev: 5 ′-TCTGGACACTCCATTCTATAGCG-3′ IFNA1: vorwärts: 5′-ACAGGAGGACCTTGATGCTC-3′, rev: 5′-TCTGCTGGATCAGCTCATGG-3′ IFNB: vorwärts: 5′-AACATGACCAACAAGTGTCTCC-3′ , rev: 5′-TGTCCTTGAGGCAGTATTCAAG-3′ IL1B: vorwärts: 5′-AGCTCGCCAGTGAAATGATGG-3′, rev: 5′-CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTC-3′ IL12B: vorwärts: 5′-GCCCAGAGCAAGATGTGTCA{{ 58}}′, rev: 5′-CACCATTTCTCCAGGGGCAT-3′ Mx1: vorwärts: 5′-GGGCTTTGGAATTCTGTGGC-3′, rev: 5′-CCTTGGAATGGTGGCTGGAT-3′ NP: vorwärts: 5' -GAAATTTCAAACAGCTGCACAAAG -3′, rev: 5′-AATATGAGTGCAGACCGTGC-3′

Immunfluoreszenz

THP{{0}}-Zellen wurden auf Deckgläsern durch Zugabe von 20 nM PMA differenziert und mit OMVs/MVs für 20 h inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 4 Stunden lang mit H1N1 (A/WSN/33; Infektionsmultiplizität (MOI) 0,1) infiziert. Nach 15-minütiger Fixierung mit 3 % Paraformaldehyd wurden die Objektträger dreimal mit PBS gewaschen und mit 0,2 % Triton X-100 in TBS permeabilisiert (10 Minuten, Raumtemperatur). Nach der Blockierung (1 % BSA in TBS/0,2 % Triton X-100) wurden die Zellen mit -NP-Antikörper (1:250, in Blockierungslösung) inkubiert. Der sekundäre Antikörper (1:1000) wurde zusammen mit DAPI (1:2000) 1 Stunde lang im Dunkeln inkubiert. Aufgezogene Deckgläser wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop (AxioVision, Zeiss, Jena, Deutschland) analysiert.

Ethische Aussage

Experimente mit menschlichen Lungengewebeschnitten wurden von der Ethikkommission der Medizinischen Hochschule Hannover (MHH, Hannover, Deutschland) genehmigt und entsprechen dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Nummer 2701–2015). Alle Patienten oder ihre nächsten Angehörigen gaben eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung von Lungengewebe für Forschungszwecke ab. Alle Blutspender gaben eine informierte schriftliche Einwilligung (Ethik-Genehmigungsnummer: 161/17).

Abb. 1 Charakterisierung von Bakterienvesikeln und Reaktion in menschlichen Makrophagen. A Trennung bakterieller extrazellulärer Vesikel von freien Proteinen mittels Größenausschlusschromatographie aus verschiedenen Bakterienüberständen (Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Sal) und Streptococcus pneumoniae (Sp) ). Die Vesikelkonzentration in jeder Fraktion wurde durch Nanodurchflusszytometrie (nFCM) bestimmt und die Proteine ​​wurden durch BCA quantifiziert. B Vesikelgrößenverteilungen gereinigter OMVs/MVs wurden durch NFC bestimmt. C-TEM-Bilder von gereinigten OMVs/MVs. Maßstabsleiste=50 nm. D–G-BDMs wurden mit OMVs/MVs (jeweils 1 µg/ml) aus verschiedenen Bakterien stimuliert oder zur Kontrolle bis zu 48 Stunden lang unbehandelt gelassen. Die Freisetzung von D CXCL8 wurde durch ELISA bestimmt und ist in ng/ml angegeben. Die Expression von IL1B (E) und IL12B (F) wurde durch qPCR bestimmt, die Ergebnisse sind auf RPS18 normalisiert und relativ zu unbehandelten Kontrollzellen dargestellt. G Nach einstündiger Inkubation mit Bakterienvesikeln wurden Expression und Phosphorylierung von IRAK-1, p38 und TBK-1 mittels Western Blot bestimmt. Es werden repräsentative Ergebnisse von vier biologisch unabhängigen Replikaten angezeigt. Die Balken stellen Mittelwerte+SEM aus drei (B) bis vier (D–F) unabhängigen Experimenten dar. Statistik: 2-way ANOVA (DF); *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; ns=not significant; n=3–4

Statistiken

Die Daten werden als Mittelwerte+SEM für mindestens drei biologisch unabhängige Experimente angezeigt. Es wurde Prism 6.07 (GraphPad, La Jolla, USA) verwendet. Die ein- oder zweifachen ANOVA-Tests wurden für ungepaarte Proben durchgeführt. P-Werte kleiner oder gleich 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Sofern nicht anders angegeben, wurden die Tests im Vergleich zur entsprechenden Kontrolle (*) durchgeführt.

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem Artikel und der Zusatzdatei enthalten.

Ergebnisse

Pro‑inflammatorische Aktivierung von Makrophagen durch OMVs/MVs

Um die angeborene Immunantwort menschlicher primärer Blutmakrophagen (BDM) auf OMVs/MVs verschiedener Bakterien zu testen, wurden Vesikel von Legionella pneumophila (Lp), Klebsiella pneumoniae (Kp), Escherichia coli (Ec), Salmonella enterica Serovar Typhimurium (Sal ) und Streptococcus pneumoniae (Sp) wurden mittels Größenausschlusschromatographie (SEC) isoliert. Die Fraktionen wurden mittels Nano-Durchflusszytometrie (nFCM) auf die Anzahl der Vesikel und mittels BCA auf das Vorhandensein von Proteinen analysiert (Abb. 1A). Vesikel aus den Fraktionen 7–12 wurden gepoolt und für Experimente verwendet. OMVs/MVs hatten ein vergleichbares Größenverteilungsprofil (Abb. 1B), unterschieden sich nicht in der durchschnittlichen Größe (Zusatzdatei 1: Abb. S2A), waren gleich konzentriert (Zusatzdatei 1: Abb. S2B) und wurden durch Transmissionselektronen sichtbar gemacht Mikroskopie (TEM; Abb. 1C). BDMs wurden bis zu 48 Stunden lang mit OMVs/MVs stimuliert, was gleichen Vesikelkonzentrationen der verschiedenen Bakterien entspricht (Zusatzdatei 1: Abb. S2C). Die Inkubation von BDMs mit Vesikeln war nicht zytotoxisch (Zusatzdatei 1: Abb. S2D). OMVs/MVs induzierten weitgehend die CXCL8-Expression und -Freisetzung aus Makrophagen (Zusatzdatei 1: Abb. S3A und 1D), während die IL1B- und IL12B-mRNA-Induktion zeit- und speziesabhängig war (Abb. 1E + F). Die Freisetzung von IL-1 hing von der Spezies ab, aus der die Bakterienvesikel isoliert wurden (Zusatzdatei 1: Abb. S3B). Obwohl die Phosphorylierung von p38 bei BDMs nach einstündiger Vesikelinkubation vergleichbar war, induzierten nur OMVs aus gramnegativen Bakterien den Abbau von IRAK-1 und die Phosphorylierung von TBK-1, nicht jedoch MVs aus grampositiven Bakterien (Abb . 1G und Zusatzdatei 1: S4A-D).

Abb. 2 Bakterielle extrazelluläre Vesikel aktivieren die Typ-I-Interferon-Reaktion in BDMs. BDMs wurden mit OMVs/MVs (jeweils 1 µg/ml) aus verschiedenen Bakterien stimuliert oder als Kontrolle unbehandelt gelassen. Eine Phosphorylierung und Expression von IRF-3 wurde nach 1 Stunde OMV/MV-Inkubation durch Western Blot bestimmt. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse von drei biologisch unabhängigen Replikaten. Die Expression von IFNA1 (B), IFNB (C), IFIT1 (E) und IFI44 (F) wurde mittels qPCR gemessen, die Ergebnisse sind auf RPS18 normalisiert und relativ zu unbehandelten Kontrollzellen dargestellt. D Die Phosphorylierung von STAT1 wurde durch Western Blot nach 2 Stunden OMV/MV-Stimulation bestimmt. Dargestellt ist das repräsentative Ergebnis von vier biologisch unabhängigen Replikaten. G Die Phosphorylierung von STAT1 und die Expression von Mx1 wurden durch Western Blot nach 20 Stunden bakterieller Vesikelstimulation bestimmt. Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse von vier biologisch unabhängigen Replikaten. Balken stellen Mittelwerte + SEM aus vier unabhängigen Experimenten dar. Statistik: 2-way ANOVA; *P<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=4

Neben der Aktivierung von NF-κB und AP-1 und ihren nachgeschalteten Zielen kann die PRR-Signalisierung zur Aktivierung von IRFs führen. Somit wurde die Phosphorylierung von IRF-3 bestimmt. Kp/Ec/SalOMVs erhöhten die Phosphorylierung von IRF-3 in BDMs (Abb. 2A), was zur Expression von IFN I (Abb. 2B+C) und nachgeschalteter Phosphorylierung von STAT1 (Abb. 2D und Zusatzdatei 1) führte: S4E) und Induktion von Interferon-stimulierten Genen (ISGs; IFIT1, IFI44 und Mx1; Abb. 2E-G). Da Phosphorylierungsereignisse typischerweise nur von kurzer Dauer sind und bekanntermaßen eine entscheidende Rolle beim Ein- und Ausschalten von Immunsignalkaskaden spielen, wurde die Phosphorylierung von STAT1 auch 20 Stunden nach der Zugabe von Kp/Ec/SalOMVs untersucht (Abb. 2G und Zusatzdatei 1: S4F+G). Die Experimente zeigten, dass OMVs nicht nur entzündungsfördernde Signale in Makrophagen aktivieren, sondern auch antivirale Signale induzieren.

Die Vorinkubation von OMV verändert die IAV-Replikation in Makrophagen

Mx1 ist ein bekannter antiviraler Faktor, der die IAV-Replikation hemmt [20] und bei der Behandlung von Makrophagen mit Kp/Ec/SalOMV exprimiert wurde. Wir stellten daher die Hypothese auf, dass eine OMV-Vorbehandlung die Virusreplikation verändert. IAV-Infektionsexperimente wurden in THP-1-Zellen durchgeführt, die nach Kp/Ec/SalOMV-Behandlung auf mRNA- und Proteinebene ähnliche Mengen an Mx1 exprimieren (Zusatzdatei 1: Abb. S5A+B) und die Phosphorylierung von STAT1 induzieren , während das gesamte STAT1-Protein stabil bleibt (Zusatzdatei 1: Abb. S5C), mit einem H1N1-Stamm (A/WSN/33), der Makrophagen infiziert und repliziert [21]. Die Vorstimulation von THP-1-Zellen mit LpOMV/SpMV erhöhte die IAV-Replikation 24 Stunden nach der Infektion (pi) im Vergleich zur infizierten Kontrolle (–-), wohingegen eine Vorbehandlung mit Mx1--induzierenden OMVs (Kp /Ec/Sal) blockierte die IAV-Replikation (Abb. 3A). Während die Vorbehandlung mit dem TLR2/1-Agonisten Pam3CSK4 den mit LpOMV/SpMV beobachteten Effekt nachahmen konnte, von denen bekannt ist, dass sie über TLR2/1 signalisieren [12, 22, 23], reproduzierte lösliches LPS als TLR4-Agonist das Kp/Ec nicht /SalOMV-Effekt (Zusatzdatei 1: Abb. S5D). Unterschiede in der IAV-Belastung nach der Vorbehandlung konnten auch durch Immunfluoreszenzfärbung gegen das virale Nukleoprotein (NP) beobachtet werden (Abb. 3B). Die Vorbehandlung mit Kp/Ec/SalOMV blockierte die IAV-Replikation und der NP-positive Bereich wurde signifikant reduziert (Abb. 3C). Dies konnte nach LpOMV/SpMV-Vorbehandlung nicht beobachtet werden. Um zu untersuchen, ob die Mx1-Induktion für die beobachtete blockierte IAV-Replikation ausreicht, wurde Mx1 in THP-1-Makrophagen stabil überexprimiert (Geschlecht), um die OMV-Vorstimulation nachzuahmen (Zusatzdatei 1: Abb. S5E). Die IAV-Infektion von Mx1oex-Zellen führte zu einer Verringerung des immunfluoreszierenden NP-positiven Bereichs 4 h pi (Abb. 3D) und zu einer verringerten Virusreplikation 6 h pi im Vergleich zu einer leeren Vektorkontrolle (VC) (Abb. 3E), wenn auch in geringerem Maße Ausmaß im Vergleich zur OMV-Vorstimulation (Abb. 3A). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Kp/Ec/SalOMV Makrophagen auf klassische proinflammatorische Weise aktivierte und antivirale Gene induzierte, was zur Aktivierung des IFN-/Rezeptors (IFNAR), zur nachgeschalteten Phosphorylierung von STAT1 und zur Expression von Mx1 führte, was die IAV-Replikation direkt beeinträchtigen kann ( Abb. 4A). Um die Bedeutung der JAK/STAT-Signalübertragung für die beobachtete Induktion einer antiviralen Reaktion zu bestätigen, wurde vor der Vesikelstimulation ein JAK-Inhibitor (JAKi) angewendet. Die JAK-Hemmung veränderte die Kp/SalOMV-induzierte CXCL8-Expression nicht (Abb. 4B), reduzierte jedoch Mx1 auf mRNA- (Abb. 4C) und Proteinebene signifikant, selbst bei IAV-Infektion (Abb. 4D und Zusatzdatei 1: S6A). Dementsprechend kehrte JAKi die durch OMV induzierte Virusreplikationsblockade um (Abb. 4E).

Abb. 3 Mx1--induzierende OMVs blockieren die Replikation des Influenza-A-Virus in THP-1-Zellen. Eine Replikation des Influenza-A-Virus in differenzierten THP-1-Zellen. Die Zellen wurden entweder mit OMVs/MVs (jeweils 1 µg/ml) vorbehandelt oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen (–). Nach 20 Stunden Vorbehandlung wurden die Zellen 24 und 48 Stunden lang mit A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.001) infiziert. Die IAV-Replikation wurde durch qPCR gegen auf 18S normalisiertes IAV-NP bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM von drei bis fünf unabhängigen Experimenten. B Differenzierte THP-1-Zellen wurden mit OMVs/MVs (jeweils 1 µg/ml) vorbehandelt oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen (–). Nach 20-stündiger Vorinkubation wurden die Zellen 4 Stunden lang mit A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) infiziert. Nach der Fixierung wurden die Zellen mit einem -influenza NP-Antikörper (gelb) und DAPI (blau) gefärbt. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis aus vier biologisch unabhängigen Experimenten. C Quantifizierung des NP-positiven (NP+) Bereichs aus (B). Balken stellen Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten + SEM dar. D THP-1-Zellen, die Mx1 (Mx1oex) stabil überexprimieren, und leere Vektorkontrollzellen (VC) wurden 4 Stunden lang mit dem Influenzavirus A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,1) infiziert. Nach Fixierung und Immunfluoreszenzfärbung mit Influenza-NP wurde der NP+-Bereich quantifiziert und im Verhältnis zu VC-Zellen dargestellt. Balken zeigen Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten + SEM. E Mx1oex- und VC-Zellen wurden 6 Stunden lang mit A/WSN/33(H1N1) (MOI 0,001) infiziert. Die Virusreplikation wurde durch einen Plaque-Assay bestimmt und die Ergebnisse werden als Plaque-bildende Einheiten (pfu) pro ml dargestellt. Balken stellen Mittelwerte + SEM von vier unabhängigen Experimenten dar. Statistiken: 2-Weg-ANOVA (A), 1-Weg-ANOVA (C), ungepaarter t-Test (D+E); *P<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; n=3–5

Die antivirale Reaktion auf OMVs ist TLR4-TRIF-abhängig

Um die beteiligte PRR zu identifizieren, wurden kommerzielle Immunagonisten allein oder in Kombination mit LPS eingesetzt, um OMVs nachzuahmen. Bei KpOMVs wurde jedoch keine gespiegelte Mx1-Induktion beobachtet (Zusatzdatei 1: Abb. S7), was auf eine unterschiedliche und verlängerte Aktivierung von Makrophagen durch OMVs aufgrund ihrer Ligandenzusammensetzung oder räumlichen Präsentation gegenüber PRRs hindeutet. Die beteiligten Immunrezeptoren wurden durch THP-1-Reporterzellen weiter auf NF-κB- und IRF-Signalisierung untersucht (Abb. 5A). Bei der Behandlung mit KpOMV zeigten THP-1-Zellen eine signifikant erhöhte Expression des Mx1-Proteins (Abb. 5B und Zusatzdatei 1: S6B), das in TRIF-defizienten (TRIF−/−) THP-1-Zellen verloren ging ( Abb. 5B und Zusatzdatei 1: S6B). Das Gleiche wurde für den IRF-Reporter beobachtet (Abb. 5C), während die Aktivierung des NF-κB-Reporters und die CXCL8-Induktion sowohl in THP-1- als auch in TRIF-/−-Zellen bei Stimulation hoch waren (Abb. 5D + E). Die STAT-abhängige IFIT1-, IFI44- und Mx1-Genexpression wurde durch KpOMV-Stimulation in THP-1-Reporterzellen induziert (Abb. 5E), während sie in gleichermaßen stimulierten TRIF-/−-Zellen signifikant reduziert war (Abb. 5E). Eine zusätzliche IAV-Infektion nach der Vorstimulation führte zu einer verminderten Virusreplikation, wohingegen die TRIF-Deletion die IAV-Replikation rettete (Abb. 5F). Um zu untersuchen, ob KpOMVs eine allgemeine antivirale Reaktion in Makrophagen hervorrufen, wurden Zellen mit dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) infiziert, das sich in Kontrollzellen replizierte, in mit KpOMV vorbehandelten Zellen jedoch blockiert war und auch durch TRIF-Deletion gerettet werden konnte (Abb. 5G). Da die Erkennung von LPS über TLR4 für die Endozytose und TRIF-Aktivierung wesentlich ist, wurde LPS auf der OMV-Oberfläche durch das Lipopeptid-Antibiotikum Polymyxin B (PB) neutralisiert, was zu einer um 50 % verringerten Mx1-Induktion führte (Abb. 6A+B und Zusatzdatei 1). : S6C), aber kein signifikanter Unterschied in der NF-κB-abhängigen CXCL8-Transkription (Abb. 6C). Die Virusreplikation wurde nach KpOMV+PB-Vorstimulation auf das Grundniveau zurückgeführt (Abb. 6D). Da die Hemmung der LPS-Erkennung durch PB nicht ausreichte, um Mx1 vollständig zu blockieren, wurden OMVs aus endotoxinfreien Clear coli (Cc) isoliert und zur Vorstimulation verwendet. Cc exprimiert ein verändertes Lipid A und kann keinen aktivierten TLR4/MD2-Komplex induzieren [24]. CcOMVs induzierten Mx1 nicht (Abb. 6A + B und Zusatzdatei 1: S6C) und reduzierten die IAV-Replikation in Makrophagen nicht (Abb. 6D). Es ist bekannt, dass die Isolierung extrazellulärer Vesikel durch differenzielle Ultrazentrifugation neben den Vesikeln auch zur Co-Isolierung von Kontaminanten (z. B. Proteinen oder bakteriellen Zellanhängen) führt. In Übereinstimmung mit den MISEV2018-Richtlinien [25] wurden Schlüsselexperimente mit OMVs wiederholt, die durch eine Kombination aus Ultrafiltration (UF) und Größenausschlusschromatographie (SEC) isoliert wurden. Die Stimulation von THP-1-Reporterzellen mit UF-SEC-gereinigten KpOMVs führte zur Induktion von Mx1 (Zusatzdatei 1: Abb. S8A) und IRF-Reporter (Abb. S8B), während es in TRIF-/−-Makrophagen verloren ging ( Zusatzdatei 1: Abb. S8A+B). Die IAV-Replikation wurde in mit KpOMV vorbehandelten Zellen blockiert und nach TRIF-Deletion wiederhergestellt (Zusatzdatei 1: Abb. S8C). Die NF-κB-Reporteraktivität wurde durch KpOMVs unabhängig vom TRIF-Status der Zellen induziert (Zusatzdatei 1: Abb. S8D).

Abb. 4 Die Hemmung des JAK-Signals rettet die Replikation des Influenza-A-Virus in Makrophagen. Ein OMV aktiviert die TRIF-IRF-Signalübertragung in Makrophagen, was wiederum die IFN-Expression und -Freisetzung mit anschließender IFNAR-Signalisierung induziert. IFNAR signalisiert über JAK/STAT und induziert die Expression von ISGs, darunter Mx1. Dies führt zu einer Blockierung der IAV-Replikation. B–E THP-1-Zellen wurden 1 Stunde lang mit 10 µM JAK-Inhibitor (JAKi) vorinkubiert, bevor OMVs (1 µg/ml; Kp/Sal) für 2{{22} hinzugefügt wurden }} H. Die Expression von B–C CXCL8 (B) und Mx1 (C) wurde durch qPCR bestimmt und die Ergebnisse werden auf RPS18 normalisiert und relativ zur unbehandelten Kontrolle dargestellt. Balken zeigen Mittelwerte von drei bis vier unabhängigen Experimenten + SEM. Mit D+E OMV vorbehandelte Zellen wurden zusätzlich mit IAV infiziert (MOI 0,001). D Western Blot zeigt die Mx1-Proteinexpression 0–3 Stunden nach der Infektion (pi). E Die Virusreplikation wurde 24 Stunden nach der Infektion durch einen Plaque-Assay bestimmt. Balken zeigen Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten + SEM. Statistik: 1-way ANOVA (B+C+E); *P<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001; *compared to DMSO control, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=4

Abb. 5 OMVs induzieren über TRIF eine antivirale Signalübertragung in Makrophagen. A THP-1 Dual-Reporterzellen induzieren die Expression von sezernierter embryonaler alkalischer Phosphatase (SEAP) nach Aktivierung des NF-κB-Signalwegs und die Expression und Sekretion von Lucia-Luciferase nach Aktivierung des IRF-Signalwegs. Zusätzlich wurden TRIF (graue Balken) differenziert und anschließend mit −/− Zellen stimuliert, die einen stabilen Knockout des Adaptermoleküls TRIF bewirken. (BF) THP-1-Reporterzellen (=Dual; schwarze Balken) und TRIF-/−-Zellen KpOMV (1 µg/ml) für 20 h oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen. Nach der angegebenen Zeit wurden Überstand, RNA und/oder Proteine ​​gesammelt. B Repräsentatives Western-Blot-Bild der Mx1-Proteinexpression. Die C+D-Lucia-Reporteraktivität (C) und die SEAP-Reporteraktivität (D) wurden im Zellkulturüberstand bestimmt. Zur Bestimmung der Aktivität beider Reporter wurde derselbe Überstand verwendet. E Die relative mRNA-Expression für STAT- und NF-κB-abhängige Zielgene (von oben nach unten: IFIT1, IFI44, Mx1, CXCL8) wurde durch qPCR bestimmt und die Ergebnisse werden auf RPS18 normalisiert und relativ zur unstimulierten Doppelkontrolle dargestellt. Fold-Änderungen wurden log2-transformiert. Die Zellen wurden zusätzlich 24 Stunden lang (F) mit A/WSN/33(H1N1) (MOI 0.1) oder 12 Stunden lang (G) mit VSV (MOI 0,1) infiziert. Die Virusreplikation wurde durch Plaque-Assay bestimmt. Die Balken zeigen Mittelwerte von vier (C–F) bis fünf (G) unabhängigen Experimenten + SEM. Statistik: 2-Weg-ANOVA (C–G); *P<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; * compared to unstimulated Dual control, # as depicted in the graph; ns=not signifcant; n=4–5

Abb. 6 Die OMV-induzierte Mx1-Expression geht nach der LPS-Hemmung verloren. THP-1-Zellen wurden 20 Stunden lang mit OMVs (1 µg/ml; Kp oder Clear coli (Cc)) allein oder in Kombination mit 20 µg/ml Polymyxin B (PB) inkubiert oder unbehandelt gelassen zur Kontrolle. Eine Mx1-Proteinexpression wurde mittels Western Blot bestimmt. Gezeigt wird ein repräsentatives Ergebnis von drei biologisch unabhängigen Experimenten. Die Expression von Mx1 B und CXCL8 C wurde durch qPCR bestimmt. Balken zeigen Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten + SEM. D THP-1-Zellen wurden 20 Stunden lang mit OMVs (1 µg/ml; Kp oder Cc) allein oder in Kombination mit 20 µg/ml PB inkubiert oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen und dann zusätzlich mit A/WSN/33 infiziert (H1N1) (MOI 0,001). Die Virusreplikation wurde 24 Stunden nach der Infektion durch Plaque-Assay bestimmt. Balken zeigen Mittelwerte von vier unabhängigen Experimenten + SEM. Statistik: 1-Weg-ANOVA B–D; *P<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001; *compared to control, #compared to KpOMV; ns=not significant; n=3–4

Die IAV-replikationshemmende Wirkung von OMVs ist auf AECs übertragbar

Da Makrophagen nicht der Hauptzelltyp für die IAV-Replikation in der Lunge sind und IFN I auch parakrin wirkt, wurde die Übertragbarkeit des IAV-Replikationseffekts auf AECs getestet, da diese Zellen im Gegensatz zu Makrophagen nicht direkt auf OMVs/MVs reagieren ( Zusatzdatei 1: Abb. S9). Überstand (SN) von mit KpOMV behandelten Makrophagen induzierte Mx1 in A549-Zellen, im Gegensatz zu LpOMV-SN (Abb. 7A), während CXCL8 nach beiden induziert wurde (Abb. 7B). KpOMVSN reduzierte die Virusreplikation (Abb. 7C), was mit Makrophagenexperimenten und dem Muster der Mx1-Induktion übereinstimmte. Um die Abhängigkeit des beobachteten IAV-limitierenden Effekts von der JAK/STAT-Signalisierung zu bestätigen, wurde KpOMV-SN mit JAKi kombiniert, wodurch die Mx1-Induktion bei der KpOMV-SN-Behandlung blockiert wurde (Abb. 7A) und die IAV-Replikation wiederhergestellt wurde (Abb. 7C). Um die komplexe Regulierung von Immunprozessen in der Lunge nachzuahmen, wurde eine Ex-vivo-IAV-Infektion menschlicher präzisionsgeschnittener Lungenschnitte (PCLS) durchgeführt. Lp/KpOMVs waren für das PCLS nicht zytotoxisch (Abb. 8A) und die Kombination aus OMV-Vorstimulation und IAV-Infektion führte zur Mx1-Induktion (Abb. 8B) und CXCL10-Freisetzung (Abb. 8C). KpOMVs, jedoch nicht LpOMVs, reduzierten die IAV-Replikation in PCLS signifikant (Abb. 8D). Die beobachteten Effekte wurden durch Infektion mit UV-inaktiviertem IAV aufgehoben (Abb. 8A–C). Unsere Ergebnisse führen zu einem Modell einer Lungenentzündung, bei dem AMs auf OMVs von gramnegativen Bakterien mit der Induktion von IFN I reagieren und antivirale Reaktionen auf autokrine Weise bei AMs und auf parakrine Weise bei AECs in vitro und in einem Ex-vivo-PCLS-Modell auslösen (Abb. 8E).

Abb. 7: Die replikationshemmende Wirkung von OMVs auf das Influenza-A-Virus ist auf AECs übertragbar. THP-1-Zellen wurden 20 Stunden lang mit LpOMV oder KpOMV inkubiert oder zur Kontrolle unbehandelt gelassen. Der Überstand (SN) wurde steril filtriert und zur Vorstimulation von A549-Zellen für 2{19}} Stunden allein oder in Kombination mit 10 µM JAKi verwendet. Die Expression von A+B Mx1 (A) und CXCL8 B wurde durch qPCR zum Zeitpunkt der Infektion (0 h pi) bestimmt. Die Balken zeigen Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten + SEM, normalisiert auf unbehandelte Kontrollzellen. C Vorbehandelte A549-Zellen wurden zusätzlich 24 Stunden lang mit dem Influenzavirus A/Hamburg/5/2009(H1N1pdm) (MOI 0,01) infiziert. Die Virusreplikation wurde durch Plaque-Assay bestimmt. Balken sind Mittelwerte aus vier unabhängigen Experimenten + SEM. Statistik: 1-way ANOVA; **P<0.01, ****p<0.0001; * compared to control-SN; # compared to KpOMV-SN; n=4

Diskussion

Wir fanden heraus, dass Vesikel verschiedener Bakterien eine unterschiedliche Signalübertragung in Makrophagen induzieren, die in der Lage ist, die IAV-Replikation bei einer nachfolgenden Infektion einzuschränken. In Übereinstimmung mit der Literatur waren isolierte OMVs aus Lp, Kp, Ec und Sal sowie MVs aus Sp in ihrer Größe vergleichbar [26–28]. Mit Bakterienvesikeln inkubierte Makrophagen zeigten keine Zytotoxizität [29, 30], lösten jedoch eine proinflammatorische Reaktion aus. Alle Vesikel lösten die Phosphorylierung von p38 und die Freisetzung von CXCL8 und IL-1 aus primären menschlichen Makrophagen aus, während es Unterschiede bei der Induktion von IFN I und deren nachgeschalteter Signalübertragung gab. Wir und andere haben bereits gezeigt, dass LpOMVs über TLR2 signalisieren [12, 22] und auch SpMVs ein deutliches Aktivierungsmuster in Makrophagen induzierten [31]. LpOMVs/SpMVs aktivierten proinflammatorische NF-κB-Zielgene, wie für die Ursprungsbakterien beschrieben [12, 22, 31]. Die Erkennung von Kp/Ec/SalOMVs löste jedoch zusätzlich zu den NF-κB-Zielgenen die Induktion der IRF-3-Phosphorylierung mit nachgeschalteter IFNB-Expression und einer langanhaltenden Phosphorylierung von STAT1 zusammen mit der Induktion von ISGs aus, was für eine aktive Aktivierung spricht IFNAR-JAK/STAT-Signalisierung. OMVs tragen LPS auf ihrer Oberfläche, aber die entzündungsfördernde Wirkung von OMVs konnte mit reinem LPS nicht nachgeahmt werden. Wir und andere beobachteten, dass Makrophagen gegenüber OMVs empfindlicher sind als die gleiche Menge an reinem LPS [32, 33]. OMVs enthalten eine Reihe von Immunagonisten, die für die Induktion einer robusten Immunantwort benötigt werden [32]. Kommerzielle TLR- und RIG-I-Agonisten allein oder in Kombination mit LPS konnten die Wirkung nicht nachahmen. Es wurde zuvor gezeigt, dass mit LPS beladene Liposomen im Vergleich zu freiem LPS eine längere Aktivierung von TRIF-IRF-3 in Makrophagen induzierten [34]. Mithilfe von TRIF-/-Makrophagen konnten wir die Abhängigkeit der ISG-Induktion von diesem Adaptermolekül zeigen. Darüber hinaus reichten endotoxinfreie CcOMVs oder OMVs in Kombination mit LPSmaskierendem PB aus, um die Reaktion von Makrophagen aufzuheben. Dies weist auf die Erkennung von OMVs über TLR4 mit anschließender Endozytose und TRIF-Signalisierung hin. Dementsprechend waren Kp/Ec/SalOMVs in der Lage, die proinflammatorische Aktivierung von Makrophagen über TLR4 zu induzieren, was zu MyD88-Signalisierung und NF-κB-abhängiger Genexpression sowie TRIF-Signalisierung mit IFN-I-Antwort führte. Dies steht im Einklang mit der Literatur, die zeigt, dass TLR4 und TRIF zusammen für die Immunogenität von Neisseria meningitidis-OMVs in Mäusen erforderlich sind [35]. Da IFNs vom Typ I die Hauptregulatoren antiviraler Reaktionen sind, stellten wir die Hypothese auf, dass die Erkennung von Kp/Ec/SalOMVs die IAV-Replikation beeinflusst. Wir haben gezeigt, dass Makrophagen die IAV- und VSV-Replikation nach TRIF-aktivierenden OMV-Vorbehandlungen wirksam blockierten, während TRIF–/– die Virusreplikation rettete. Um den Effekt auf die IFNAR-Signalisierung genau zu bestimmen, blockierte die JAK1/2-Hemmung in Kombination mit OMVs erfolgreich die STAT1-abhängige Mx1-Induktion und rettete die Virusreplikation in Makrophagen. Die Kombination von KpOMVs mit PB oder die Anwendung endotoxinfreier CcOMVs verringerte die IAV-Replikation in Makrophagen nicht, da diese nicht in der Lage waren, antivirale Gene zu induzieren. Da durch Ultrazentrifugation gewonnene extrazelluläre Vesikelpräparate neben den Vesikeln freies Protein und bakterielle Zellanhaftungen enthalten, wurden OMV-Präparate zusätzlich durch eine Kombination aus Ultrafiltration und Größenausschlusschromatographie erzeugt [25].

Chinesische Kräuter-Cistanche-Pflanze – Antitumor

Die erhaltenen reinen Vesikelpräparate waren gleichermaßen in der Lage, die TRIF-IRF-Signalisierung mit nachgeschalteter Mx1-Induktion zu induzieren und die Virusreplikation zu blockieren, was für einen direkten Vesikeleffekt spricht. Obwohl ATMs die erste Verteidigungslinie in der Lunge darstellen, findet der Großteil der IAV-Infektion und -Replikation in einer menschlichen Lunge in AECs statt [36]. Daher wurden AECs mit OMVs stimuliert, sie reagierten jedoch nicht wie Makrophagen auf die Stimulation. Nur die Bronchialepithelzelllinie BEAS2B reagierte mit CXCL8-Expression, es fehlte jedoch die Mx1-Induktion. Da wir in Makrophagen eine antivirale Genexpression in Abhängigkeit von TLR4 und TRIF zeigen konnten, nehmen wir an, dass die vier getesteten Epithelzelllinien TLR4 nicht in ähnlichem Ausmaß wie Makrophagen exprimieren und dass sie bei der TLR4-Aktivierung keine OMVs endozytisieren konnten. Dies steht im Einklang mit der Literatur, die zeigt, dass isolierte menschliche AECs nicht wie gepaarte AMs auf LPS reagieren [37]. Da wir den antiviralen Status bei der OMV-Vorinkubation mit IFN I verknüpften, verwendeten wir einen Überstand von OMV-stimulierten Makrophagen, um AECs vorzustimulieren. Das konditionierte Medium KpOMV-stimulierter Makrophagen induzierte im Gegensatz zur direkten Vesikelstimulation die Mx1-Expression in diesen Zellen und reduzierte die IAV-Replikation in nachfolgenden Infektionsexperimenten. Überstände von LpOMV-behandelten Makrophagen induzierten CXCL8 in Epithelzellen, verursachten jedoch keine Mx1-Induktion und Veränderungen in der Virusreplikation. Um den mit konditionierten Medien beobachteten Effekt auf IFN I zurückzuführen, wurde der Überstand mit einem JAK1/2-Inhibitor kombiniert, der die Mx1-Induktion blockierte und keinen Einfluss auf die Virusreplikation hatte. Da das Zusammenspiel der verschiedenen Zelltypen in einer menschlichen Lunge komplexer ist und durch konditionierte Medien nicht vollständig nachgeahmt werden kann, haben wir unseren Ansatz auf lebensfähige Abschnitte des menschlichen distalen Lungengewebes ausgeweitet, das häufig für Studien zu Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen verwendet wird, darunter Influenzavirus und bakterielle Infektionen [38–41]. Im Gegensatz zu den verwendeten In-vitro-Modellen behält das ex vivo menschliche Lungengewebe die dreidimensionale Architektur der Lunge bei und ermöglicht ein physiologisches Zusammenspiel zwischen den in der Lunge ansässigen Zelltypen, es fehlt jedoch die Möglichkeit des Einstroms weiterer rekrutierter Immunzellen. Eine aufeinanderfolgende Infektion von KpOMV-stimuliertem PCLS mit IAV verringerte die Viruslast im Vergleich zu nicht vorbehandelten Kontrollen. Da nicht alle in vitro getesteten AECs auf die direkte bakterielle Vesikelstimulation reagierten, nehmen wir an, dass in diesem Ex-vivo-Modell die AMs der vorherrschende reagierende Zelltyp sind. Da für die Folgeinfektion ein Influenza-Isolat gewählt wurde, das ausschließlich AECs infiziert und repliziert, kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine parakrine antivirale Wirkung handelt, die von AMs ausgeht und auf AECs übertragen wird. Basierend auf den hier gewonnenen Daten schlagen wir das folgende Modell vor (Abb. 8E): OMVs aus gramnegativen Bakterien können menschliche Makrophagen auf klassische proinflammatorische Weise aktivieren und sie nach erfolgreicher Endozytose der Makrophagen über TLR4 und TRIF antiviral vorbereiten Vesikel. Die Freisetzung von IFN I kann wiederum Makrophagen und/oder AECs über IFNAR- und JAK/STAT-Signalisierung antiviral machen. Eine anschließende Infektion dieser Zellen führt zu einer Mx1-vermittelten Abnahme der Viruslast. Da wir keinen Zugang zu primären menschlichen AMs hatten, wurden die Experimente unter Verwendung menschlicher BDMs als Modell durchgeführt. Angesichts der unterschiedlichen Entwicklungsherkunft und Vorbereitung dieser Makrophagen ist es denkbar, dass AMs im Gegensatz zu BDMs eine schwächere proinflammatorische Reaktion gezeigt hätten. Bakterienvesikel werden bereits in Impfstrategien gegen verschiedene Lungenentzündungserreger eingesetzt (Übersicht in [42]). Daher stellen OMVs nicht nur ein Werkzeug für potenzielle systemische Impfstrategien gegen ihre Wirtsbakterien dar, sondern könnten auch lokal zur Bekämpfung von Virusinfektionen eingesetzt werden, indem sie residente angeborene Immunzellen aktivieren. Zukünftige In-vivo-Studien müssen prüfen, ob diese In-vitro-Ergebnisse auf andere virale Krankheitserreger anwendbar sind. Darüber hinaus ist zu beachten, dass eine möglicherweise auftretende endotoxische Reaktion kritisch überwacht werden muss, um übertriebene Immunreaktionen in vivo zu vermeiden. Die Induktion von Typ-I-IFN muss streng kontrolliert werden, da sich bei gesunden Personen gezeigt hat, dass die Inhalation eines TLR7-Agonisten nach der ersten Dosis zunächst gut vertragen wurde, jedoch zu einer verstärkten TNF- und IFN-I-Reaktion und grippeähnlichen Symptomen führte , nach einer zweiten Dosis [43]. Um Nebenwirkungen zu bekämpfen, könnten gentechnisch veränderte Versionen von OMVs erforderlich sein, die eine ausgewogene Immunantwort auslösen und eine gute Anwendbarkeit ermöglichen. Zusammenfassend stellen wir hier ein Modell vor, wie OMVs antivirale Signale in menschlichen Makrophagen induzieren können und wie dies zur Verhinderung der IAV-Replikation genutzt werden kann.

Abb. 8 KpOMV reduziert die Replikation des Influenza-A-Virus in präzisionsgeschnittenen menschlichen Lungenschnitten. Humane PCLS wurden 20 Stunden lang mit 1 µg/ml OMVs (Lp/Kp) inkubiert und anschließend 48 Stunden lang zusätzlich mit Influenza A/California/04/2009(H1N1pdm) infiziert. Als Kontrolle diente die UV-Inaktivierung des Virus. Die Zytotoxizität wurde durch Quantifizierung des aus PCLS freigesetzten LDH bestimmt und wird in % im Vergleich zur Gesamtlyse dargestellt. Die B Mx1-Expression wurde durch qPCR quantifiziert und wird im Verhältnis zu RPS18 und unbehandeltem Kontroll-PCLS dargestellt. Die Freisetzung von C CXCL10 wurde durch ELISA bestimmt und ist in ng/ml angegeben. D Die Virusreplikation wurde durch Plaque-Assay bestimmt und ist in pfu/ml angegeben. Die Balken zeigen Mittelwerte von drei bis fünf biologischen Replikaten + SEM. E Vorgeschlagenes Modell zur Induktion der antiviralen Immunität von OMVs in der Lunge. Statistik: 1-Wege-ANOVA (AC), Friedman-Test (D); *P<0.05, ***p<0.001, ****p<0.0001; * compared to IAV infected, but not pre-treated PCLS, # as depicted in the graph; ns=not significant; n=5

Verweise

1. Kulp A, Kuehn MJ. Biologische Funktionen und Biogenese sezernierter bakterieller Vesikel der Außenmembran. Annu Rev Microbiol. 2010;64:163–84.

2. Ellis TN, Kuehn MJ. Virulenz und immunmodulatorische Rolle bakterieller Vesikel der Außenmembran. Microbiol Mol Biol Rev. 2010;74(1):81–94.

3. Giordano NP, Cian MB, Dalebroux ZD. Lipidsekretion der äußeren Membran und die angeborene Immunantwort auf gramnegative Bakterien. Immun infizieren. 2020. https://doi.org/10.1128/IAI.00920-19.

4. Mancini F, et al. OMV-Impfstoffe und die Rolle von TLR-Agonisten bei der Immunantwort. Int J Mol Sci. 2020. https://doi.org/10.3390/ijms21124416.

5. Hu G, Christman JW. Leitartikel: Alveolarmakrophagen bei Lungenentzündung und -auflösung. Frontimmunol. 2019;10:2275.

6. Grassin-Delyle S, et al. Die Rolle von Toll-like-Rezeptoren bei der Produktion von Zytokinen durch menschliche Lungenmakrophagen. J Angeborenes Immunsystem. 2020;12(1):63–73.

7. Informationsblatt zur (saisonalen) Grippe. 2018; https://www.who.int/news-room/ fact-sheets/detail/influenza-(saisonal)

8. Crotta S, et al. Interferone vom Typ I und Typ III treiben redundante Amplifikationsschleifen an, um eine Transkriptionssignatur in Influenza-infizierten Atemwegsepithelien zu induzieren. PLoS Pathog. 2013;9(11): e1003773.

9. Bals R, Hiemstra PS. Angeborene Immunität in der Lunge: Wie Epithelzellen gegen Atemwegserreger kämpfen. Eur Respir J. 2004;23(2):327–33.

10. Helft J, et al. Kreuzpräsentierende dendritische CD103+-Zellen sind vor einer Infektion mit dem Influenzavirus geschützt. J Clin Invest. 2012;122(11):4037–47.

11. Ghoneim HE, Thomas PG, McCullers JA. Der Abbau alveolarer Makrophagen während einer Influenza-Infektion begünstigt bakterielle Superinfektionen. J Immunol. 2013;191(3):1250–9.

12. Jung AL, et al. Von Legionella pneumophila abgeleitete äußere Membranvesikel fördern die Bakterienreplikation in Makrophagen. PLoS Pathog. 2016;12(4): e1005592.

13. Lindhauer NS, et al. Antibakterielle Aktivität eines Tribolium castaneum-Defensins in einem In-vitro-Infektionsmodell von Streptococcus pneumoniae. Virulenz. 2019;10(1):902–9.

14. Danov O, et al. Zigarettenrauch beeinflusst die Populationen dendritischer Zellen, die Funktion der Epithelbarriere und die Immunantwort auf eine Virusinfektion mit H1N1. Front Med. 2020. https://doi.org/10.3389/fmed.2020.571003.

15. Matrosovich M, et al. Neues niedrigviskoses Overlay-Medium für virale Plaque-Assays. Virol J. 2006;3:63. 16. Neuhaus V, et al. Bewertung der zytotoxischen und immunmodulatorischen Wirkung von Substanzen in menschlichen präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten. J Vis Exp. 2018. https://doi.org/10.3791/57042. 17. Niehof M, et al. RNA-Isolierung aus präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten (PCLS) verschiedener Spezies. BMC-Res-Notizen. 2017;10(1):121.

18. Schulz C, et al. Von THP-1-abgeleitete Makrophagen machen Lungenepithelzellen hyporeagibel auf Legionella pneumophila – eine systembiologische Studie. Sci Rep. 2017;7(1):11988.

19. Livak KJ, Schmittgen TD. Analyse relativer Genexpressionsdaten mittels quantitativer Echtzeit-PCR und der 2(-Delta Delta C(T))-Methode. Methoden. 2001;25(4):402–8. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262.

20. Haller O, et al. Mx-GTPasen: Dynaminartige antivirale Maschinen der angeborenen Immunität. Trends Mikrobiol. 2015;23(3):154–63. 21. Anastasia M, et al. Der C-Terminus des NS1-Proteins des Influenza-A/WSN/1933(H1N1)-Virus moduliert antivirale Reaktionen in infizierten menschlichen Makrophagen und Mäusen. J Gen Virol. 2015;96(8):2086–91.

22. Jager J, et al. Die Fusion von Vesikeln der äußeren Membran von Legionella pneumophila mit eukaryotischen Membransystemen ist ein Mechanismus, um Krankheitserregerfaktoren an die Wirtszellmembranen zu transportieren. Zellmikrobiol. 2015;17(5):607–20.

23. Lammers AJ, et al. Die Rolle von TLR2 bei der Wirtsreaktion auf Pneumokokken-Pneumonie in Abwesenheit der Milz. BMC Infect Dis. 2012. https://doi. org/10.1186/1471-2334-12-139.

24. Mamat U, et al. Endotoxinfreie Proteinproduktion – ClearColi™-Technologie. Nat-Methoden. 2013;10:916.

25. Théry C, et al. Minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln 2018 (MISEV2018): eine Stellungnahme der Internationalen Gesellschaft für extrazelluläre Vesikel und eine Aktualisierung der MISEV2014-Richtlinien. J Extrazellige Vesikel. 2018;7(1):1535750. https://doi.org/10.1080/20013078.2018. 1535750. 26. Bonnington KE, Kuehn MJ. Die Produktion von Vesikel in der Außenmembran erleichtert den LPS-Umbau und die Aufrechterhaltung der Außenmembran bei Salmonellen während Umweltübergängen. MBio. 2016. https://doi.org/10.1128/mBio. 01532-16.

27. Jasim R, et al. Lipidomische Analyse der äußeren Membranvesikel aus gepaarten Polymyxin-empfindlichen und -resistenten klinischen Isolaten von Klebsiella pneumoniae. Int J Mol Sci. 2018. https://doi.org/10.3390/ijms19082356.

28. Olaya-Abril A, et al. Charakterisierung schützender, von der extrazellulären Membran abgeleiteter Vesikel, die von Streptococcus pneumoniae produziert werden. J Proteomik. 2014;106:46–60.

29. Kuhn T, Koch M, Fuhrmann G. Probiomimetika – neuartige Lactobacillus-Mikropartikel, die Mikropartikel nachahmen, zeigen in Magen-Darm-Modellen entzündungshemmende und barriereschützende Wirkungen. Klein. 2020;16(40): e2003158.

30. Mehanny M, et al. Extrazelluläre Membranvesikel von Streptokokken werden schnell von Immunzellen internalisiert und verändern deren Zytokinfreisetzung. Frontimmunol. 2020;11:80.

31. Volgers C, et al. Immunmodulatorische Rolle für Membranvesikel, die von THP-1-Makrophagen und Atemwegspathogenen während einer Makrophageninfektion freigesetzt werden. BMC Mikrobiol. 2017;17(1):216.

32. Ellis TN, Leiman SA, Kuehn MJ. Natürlich erzeugte äußere Membranvesikel von Pseudomonas aeruginosa lösen durch die kombinierte Wahrnehmung von Lipopolysaccharid- und Proteinkomponenten eine starke angeborene Immunantwort aus. Immun infizieren. 2010;78(9):3822–31.

33. Alaniz RC, et al. Membranvesikel sind immunogene Faksimiles von Salmonella typhimurium, die dendritische Zellen wirksam aktivieren, B- und T-Zell-Reaktionen auslösen und in vivo eine schützende Immunität stimulieren. J Immunol. 2007;179(11):7692–701.

34. Watanabe S, Kumazawa Y, Inoue J. Liposomales Lipopolysaccharid initiiert den TRIF-abhängigen Signalweg unabhängig von CD14. Plus eins. 2013;8(4): e60078.

35. Fransen F, et al. Unterschiedliche Wirkung von TLR2 und TLR4 auf die Immunantwort nach Immunisierung mit einem Impfstoff gegen Neisseria meningitidis oder Bordetella pertussis. Plus eins. 2010;5(12): e15692.

36. Travanty E, et al. Unterschiedliche Anfälligkeiten menschlicher Lungenprimärzellen gegenüber H1N1-Influenzaviren. J Virol. 2015;89(23):11935–44.

37. Mubarak RA, et al. Vergleich der pro- und antiinflammatorischen Reaktionen in paarigen humanen primären Atemwegsepithelzellen und alveolären Makrophagen. Respir Res. 2018;19(1):126.

38. Wu W, et al. Angeborene Immunantwort auf eine H3N2- und H1N1-Infuenzavirus-Infektion in einem menschlichen Lungenorgankulturmodell. Virologie. 2010;396(2):178–88.

39. Wu W, et al. Das Influenza-A(H1N1)pdm09-Virus unterdrückt RIG-I-initiierte angeborene antivirale Reaktionen in der menschlichen Lunge. Plus eins. 2012;7(11): e49856.

40. Delgado-Ortega M, et al. Angeborene Immunantwort auf ein Schweinegrippevirus des H3N2-Subtyps in Luftröhrenzellen neugeborener Schweine, Alveolarmakrophagen und präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten. Tierarzt Res. 2014;45:42.

41. Kolbe U, et al. Die frühe Zytokininduktion bei einer Pseudomonas aeruginosa-Infektion in präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten von Mäusen hängt von der Erkennung der Lebensfähigkeit der Bakterien ab. Frontimmunol. 2020. https://doi.org/10.3389/fmmu. 2020.598636.

42. Jung AL, et al. Die klinische Rolle von Wirts- und Bakterien-abgeleiteten extrazellulären Vesikeln bei Lungenentzündung. Adv Drug Deliv Rev. 2021. https://doi.org/10. 1016/j.addr.2021.05.021.

43. Delaney S, et al. Verträglichkeit beim Menschen nach inhalativer Gabe des selektiven TLR7-Agonisten AZD8848. BMJ Open Respir Res. 2016;3(1): e000113.