Lichtempfindliche Pro-Drug-Nanoanordnungen mit einer chemotherapeutischen Ruhefunktion verstärken die Krebsimmuntherapie
Dec 25, 2023
Abstrakt
Immuntherapie in Kombination mit wirksamen Therapeutika wie Chemotherapie und photodynamischer Therapie ist eine erfolgreiche Strategie zur Aktivierung von Antitumor-Immunreaktionen für eine verbesserte Krebsbehandlung. Die Entwicklung multifunktionaler, biologisch abbaubarer, biokompatibler, wenig toxischer, aber hocheffizienter und klinisch verfügbarer transformierter Nano-Immunstimulanzien bleibt jedoch eine Herausforderung und besteht großer Bedarf. Hier berichten und entwerfen wir ein neuartiges trägerfreies photochemotherapeutisches Nano-Prodrug COS-BA/Ce6 NPs, indem wir drei multifunktionale Komponenten kombinieren: selbstorganisierte natürliche kleine Moleküle Betulinsäure (BA), ein wasserlösliches Chitosan-Oligosaccharid (COS), und ein schwach toxischer Photosensibilisator Chlorin e6 (Ce6), um die Antitumorwirksamkeit der immunadjuvanten Anti-PD-L1-vermittelten Krebsimmuntherapie zu erhöhen. Wir zeigen, dass die entwickelten Nanomedikamente eine intelligente und charakteristische „Ruhe“-Eigenschaft in der chemotherapeutischen Wirkung mit der gewünschten geringeren Zytotoxizität und mehreren günstigen therapeutischen Eigenschaften aufwiesen, einschließlich einer verbesserten 1 O2-Erzeugung durch die verringerte Energielücke von Ce6, pH-Reaktionsfähigkeit, guter biologischer Abbaubarkeit usw Biokompatibilität, wodurch eine hocheffiziente, synergistische Photochemotherapie gewährleistet wird. Darüber hinaus könnten sowohl die auf Nano-Coassembly basierende Chemotherapie als auch die Chemotherapie/photodynamische Therapie (PDT) in Kombination mit einer Anti-PD-L1-Therapie die Antitumorimmunität bei der Behandlung von primären oder entfernten Tumoren wirksam aktivieren und so potenziell attraktive Möglichkeiten für die klinische Immuntherapie eröffnen.
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SCHLÜSSELWÖRTER
Krebsimmuntherapie; Nano-Immunstimulanzien; Chemotherapeutische Ruhephase; Pro-Droge; Selbstmontage; Natürliches kleines Molekül; Betulinsäure; Photodynamische Therapie
1. Einleitung
Die Krebsimmuntherapie, wie die Strategie der Immun-Checkpoint-Blockade mit PD-L1 oder CTLA-4 zur Krebsbekämpfung durch Aktivierung des Immunsystems des Wirts, hat zweifellos die Krebsbehandlung revolutioniert1,2. Leider schränkten die schwache Immunantwort und die ineffektiven therapeutischen Wirkungen die klinischen Aussichten stark ein3,4. Kürzlich haben aktuelle Studien gezeigt, dass eine Kombination der Immuntherapie mit anderen Modalitäten wie Chemotherapie5, photodynamischer Therapie (PDT)6, photothermischer Therapie (PTT)7 und Strahlentherapie8 wirksam die Antitumor-Immunogenität auslösen kann, indem sie Krebszellen dazu veranlasst, einen immunogenen Zelltod zu erleiden ( ICD)9, was auf das Potenzial der Immunmodulation zur Aktivierung von Antitumor-Immunreaktionen hinweist. Zahlreiche innovative Designs von Nanomaterialien, die auf diesen synergistischen Kombinationen von Immuntherapiestrategien basieren, haben zu einer deutlich verbesserten Antikrebsaktivität geführt, darunter anorganische10, polymere11 und biomimetische12 Nanopartikel (NPs). Die Entwicklung multifunktionaler, biologisch abbaubarer, biokompatibler, wenig toxischer, aber hocheffizienter und klinisch verfügbarer transformierter Nano-Immunstimulanzien bleibt jedoch eine große Herausforderung und ein enormer Bedarf. Natürliche biologische Materialien wie Nukleinsäuren13, Proteine12, Peptide14,15 und niedermolekulare Naturstoffe16,17 haben aufgrund ihrer inhärenten Vorteile (z. B. Biokompatibilität, Nichttoxizität) ein erhebliches Forschungsinteresse für medizinische Anwendungen geweckt. Vor allem in den letzten Jahren wurden sukzessive bioaktive, terpenoide natürliche kleine Moleküle (NSMs) mit Selbstorganisationsfunktion gegen Krebs entdeckt18,19. Betulinsäure (BA), Ergosterol (ET) und Abietinsäure (AA) können sich beispielsweise selbst zu mikro- oder nanostrukturierten Partikeln zusammenlagern. Diese NSMs sind attraktive Bausteine für die Entwicklung von Antitumormitteln für synergistische Chemotherapie und PDT. Es wurde nachgewiesen, dass sie erhebliche Vorteile aufweisen: einfache Nanoherstellung, bessere Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit, geringere Toxizität mit geringerer Leberschädigung und hoher Synergismus in der Antitumortherapie20–23. Dies bietet vielversprechende Alternativen für die Entwicklung klinisch verfügbarer translatierbarer Nano-Immunstimulanzien für die synergistische Immuntherapie. Allerdings führte die allgemein stärkere Lipophilie dieser NSMs zu einer ineffizienten zellulären Endozytose, was ihre Antikrebsaktivität schwächte und ihren klinischen Wert für die Krebsbehandlung einschränkte24. Ähnlich wie die häufig berichteten Nanokomposite förderten die entsprechenden NSM-Nanoformulierungen die Zellaufnahme, um die chemotherapeutische Wirkung zu verstärken, erhöhten jedoch unbeabsichtigt auch das Risiko einer unspezifischen Zytotoxizität für normale Zellen22. Daher ist die Frage, wie die krebsbekämpfende Wirksamkeit von Terpenoid-NSM-Nanowirkstoffen maximiert und gleichzeitig ihre Toxizität für normales Gewebe minimiert werden kann, ein entscheidender Punkt im synergistischen Immuntherapieprozess.
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Pro-Drug-Strategien wurden in großem Umfang eingesetzt, um die Zellaufnahme lipophiler kleiner Moleküle durch Erhöhung der Hydrophilie zu verbessern25. Im Allgemeinen weisen amphiphile Arzneimittel insbesondere eine höhere zelluläre Aufnahmeeffizienz auf als hydrophile oder lipophile Arzneimittel26. Je höher die zelluläre Phagozytose, desto besser ist die therapeutische Wirksamkeit24. Daher könnte die Entwicklung amphiphiler Terpenoid-NSM-Pro-Wirkstoff-Moleküle eine potenzielle Methode zur Maximierung ihrer therapeutischen Wirkungen sein. Darüber hinaus sind Nanomedikamente, die auf Reize reagieren und auf die spezifische Mikroumgebung des Tumors (z. B. Säure- oder Redox-Reaktivität) reagieren, vielversprechend für die Kontrolle der Medikamentenfreisetzung, was bei der Unterdrückung der Zytotoxizität der Chemotherapeutika von Vorteil ist27,28. Mittlerweile war die supramolekulare Coassemblierung (z. B. ein Umfällungsansatz) eine wirksame Strategie zur Herstellung hochwasserlöslicher, trägerfreier Nanowirkstoffe22,29, von der zu erwarten ist, dass sie die Phagozytoseeffizienz amphiphiler NSMs bis zu einem gewissen Grad leicht verringert und dadurch ihre Präzipitation abschwächt. entworfene Zytotoxizität. Wir gehen davon aus, dass auf Reize reagierende und vollständig hydrophile Nanomedikamente auf der Grundlage amphiphiler NSMs als Prodrug weiter etabliert wurden und deren unspezifische Zytotoxizität gegenüber normalen Zellen wirksam unterdrücken können, während sie gleichzeitig die Freisetzung hochtoxischer amphiphiler NSMs in Tumorzellen stimulieren und deren Ruhe in normalen Geweben erleichtern Aktivierung an der Tumorstelle. Es ist wichtig, den geeigneten wasserlöslichen und auf Reize reagierenden Vorläufer auszuwählen, um terpenoide NSMs zu modifizieren und amphiphile Pro-Drug-Moleküle herzustellen. Seit Jahren weisen Chitosan-Oligosaccharide (COS) als Abbauprodukte von Chitosan nicht nur eine gute Wasserlöslichkeit und reichlich vorhandene eOH- oder NH2-Gruppen auf, die zu einer guten pH-Reaktion führen, sondern weisen auch vorteilhafte Antitumoraktivitäten auf, indem sie die Immunfunktion des Wirts durch Regulierung der Aktivität stärken von Immunzellen wie Monozyten-Makrophagen und Lymphozyten30,31. Diese garantieren die enorme Möglichkeit, auf Reize reagierende Ziel-Nano-Immunstimulanzien für die synergistische Immuntherapie zu konstruieren.
Basierend auf den obigen Überlegungen wird in unserem experimentellen Design ein pentazyklisches Triterpen-NSM von Betulinsäure (BA) als wirksames Antikrebsmittel32 verwendet. COS wurde eingeführt, um ein amphiphiles COS-BA-Molekül zu synthetisieren und die chemotherapeutische Wirkung zu verbessern. Chlorin e6 (Ce6), ein weit verbreiteter Photosensibilisator mit sehr geringer/ohne Dunkeltoxizität33, wurde verwendet, um mithilfe einer direkten Co-Assembly-Strategie ein vollständig wasserlösliches, trägerfreies, lichtempfindliches Prodrug COS-BA/Ce6-NPs zu konstruieren. COS-BA/Ce6-NPs kombinierten zwei therapeutische Modalitäten, Chemotherapie und photodynamische Therapie (PDT), die die Präsentation von Tumor-abgeleiteten Antigenen gegenüber T-Zellen effektiv steigern und mithilfe eines Immunadjuvans Anti-PD-L1 robuste immunologische Reaktionen hervorrufen können um eine hocheffiziente und synergistische Antitumor-Chemotherapie/PDT/Immuntherapie zu bewirken (Schema 1). Die manipulierten COS-BA/Ce6-NPs zeigten eine intelligente Ruhefunktion mit heimtückischen Chemotherapieeffekten, d. h. unbestrahlte, koassemblierte NPs zeigten im Vergleich zu amphiphilen COS-BAs eine bemerkenswert gehemmte In-vitro-Zytotoxizität, sei es gegen Krebszellen oder gegen normale Zellen. Aufgrund des ausgeprägten pH-Reaktionsverhaltens weist es in vivo eine geringe Toxizität und Biosicherheit für normales Gewebe auf, ist jedoch aufgrund der stimulierenden Freisetzung von hyperaktivem COS-BA in der schwach sauren Tumormikroumgebung hochtoxisch für Tumorgewebe34. Nach unserem besten Wissen wird derzeit noch selten über die entwickelten Nanomedikamente mit dieser chemotherapeutischen Ruhefunktion berichtet. Mittlerweile verfügt das Nanoarzneimittel über mehrere vorteilhafte therapeutische Eigenschaften, wie z. B. eine verbesserte 1 O2-Erzeugung durch Verringerung der Energielücke (DEST) von Ce6, einen schnellen biologischen Stoffwechsel und eine verbesserte Tumorakkumulation, was zu einer effizienten und sicheren Antitumor-Kombination aus Chemotherapie und PDT-Behandlung führte. Noch wichtiger ist, dass sowohl NP-basierte Chemotherapie als auch Chemotherapie/PDT-Systeme die Antitumorimmunität wirksam aktivieren könnten, indem sie die Proliferation von TNF-a- und IFN-g-produzierenden CD8þ-T-Zellen in primären oder entfernten Tumoren erleichtern. Unser vorgeschlagenes biologisch abbaubares, biokompatibles, einzigartig ruhendes, biologisch sicheres und hocheffizientes photochemotherapeutisches Nanomedikament erzielt signifikante systemische immuntherapeutische Reaktionen und eröffnet attraktive Möglichkeiten für die klinische Anwendung bei der Behandlung entfernter oder metastasierter Krebstherapien.
Schema 1 PDT und Chemotherapie zusammengebauter COS-BA/Ce6-NPs verstärkten Anti-PD-L1, um eine systemische Antitumor-Immuntherapie zu induzieren. Die Einführung von wasserlöslichem COS kann die chemotherapeutische Aktivität von BA (dargestellt als Halbschwert) wirksam verstärken, was zu einem hyperaktiven amphiphilen COS-BA-Prodrug (Langschwert) führt. Beim Zusammenbau mit dem Photosensibilisator Ce6 (Scheide) hatten die schalenstrukturierten und pH-empfindlichen Nanoanordnungen eine intelligente und besondere „Ruhe“-Funktion mit gehemmter chemotherapeutischer Toxizität für normales Gewebe. Sobald es jedoch angekommen ist und durch die saure (Hþ) Tumormikroumgebung stimuliert wurde, wird das hochaktive amphiphile Prodrug COS-BA freigesetzt, was zu einer erheblichen Chemotherapie führt. Darüber hinaus zeigten die konstruierten Co-Anordnungen eine hervorragende PDT-Aktivität mit verstärkter Singulett-Sauerstofferzeugung ( 1 O2), die durch die verringerte Energielücke zwischen den angeregten Singulett- und Triplett-Zuständen (DEST) von Ce6 induziert wird. In Kombination mit einer Anti-PD-L1-Checkpoint-Blockade kann die Freisetzung tumorassoziierter Antigene nach einer Chemotherapie/PDT-Behandlung wirksam eine systemische Antitumor-Immunantwort für eine Fernkrebs-Immuntherapie aktivieren.
2. Materialien und Methoden
2.1. Synthese von COS-BA
Betulinsäure (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) und NHS (17 mg, 0,15 mmol ) wurden in 3 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Nach 3-minütigem Rühren bei Raumtemperatur wurden 96 mg einer wässrigen COS-Lösung (1 ml) vorsichtig tropfenweise in die Mischung gegeben und 24 Stunden lang gerührt. Dann wurde die Reaktionsmischung mit CH2Cl2 verdünnt und wiederholt extrahiert. Die CH2Cl2-Schicht wurde eingedampft und auf einer Kieselgelsäule gereinigt. Das nicht umgesetzte BA wurde zunächst mit Petrolether:Aceton (5:1, Vol./Vol.) als Elutionsmittel entfernt und dann auf 3:1 umgestellt, um weißes COS-BA zu ergeben (Ausbeute: 42 %), wobei COS als Dimer identifiziert wurde ( n Z 2). 1 H-NMR (40{{70}} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28 O]CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69,32, 69,22, 65,25, 58,14, 55,62, 55,21, 53,65, 53,22, 50,52, 45,96, 44,32, 44,11, 41,85, 40,59, 38,68, 38,55, 37,32, 37. 04, 36,39, 35,31, 34,21, 31,81, 31,54, 31,17, 30,28 , 29,09, 27,80, 27,22, 25,74, 25,53, 20,91, 19,48, 18,12, 16,02, 15,87, 15,17, 14,65, 14,62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).
2.2. Herstellung von COS-BA/Ce6-NPs
Zusammengebaute COS-BA/Ce6-NPs wurden durch ein einstufiges Umfällungsverfahren hergestellt. Typischerweise wurden zunächst 5 ml Ce6 (33 mmol/L) und 40 ml COS-BA (33 mmol/L) DMSO-Lösungen gemischt. Anschließend wurde die Mischung unter Ultraschall schnell in 1 ml Wasser mit 10 ml NaOH (50 mmol/L) injiziert (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, China). Nach 10-minütiger Ultraschallbehandlung wurden die COS-BA/Ce6-NPs durch 25-minütige Zentrifugation bei 13,000 U/min (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, China) erhalten. Andere Formulierungen mit unterschiedlichen Verhältnissen von COS-BA zu Ce6 wurden nach dem gleichen Verfahren mit einem konstanten Molverhältnis von NaOH zu Ce6 von 3:1 hergestellt.
2.3. Zelllinien
Menschliche MCF-7-, HepG2-, LO2- und Maus-4T1-L929-Zelllinien werden vom Institut für Biochemie und Zellbiologie, SIBS, CAS (China) bereitgestellt. MCF-7, HepG2 und LO2 wurden in DMEM-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Gibco) und 1 % Penicillin-Streptomycin-Antibiotikum (Life Technology, USA) bei 37 °C kultiviert. 4T1 und L929 wurden darin kultiviert RMPI-1640 mittel mit dem gleichen Verhältnis wie oben.
2.4. Studien zur Zellaufnahme und zu endozytischen Signalwegen
Zur Untersuchung der zellulären Aufnahme wurden 4T1- oder LO2-Zellen mit freien Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs inkubiert (äquivalente Konzentration von Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml, BA: 10 0,8 mg/ml) für verschiedene Zeiten. Nach dem Waschen, Fixieren und DIPA-Färben (#D9542, Sigma) wurden die Zellen unter einem fluoreszierenden Umkehrmikroskop (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, China) abgebildet. Die Fluoreszenzintensität wurde mittels Durchflusszytometrie mit dem Guava EasyCyte Mini-System (Merck Millipore, Deutschland) bestimmt. Zur Quantifizierung der Aufnahmeeffizienz wurde die zelluläre Akkumulation von BA und COS-BA mittels HPLC (Agilent 1200, USA) gemessen. Typischerweise wurden 4T1-Zellen 0,5 und 3 Stunden lang mit freiem COS-BA oder BA (entsprechend BA: 25 mg/ml) behandelt. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Zellpellets geerntet und zur Zelllyse einer Ultraschallhomogenisierung (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, China) unterzogen. Anschließend wurde COS-BA oder BA nach Lyophilisierung der Proben mit Chloroform für die HPLC-Analyse extrahiert. Die mobile Phase bestand aus Wasser (0,2 % Phosphorsäure) und Acetonitril mit einer Flussrate von 1,0 ml/min, und die entsprechenden Volumenverhältnisse betrugen 60:40 und 15:85 (v/v) für die Analyse von COS-BA bzw. BA . Die Detektionswellenlänge betrug 213 nm. Zur Untersuchung der endozytischen Signalwege von COS-BA/Ce6-NPs wurden 4T1-Zellen in 6--Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang inkubiert, bevor sie 30 Minuten lang mit verschiedenen Endozytose-Inhibitoren, einschließlich eines Mikropinozytose-Inhibitors [50 mmol/l], vorbehandelt wurden , Ethylisopropylamilorid (EIPA) (#N132356, Aladdin)], ein Clathrin-vermittelter Endozytosehemmer [20 mmol/L, Chlorpromazin (#C7010, Solarbio)], ein Caveolae-vermittelter Endozytosehemmer [25 mmol/L, Nystatin ( #IN0260, Solarbio)] und ein Lysosomen-Ansäuerungshemmer [50 mmol/L, Chloroquinphosphat (#C9720, Solarbio)]35. Anschließend wurden die Zellen 2 Stunden lang mit 2 ml COS-BA/Ce6-NPs (Ce6: 1,7 mg/ml, COS-BA: 19,5 mg/ml) weiter kultiviert und unter FIM (UP Optotech) abgebildet. Die ohne endozytischen Inhibitor bei 37 °C inkubierten Zellen wurden als Kontrolle und zur Bewertung der energieabhängigen Endozytose bei niedriger Temperatur (4 °C) inkubiert. Mittlerweile wurde auch die mittlere Fluoreszenzintensität der Zellen durchflusszytometrisch bestimmt.
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2.5. Zytotoxizitätstest
4T1-Zellen wurden in eine 96-Well-Platte ausgesät. Anschließend wurden die Zellen 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen von COS-BA-NPs behandelt. Anschließend wurde 1 0 ml MTT-Farbstoff (#M158055, Aladdin) (5 mg/ml) in die Vertiefung gegeben und weitere 4 Stunden lang inkubiert. Anschließend wurden 150 ml DMSO hinzugefügt, um die Formazankristalle aufzulösen . Die Absorption jeder Vertiefung bei 492 nm wurde mit einem Mikroplatten-Lesegerät aufgezeichnet. Für die Bestrahlungsgruppe wurden die Zellen 4 Stunden lang mit Arzneimitteln behandelt, dann 10 Minuten lang mit 675 10-nm-Licht bestrahlt und weitere 20 Stunden lang inkubiert. Die Zytotoxizität von COS-BA/Ce6-NPs (1 mg/ml Ce6 entspricht 11,5 mg/ml COS-BA und 6,4 mg/ml BA) gegenüber anderen Zellen (MCF-7, HepG2, LO2 und L929) wurden ebenfalls mit dem gleichen MTT-Assay bestimmt, nur mit einem anderen Medium. In der Zwischenzeit wurde der Kombinationsindex von der Software CompuSyn 2.0 unter Verwendung des Chou Talalay-Theorems36 berechnet.
2.6. Tiermodelle
Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß den vom Animal Care and Use Committee der Harbin Medical University genehmigten Protokollen durchgeführt. 4T1-Zellen wurden in RMPI-1640-Medium suspendiert und subkutan in den rechten Rücken jeder weiblichen BALB/c-Maus (18–22 g, 6–7 Wochen alt) injiziert.
2.7. In/Ex-vivo-Fluoreszenzbildgebung
Eine 200 ml COS-BA/Ce6 NPs 5 % Glucoselösung (äquivalent Ce6: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml) wurde tumortragenden Mäusen durch die Schwanzvene injiziert. Danach wurde die Fluoreszenzbildgebung von Tumorstellen zu einem vorgegebenen Zeitpunkt unter Verwendung eines AniView 100/600-Multimodell-In-vivo-Tierbildgebungssystems (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., China) mit einer Anregung bei 630 nm durchgeführt. 24 Stunden nach der Injektion wurden die Hauptorgane (Herz, Leber, Milz, Lunge und Niere) und der Tumor für die Ex-vivo-Fluoreszenzbildgebung entnommen. Darüber hinaus wurden auch die Ex-vivo-Fluoreszenzbilder von Tumoren und wichtigen Organen zu verschiedenen Zeitpunkten nach iv-Injektionen von Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs ausgewertet.
2.8. In-vivo-Chemotherapie/PDT
4T1-tragende Mäuse (75e100 mm3) werden zufällig in sechs Gruppen eingeteilt (n Z 5): 1) 5 % Glucoselösung; 2) Ce6; 3) Ce6 mit Bestrahlung; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, wobei BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6-NPs; 6) COS-BA/Ce6-NPs mit Bestrahlung. Für jede Gruppe werden Mäusen an den Tagen 0, 2 und 4 200 ml COS-BA/Ce6-NPs (entspricht Ce6: 3,5 mg/kg des Körpers) durch die Schwanzvene injiziert. Für die Bestrahlungsgruppen nach 4 Stunden Nach der Injektion und nach jeder Verabreichung wurden alle Mäuse mit Isofluran anästhesiert und die Tumorstellen wurden 15 Minuten lang mit Licht von 675 10 nm (150 mW/cm²) bestrahlt. Tumorvolumina und Körpergewichte von Mäusen werden ebenfalls jeden zweiten Tag aufgezeichnet. Das Tumorvolumen wird nach der Formel berechnet: VZ Breite2 Länge/2. Nach 14-tägiger Behandlung wurden die Tumoren herausgeschnitten und gewichtet, um das Tumorhemmverhältnis (TIR) anhand der häufig verwendeten Gleichung zu berechnen: TIRZ (1 Probe/Kontrolle) 100 %. Dabei handelte es sich bei Probe und Kontrolle um das durchschnittliche Tumorgewicht jeder behandelten Gruppe bzw. der Gruppe mit wässriger 5 %iger Glucoselösung.
2.9. In-vivo-Chemotherapie/PDT/Immuntherapie
Um das Potenzial von COS-BA/Ce6-NPs in Kombination mit einer Immuntherapie zu demonstrieren, wurde das bilaterale Tumormodell durch subkutane Injektion von 4T1-Zellen in die linke und rechte Flanke entworfen. Als sich die Tumorgröße 75e100 mm3 näherte, wurden die Mäuse in fünf Gruppen eingeteilt. (1) Kontrolle; (2) COS-BA/Ce6-NPs (COS-BA Z 40,2 mg/kg, wobei BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6-NPs þ leicht; (4) COS-BA/Ce6-NPs þ Anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6-NPs – Anti-PD-L1 – Licht. Am Tag 0 wurden Mäusen 200 ml 5 % Glukoselösung (Gruppe 1) oder COS-BA/Ce6-NPs (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (Gruppe 2, 3, 4, 5) iv injiziert. Vier Stunden nach der Injektion wurden die rechten Tumoren der Gruppen 3 und 4 15 Minuten lang bestrahlt. Die Mäuse wurden mit Isofluran betäubt und auf eine Seite gerollt, um eine Freilegung der linken Tumoren zu vermeiden. Anschließend wurde den Mäusen der Gruppen 4 und 5 an den Tagen 2, 4 und 6 ein Anti-PD-L1-Antikörper (BioXcell, Produktnummer: BE0101, Klonnummer: 10F.9G2) iv injiziert (15 mg pro Maus und Injektion). Die Länge und Breite jedes Tumors wurde jeden zweiten Tag überwacht. Nach 14-tägiger Behandlung wurde das Blutserum von Mäusen gesammelt, um Interferon-gamma (IFN-g) (#KMC4021) und Tumornekrosefaktor (TNF-a) (#BMS607-3) mithilfe eines ELISA-Assays (eBioscience) zu bewerten ). Die Tumoren wurden gesammelt, dissoziiert, mit Lysepuffer für rote Blutkörperchen behandelt und durch Zentrifugation mit PBS gewaschen. Anschließend wurde die Zellsuspension mit Anti-CD3-FITC (#MA1-10187, Klon 145-2C11, eBioscience) und Anti-CD8a-PE (#12-0081-85, Klon 53-6.7, eBioscience). Anschließend wurde die Infiltration zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) im rechten und linken Tumor nach verschiedenen Behandlungen mittels Durchflusszytometrie bewertet.
3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Synthese, Herstellung und Charakterisierung von COS-BA/Ce6-NPs
In dieser Studie entwerfen wir ein neuartiges kleines Prodrug-Molekül COS-BA auf der Basis von wasserlöslichem Chitosan-Oligosaccharid (COS), das die chemotherapeutische Aktivität von pentazyklischer Triterpen-Betulinsäure (BA) erhöhen kann, indem es die Zellaufnahme durch Erhöhung der Hydrophilie verbessert. Der hier verwendete COS (Polymerisationsgrad, DP: 2e6) wurde nach unserer zuvor beschriebenen Methode30 hergestellt. Anschließend wurde COS-BA über eine Dehydratisierungskondensationsreaktion synthetisiert. In Kombination mit der Hauptkomponentenanalyse von COS wurde angenommen, dass die chemische Struktur von COS-BA ein Disaccharid (DP:2) modifiziertes BA ist (Hintergrundinformationen Abb. S1), was durch 1 H-NMR, 13C-NMR und ESIeMS bestätigt wurde (Unterstützende Informationen Abb. S2eS4). Die Analyse des repräsentativen 1 H-NMR zeigte das deutliche Protonensignal von COS bei etwa 2,64e3,93 ppm und C]CH2-Peaks (4,60, 4,73 ppm) von BA, was die erfolgreiche Synthese von COS-BA belegt (Abb. 1A). Zur Herstellung der koassemblierten synergistischen Antitumorreagenz COS-BA/Ce6-NPs wurde ein vielseitiger Umfällungsansatz in Zusammenarbeit mit einem hocheffizienten Photosensibilisator Ce6 eingesetzt. Durch Änderung der anfänglichen Molverhältnisse könnten beide COS-BA/Ce6-Zusammenbauformulierungen sphärische Nanostrukturen mit modulierten Größen bilden (Abb. 1B und Hintergrundinformationen Abb. S5). Über verschiedene Eingabeverhältnisse von COS-BA/Ce6 hinweg lagen die hydrophilen Durchmesser der COS-BA/Ce6-NPs bei etwa 200–300 nm mit einem negativen z-Potential. In Anbetracht der Tatsache, dass NPs, die mit einer Formulierung von 8:1 hergestellt wurden, einen niedrigeren Polydispersitätsindex (PDI, 0,143) bei relativ geringerer Größe (249 nm) aufwiesen, war für die kombinatorische Behandlung auch eine ausreichende Menge des Chemotherapeutikums COS-BA erforderlich. Daher haben wir für die folgende Studie die Formulierungen COS-BA/Ce6 (8:1) gewählt. Bei dieser Optimierung zeigten COS-BA/Ce6-NPs enge Größenverteilungen (Abb. 1C) und eine gute Wasserlöslichkeit, was auf ihre kolloidale Natur hinweist (Abb. 1D). Um die Gründe für diese erfolgreiche Co-Assemblierung zu untersuchen, wurde das primäre Selbstassemblierungsverhalten von freiem COS-BA mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht (Abb. 1E), was darauf hindeutet, dass COS-BA eine äußerst gleichmäßige Nano- Kugel von w168 nm, was bedeutet, dass die chemische Modifikation von COS die Selbstorganisationsfähigkeit von BA selbst nicht verändert (Hintergrundinformationen, Abb. S6). Es ist diese Eigenschaft, die letztendlich den erfolgreichen Aufbau der Baugruppen auslöst. Bemerkenswert ist, dass COS-BA/Ce6-NPs, abgesehen von der festen Nanostruktur, die durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt wurde, eine ausgeprägte Schalenstruktur freier COS-BA-NPs zeigten und die durchschnittliche Schalendicke etwa 2,35 nm betrug. Die weitere physiochemische Charakterisierung ist in Abb. 1F zusammengefasst. Darüber hinaus zeigten COS-BA/Ce6-NPs ein negatives z-Potential von 5,38 mV und eine hydrodynamische Größe von w249 nm, die höher war als die aus REM erhaltene Größe (w182 nm). Gleichzeitig betrugen die Ce6-Beladungs- und Einkapselungseffizienzen 8,1 bzw. 96 %, wie durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) bestimmt wurde. Auch FT-IR-Daten (Abb. 1G) bestätigten diese Co-Assemblierung weiter, da COS-BA/Ce6-NPs die charakteristischen C]N-, CeN- und C]CH-Peaks von Ce6 aufwiesen, die bei 1633, 1078 und 633 cm 1 auftraten , jeweils.
Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem
3.2. Zusammengebauter Mechanismus und Bildung der Schalenstruktur
Um den Co-Assemblierungsmechanismus besser zu verstehen, untersuchten wir anschließend zunächst den primären Bildungsprozess von NPs. Wir fanden heraus, dass die Coassemblierung von COS-BA mit Ce6 möglicherweise spontan erfolgt, da diese beiden Spezies auch ohne Ultraschallbehandlung eine sphärische Nanostruktur bilden können (Hintergrundinformationen, Abb. S7), was möglicherweise auf die negative Änderung der freien Gibbs-Energie zurückzuführen ist (DG ) in Co-Assemblies37. Diese spontane Anordnung deutete auch auf eine stärkere intermolekulare Wechselwirkung zwischen COS-BA und Ce6 hin. Im Allgemeinen handelt es sich bei den intermolekularen Wechselwirkungen in supramolekularen Selbst- (oder Co-)Anordnungen um nichtkovalente p-p-Stapelung, Wasserstoffbrückenbindungen und Van-der-Waals-Kräfte 38,39. Für diese Analyse untersuchten wir dann die UV-Absorption von COS-BA/Ce6-NPs (Abb. 1H und F), was auf eine rotverschobene Soret-Bande (410 nm) und Qy-Bande (667 nm) im Vergleich zu hindeutete freies Ce6 (405 bzw. 665 nm). Mittlerweile ist auch die deutlich rotverschobene charakteristische Absorption von COS-BA zu finden, was auf eine mögliche intermolekulare pp-Stapelung zwischen COS-BA und Ce640 hinweist. Darüber hinaus zeigten COS-BA/Ce6-NPs nach der Inkubation mit dem Tensid Natriumdodecylsulfat (SDS, 0,2 % w/v) (Hintergrundinformationen Abb. S8) eine neu blauverschobene Qy-Bande bei 641 nm und eine dramatisch erholte Fluoreszenz, was beweist dass die hydrophoben Wechselwirkungen auch zur Co-Assemblierung beitrugen28. Aufgrund dieser assoziativen nichtkovalenten Wechselwirkungen zeigten Co-Anordnungen eine bemerkenswerte Fluoreszenzlöschung (98,2 %) in Wasser (Abb. 1I). Insgesamt kann man davon ausgehen, dass p-p-Stapelung und hydrophobe Wechselwirkungen die Hauptantriebskräfte für den Aufbau von Co-Anordnungen sein könnten. Anschließend führten wir ein vereinfachtes Simulationsmodell der Molekulardynamik (MD) durch, das 16 optimierte COS-BA-Moleküle und zusätzlich zwei Ce6 in einer Wasserbox enthielt, um den Montageprozess intuitiver zu visualisieren und die zugrunde liegenden Gründe für die Bildung von NPs mit Schalenstruktur aufzudecken . Zunächst haben wir die mögliche Wechselwirkung/Bindung von COS-BA-Selbstorganisationen innerhalb von 5 ns Simulationszeit bewertet (Abb. 2A und Hintergrundinformationen Abb. S9). Wir fanden heraus, dass außer zahlreichen intramolekularen Wasserstoffbrückenbindungen in der COS-Fraktion auch mehrere Paare intermolekularer Wasserstoffbrückenbindungen zwischen COS-BA beobachtet werden konnten (Abb. 2B und Hintergrundinformationen Abb. S10), was darauf hindeutet, dass es sich möglicherweise um Wasserstoffbrückenbindungen handelt einer der Haupttriebkräfte für die Bildung von COS-BA-NPs. Besonders interessant ist, dass bei COS-BA-Selbstorganisationen alle COS-BA-Moleküle eine scheinbar symmetrische Struktur bilden (Abb. 2C). Dieses faszinierende Phänomen motivierte uns, den möglichen Zusammenhang zwischen dieser Eigenschaft und der Bildung schalenstrukturierter COSBA-NPs zu untersuchen. Dann haben wir versucht, die Einheiten der Box zu erweitern. Überraschenderweise waren die verbundenen Kästchen aus COS-BA-Molekülen regelmäßig angeordnet, was zu einer „orthogonalen“ hohlen Netzwerkstruktur führte (Hintergrundinformationen, Abb. S11). Noch wichtiger ist, dass wir die Dicke der Schalenmoleküle zufällig berechnet und festgestellt haben, dass sie mit dem TEM übereinstimmt (w2,35 nm) (Abb. 2D). Diese Tendenz zur Bildung hohler Netzwerkstrukturen könnte für die Bildung schalenstrukturierter NPs verantwortlich sein. Um diese Idee zu testen, wurde die MD-Struktur von COS-BA/Ce6-Koassemblierungen simuliert (Abb. 2E und Hintergrundinformationen Abb. S12). Ähnlich wie bei COS-BA-Selbstorganisationen wurde auch in den Co-Assemblies eine große Anzahl intramolekularer und intermolekularer H-Brücken gefunden (Abb. 2F und Hintergrundinformationen Abb. S13). Darüber hinaus wurde in den Co-Anordnungen eine mögliche pp-Stapelung zwischen C]C von COS-BA und dem aromatischen Ring von Ce6 beobachtet (Abb. 2G), was mit den Daten früherer UV-Untersuchungen übereinstimmt. Nach Erweiterung der Anzahl der Kästchen können immer noch ähnliche hohle Netzwerkstrukturen gefunden werden, jedoch mit verringerter Regelmäßigkeit und Orthogonalität (Hintergrundinformationen Abb. S14). Dies könnte der mögliche Grund für die ungleichmäßige Morphologie von COS-BA/Ce6-NPs im Vergleich zu COSBA-NPs sein. Darüber hinaus liegt der molekulare Hülle-Schicht-Abstand auch nahe an der Hüllendicke (w2,35 nm) von NPs, wie mit der TEM zu sehen ist (Abb. 2H). Gemeinsam haben wir vermutet, dass die Bildung von COS-BA/Ce6-NPs oder COS-BA-NPs mit Schalenstruktur größtenteils auf die Tendenz von Molekülen zurückzuführen sein könnte, sich zu hohlen Schalennetzwerkstrukturen zusammenzufügen.
Abbildung 1 Herstellung und Charakterisierung von durch Chitosan-Oligosaccharide modifizierten Betulinsäure (COS-BA)-Prodrug-vermittelten Nanoanordnungen COS-BA/Ce6-NPs. (A) Die verstärkten Schlüsselpositionen des 1 H-NMR von COS-BA. (B) Herstellung von zusammengebauten COS-BA/Ce6-NPs mit verschiedenen COS-BA/Ce6-Verhältnissen. (C) Größenverteilung von COS-BA/Ce6-NPs unter Verwendung von COS-BA und Ce6 (Molverhältnis 8:1) als Bausteine. (D) Die Wasserlöslichkeit und der Tyndall-Effekt der Co-Anordnungen weisen auf eine kolloidale Natur hin. (E) SEM- und TEM-Bilder von freien COS-BA-Selbstorganisationen und koassemblierten COS-BA/Ce6-NPs. (F) Zusammenfassung der physiochemischen Eigenschaften von COS-BA/Ce6-NPs. (G) FT-IR-Spektren, (H) UV-Vis-Spektren und (I) Fluoreszenzemissionsspektren von freiem Ce6, COS-BA und zusammengebauten COS-BA/Ce6-NPs in Wasser.
Abbildung 2 Strukturen von (A) COS-BA-Selbstorganisationen und (E) coassemblierten COS-BA/Ce6-NPs nach Molekulardynamik (MD)-Simulation für 5 ns mit einem Molverhältnis der Struktureinheiten von 8:1 (COS-BA). /Ce6, berechnet basierend auf der Ce6-Beladungseffizienz). Das Linienmodell wurde für H2O verwendet und die Stabmodelle stellen COS-BA- oder Ce6-Moleküle dar, wobei die C-Atome von Ce6 violett markiert sind. Die Wasserstoffbrückenbindungsinformationen zwischen COS-BA-Molekülen in (B) ihren Selbstorganisationen und (F) COS-BA/Ce6-NPs-Koorganisationen. (C) Die scheinbar symmetrische Struktur der COS-BA-Molekülanordnung nach MD-Simulation. (G) Mögliche molekulare Wechselwirkungen zwischen COS-BA und Ce6 zeigen eine mögliche pp-Stapelung. Die angegebene Dicke der Schalenmoleküle in einer „orthogonalen“ Hohlnetzwerkstruktur nach Erweiterung der entsprechenden MD-Boxen von (D) freien COSBA-Selbstassemblierungen und (H) COS-BA/Ce6-NPs-Coassemblierungen.
3.3. Energiemechanismus der verstärkten 1 O2-Erzeugung
Als nächstes untersuchten wir weiter die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff (1 O2), einer der kritischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) der PDT-Leistung, unter Verwendung von DPBF (1,3-Diphenylisobenzofuran) als Sonde. Nach anhaltender Bestrahlung der Mischlösungen von COS-BA/Ce6-NPs mit DPBF nahm die Intensität der UV-Absorption von DPBF ab, was auf eine O2-Erzeugung hinweist (Abb. 3A). Nach dem Vergleich mit der Methylenblau-Referenz (MB) wurde der F ( 1 O2) von COS-BA/Ce6-NPs zu 0.26 berechnet, etwas höher als der von freiem Ce6 (FZ0.19). (Abb. 3B). Im Allgemeinen durchläuft die von Photosensibilisatoren absorbierte Energie drei Relaxationswege: Fluoreszenz, Erwärmungseffekt durch Vibrationsrelaxation und ROS-Erzeugung durch Intersystem Crossing (ISC)41. In Übereinstimmung mit der deutlich gelöschten Fluoreszenzemission förderten COS-BA/Ce6-NPs auch keinen Erwärmungseffekt in Wasser (Hintergrundinformationen, Abb. S15), was einen verstärkten ISC-Prozess nach der Coassemblierung von Ce6 mit COS-BA implizierte und somit zu einem Anstieg führte zur verbesserten 1 O2-Generation. Um den molekularen Mechanismus eines solchen Effekts weiter aufzuklären, haben wir versucht, das mögliche Einzelmolekülmodell von COS-BA/Ce6 zu optimieren und zu berechnen, das aus potenzieller pp-Stapelung besteht, die aus MD-Simulation durch Dichtefunktionaltheorie (DFT) erhalten wurde (Abb. 3C). . Erstaunlicherweise zeigte COS-BA/Ce6 eine beobachtbare rotverschobene UV-Absorption von 581,24 nm im Vergleich zu der von freiem Ce6 (579,30 nm), was auf das Auftreten einer pp-Stapelung hinweist (Abb. 3D). Obwohl die energieminimierte Geometrie von COS-BA/Ce6 geringfügige strukturelle Unterschiede zur eingegebenen MD-Konfiguration aufwies, war die charakteristische Stapelung zwischen C]C- oder C]O-Bindungen von COS-BA mit dem Porphinring von Ce6 immer noch zu beobachten, was dies weiter bestätigt über p‒p ist eine Stapelung möglich. Inzwischen wurde kürzlich gezeigt, dass die erhöhte Elektronendonoreffizienz durch p-p-Stapelung den ISC-Prozess42 erleichtern könnte, während die ISC-Rate (KISC) proportional zu (1/DEST) 2,43 ist. Das heißt, die niedrigere Energielücke (DEST) des Photosensibilisators wird den ISC-Prozess verbessern und eine effiziente ROS-Erzeugung fördern. Anschließend berechnen wir den niedrigsten angeregten Singulett-Zustand (S1) und den Triplett-Zustand (T1) von Ce6 bzw. COS-BA/Ce6 (Abb. 3E). Die Ergebnisse zeigten, dass COS-BA/Ce6 im Vergleich zu freiem Ce6 (1,2001 eV) einen verringerten DEST von 1,1892 eV aufwies, was den verbesserten ISC-Prozess bestätigt. Die Reduzierung von DEST ist hilfreich für die 1 O2-Produktion, was auch bei anderen Nanophotosensibilisatoren nachgewiesen wurde44. Zusammengenommen scheint die p-Stapelung den DEST von Ce6 nach dem Zusammenbau mit COS-BA zu verringern, was zu einer verbesserten 1 O2-Erzeugung führt.
![Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.](/Content/uploads/2023842169/20231220105921392c9765b52f4ceb80db09f348c7b92e.png "Figure 3 Energy mechanism of improved 1 O2 generation induced by COS-BA/Ce6 NPs. (A) UV Vis spectra of photodecomposition of 1,3-diphenylisobenzofuran (DPBF) after prolonged irradiation of COS-BA/Ce6 NPs. (B) In the first-order plots of DPBF UV absorption changes (DOD), the 1 O2 yield was evaluated using methylene blue (MB) (F Z 0.52) in DMSO as the reference compound. (C) Energy-minimized structures of a possible single-molecule COS-BA/Ce6 model viewed from the side and front, which was obtained according to the initial molecular configuration between Ce6 with COS-BA after MD simulation and following DFT calculations. (D) Predicted UV Vis absorption spectra transitions (vertical bars) of free Ce6 and an optimized COS-BA/Ce6 model. (E) Calculated energy levels of their lowest excited singlet state (S1) and lowest triplet state (T1), respectively, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Where DEST was calculated as ES1 ET1.")
Abbildung 3 Energiemechanismus der verbesserten 1 O2-Erzeugung durch COS-BA/Ce6-NPs. (A) UV-Vis-Spektren der Photozersetzung von 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) nach längerer Bestrahlung von COS-BA/Ce6-NPs. (B) In den Diagrammen erster Ordnung der DPBF-UV-Absorptionsänderungen (DOD) wurde die 1 O2-Ausbeute unter Verwendung von Methylenblau (MB) (FZ 0.52) in DMSO als Referenzverbindung bewertet. (C) Energieminimierte Strukturen eines möglichen Einzelmolekül-COS-BA/Ce6-Modells von der Seite und von vorne betrachtet, die gemäß der anfänglichen Molekülkonfiguration zwischen Ce6 und COS-BA nach MD-Simulation und folgenden DFT-Berechnungen erhalten wurden. (D) Vorhergesagte UV-Vis-Absorptionsspektrenübergänge (vertikale Balken) von freiem Ce6 und einem optimierten COS-BA/Ce6-Modell. (E) Berechnete Energieniveaus ihres niedrigsten angeregten Singulett-Zustands (S1) bzw. niedrigsten Triplett-Zustands (T1), [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Wobei DEST als ES1 ET1 berechnet wurde.
3.4. Merkmale der Chemotherapie-Ruhephase
Anschließend sollte das Designkonzept in der vorliegenden Studie validiert werden, wonach die Entwicklung eines amphiphilen COS-BA-Moleküls die therapeutische Wirkung von BA effektiv steigern könnte, indem die Zellaufnahme durch Erhöhung der Hydrophilie verbessert und gleichzeitig ein auf Reize reagierendes und vollständig hydrophiles COS-BA/Ce6 weiter aufgebaut wird NPs erleichterten den Ruhezustand in normalen Geweben und die Aktivierung an Tumorstellen. Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir zunächst das Arzneimittelfreisetzungsverhalten von COS-BA/Ce6-NPs in verschiedenen Pufferlösungen (Abb. 4A). Die Ergebnisse zeigten, dass COS-BA/Ce6-NPs ein pH-responsives Verhalten mit einer kumulativen Ce6-Freisetzung von 88 % bei pH 5,6 bzw. 57 % bei pH 7,4 nach 24 Stunden zeigten. Dieses Merkmal ist wahrscheinlich auf die Zerstörung zahlreicher Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen, die in COS-BA/Ce6-NPs nach der Einführung von saurem Hþ45 vorhanden waren, was zu einer erhöhten Ce6-Freisetzung führte (Abb. 4B). Dies wurde weiter durch die Zerlegung von COS-BA/Ce6-NPs nach direkter Inkubation in sauren Umgebungen bestätigt (Abb. 4C). Diese auf den pH-Wert reagierende Funktion kann aufgrund der schwach sauren Tumormikroumgebung für eine wirksame Antitumortherapie von Vorteil sein34. Unterdessen hatten COS-BA/Ce6-NPs eine bessere Stabilität, da nach 10-tägiger Inkubation in PBS und 1640-RMPI-Zellkulturmedium keine signifikanten Größen- oder PDI-Änderungen beobachtet werden konnten (Hintergrundinformationen Abb. S16), was wichtig wäre für ihre potenzielle Verwendung für weitere biomedizinische Anwendungen. Anschließend wurden weitere Untersuchungen durchgeführt, indem die Zytotoxizität von freiem lipophilem BA (Kontaktwinkel q: 133,3 ) und amphiphilem COS-BA (q: 52 ) (Abb. 4D) durch einen Standard-Methylthiazolyl-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay bewertet wurde. Wie vorhergesagt, haben einzelne COS bei relativ niedrigen Dosen weder für 4T1-Krebszellen noch für normale LO2-Hepatozyten praktisch keine Antikrebsaktivität. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass die Antiproliferationswirkung von COS über die Induktion des NF-kB-Signalwegs nur bei hohen Konzentrationen (ungefähr im Milligramm-Bereich) aktiviert wird30. COS-BA hingegen weist sogar im Vergleich zu BA (17,63 mg/ml für 4T1 und 20,53 mg/ml für LO2) eine bemerkenswert erhöhte Zytotoxizität mit extrem niedrigen IC50-Werten (6,03 mg/ml für 4T1 und 9,92 mg/ml für LO2) auf bei gleichen Massenkonzentrationen (Abb. 4E und J). Die erzielten Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die Modifikation von wasserlöslichem COS die zelluläre Aufnahmeeffizienz von lipophilem BA erheblich steigert und somit zu einer starken Antikrebsaktivität von COS-BA führt. Um die Aufnahmeeffizienz zu quantifizieren, wurde die Akkumulation von BA oder COS-BA in 4T1-Zellen direkt durch HPLC bestimmt (Hintergrundinformationen Abb. S17). Die Ergebnisse belegen eindeutig, dass amphiphiles COS-BA eine deutlich höhere Aufnahme als freies BA aufweist (ungefähr 3,6-fach nach 3-stündiger Inkubation), was die erhöhte chemotherapeutische Aktivität von COS-BA zeigt. Die obige Schlussfolgerung wurde durch die deutlich verbesserte Zytotoxizität von amphiphilem COSBA gegen HepG2- und MCF-7-Krebszellen weiter gestützt (Hintergrundinformationen Abb. S18), was gut mit dem Designkonzept übereinstimmt. Nach dem Zusammenbau mit Ce6 stellten wir fest, dass COS-BA/Ce6-NPs ohne Bestrahlung im Vergleich zum entsprechenden COS-BA eine deutlich verringerte Zytotoxizität gegenüber 4T1-Krebszellen aufweisen, insbesondere bei 11,5 mg/ml, die grundlegende PDT-Aktivität wurde jedoch nicht beeinträchtigt ( Abb. 4F). Um dieses Phänomen vollständiger zu validieren, haben wir die In-vitro-Zytotoxizität von COS-BA/Ce6-NPs gegen andere Krebszellen, einschließlich MCF-7 und HepG2, weiter untersucht. Interessanterweise zeigte amphiphiles COS-BA eine sehr stärkere Zytotoxizität gegenüber MCF-7-Zellen (Abb. 4G), aber die chemotherapeutische Aktivität nahm nach dem Zusammenbau mit Ce6, d. h. unbestrahlten COS-BA/Ce6-NPs, deutlich ab. Ähnliche Ergebnisse wurden auch bei HepG2-Zellen beobachtet, allerdings mit einer leichten Abnahme (Abb. 4H). Um die obigen Schlussfolgerungen weiter zu untermauern, haben wir auch die chemotherapeutischen Wirkungen von Nanoanordnungen und COS-BA gegen normale Maus-Fibroblasten-L929-Zellen und menschliche LO2-Hepatozyten untersucht (Abb. 4I). Die Ergebnisse zeigten, dass die zusammengesetzten COS-BA/Ce6-NPs den ursprünglichen hochtoxischen amphiphilen Wirkstoff COS-BA deutlich reduzierten und eine ausgezeichnete Biokompatibilität zeigten. Bei der Analyse der Zytotoxizität waren die IC50-Werte des amphiphilen COS-BA signifikant niedriger als die der koassemblierten COS-BA/Ce6-NPs, unabhängig von Krebs oder normalen Zellen (Abb. 4J). Das heißt, durch den Aufbau vollständig hydrophiler und auf Reize reagierender Nanokoassemblierungen kann die hohe Zytotoxizität des amphiphilen Arzneimittels COS-BA bereits im Vorfeld wirksam unterdrückt werden. In Anbetracht der charakteristischen pH-responsiven Eigenschaft scheint es, dass COS-BA/Ce6-NPs in normalen Geweben mit der gewünschten geringen Chemotherapie-Toxizität ruhen, in Tumorgeweben jedoch aufgrund ihrer stimulierenden Freisetzung von hochtoxischem COS-BA im schwach sauren Tumor aktiv sind Mikroumgebung. Zusammengenommen weisen amphiphile COS-BA-vermittelte Nanoanordnungen im Gegensatz zur vielfach berichteten Neofunktionalisierung chemotherapeutischer Reagenzien, die eine erhöhte Antikrebsaktivität aufweisen, nicht nur eine intelligente „Ruhe“-Eigenschaft mit heimtückischen Chemotherapieeffekten auf, sondern behalten auch eine spezielle PDT-Aktivität bei, was ein enormes Potenzial darstellt für eine intelligente Antitumortherapie.
Abbildung 4 (A) In-vitro-Ce6-Freisetzungsprofile aus COS-BA/Ce6-NPs in PBS (pH 7,4, 6,5 oder 5,6), das Tween 80 (0,5 %, v/v) enthält 37 C. (B) Der mögliche pH-responsive Mechanismus, der Hþ die Zerlegung von NPs auslöst. (C) Die Zerlegung von COS-BA/Ce6-NPs nach direkter Inkubation in Wasser mit etwa pH 4.0. (D) Der Kontaktwinkel von freien BA-, Ce6-, COS-BA- bzw. COS-BA/Ce6-NPs. (E) Zellzytotoxizität von freiem BA, COS und amphiphilem COS-BA gegen repräsentative Krebs-4T1- und normale LO2-Zellen. Zelllebensfähigkeit von (F) 4T1-, (G) MCF-7-, (H) HepG2-Krebszellen nach Inkubation mit freiem COS-BA, COS-BA/Ce6-NPs mit/ohne Bestrahlung bei der angegebenen äquivalenten COS-BA-Konzentration für 24 Std. (I) Zellzytotoxizität von freien COS-BA, nicht bestrahlten COS-BA/Ce6-NPs gegenüber normalen LO2- und L929-Zellen. (J) Die IC50-Analyse von COS-BA gegen Krebs und normale Zellen. Die Daten werden als Mittelwerte SD (n Z 6) ausgedrückt. *P ˂ 0.05, **P ˂ 0.01 und ***P ˂ 0.001 zeigen die signifikanten Unterschiede.
Um die möglichen Gründe für diese Chemotherapie-Ruhecharakteristik zu untersuchen, wurde das zeitabhängige zelluläre Aufnahmeverhalten von COS-BA/Ce6-NPs nacheinander durch Inkubation mit 4T1-Krebszellen bewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass COS-BA/Ce6-NPs zwar eine bemerkenswerte Fluoreszenzlöschung aufwiesen, aber im Vergleich zu freiem Ce6 aufgrund der stärkeren zytoplasmatischen roten Fluoreszenz immer noch eine erhöhte phagozytische Effizienz zeigten, wie durch quantitative Durchflusszytometrieanalyse bestimmt (Abb. 5A). Diese verbesserte zelluläre Internalisierung von NPs kann der Endozytose zugeschrieben werden21. Insgesamt spekulierten wir, dass, obwohl hochwasserlösliche COS-BA/Ce6-NPs (Kontaktwinkel q: 36,7 ) eine verbesserte zelluläre Endozytose als lipophiles Ce6 (q: 132,6, nahe BA) zeigten, die Phagozytoseeffizienz verringert war NPs könnten im Vergleich zu amphiphilen COS-BA-Molekülen auftreten und somit die chemotherapeutische Zytotoxizität von COS-BA/Ce6-NPs zu unterdrücken scheinen. Das heißt, die Zellaufnahmeeffizienz von hoch nach niedrig in der folgenden Reihenfolge: amphiphiles COS-BA, hydrophile COS-BA/Ce6-NPs, lipophiles BA oder Ce6. Noch wichtiger ist, dass die unzureichende Zerlegung zellulärer NPs ein weiterer wichtiger Grund für die abgeschwächte chemotherapeutische Wirkung sein könnte, die alle mit der intelligenten Chemotherapie-Ruhezeit von COS-BA/Ce6-NPs zusammenhängen könnten. Da der Abbau von NPs speziell in der sauren Umgebung von Tumorzellen durchgeführt wurde, haben wir außerdem versucht, die Aufnahmeeffekte von COS-BA/Ce6-NPs in normalen LO2-Zellen zu vergleichen, um die pH-Reaktionsfunktion zu demonstrieren (Abb. 5B). . Allerdings zeigten COS-BA/Ce6-NPs keine signifikant gehemmte Ce6-Rotfluoreszenz in LO2-Zellen. Im Gegensatz dazu ähnelte das Aufnahmeverhalten von LO2 dem von 4T1-Krebszellen, was darauf hindeutet, dass COS-BA/Ce6-NPs auch in normalen Zellen zerfallen können, was auf die im Inneren vorhandenen intrazellulären Kompartimente (Endosomen/Lysosomen) mit schwach saurem pH-Wert zurückzuführen sein könnte sowohl Krebszellen als auch normale Zellen46. Da die zelluläre Aufnahme von NPs vom Prozess der Endozytose abhängt, kann es sein, dass die direkte Arzneimittelinkubation die pH-Reaktionsfähigkeit von COS-BA/Ce6-NPs auf zellulärer Ebene nicht hervorhebt. Dennoch ist die Tumormikroumgebung (TME) im Vergleich zu normalem Gewebe stark sauer47. Unabhängig von intrazellulärem oder TME-Krebs können COS-BA/Ce6-NPs auf den pH-Wert reagieren und zerlegt werden, um die Freisetzung von hochtoxischem COS-BA auszulösen. In normalen Geweben hingegen konnten COS-BA/Ce6-NPs erst nach Eintritt in eine normale Zellumgebung zerlegt werden, was die Wahrscheinlichkeit einer COSBA-Freisetzung verringerte. Daher schließen wir, dass die Chemotherapie-Ruheeigenschaften von COS-BA/Ce6-NPs für die Tumormikroumgebung gültig und zuverlässig sind und dass die Designidee in der vorliegenden Studie realisierbar ist.
3.5. In-vitro-Chemotherapie/PDT-Antikrebswirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs
Darüber hinaus untersuchen wir vor der detaillierten In-vitro-Chemotherapie/PDT-Antikrebswirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs und zur weiteren Aufdeckung des Endozytosemechanismus die vier Hauptendozytosewege durch Zugabe entsprechender endozytischer Inhibitoren, einschließlich Chlorpromazin (Clathrin-vermittelt), Chloroquinphosphat ( Lysosomen-Ansäuerungshemmer), Nystatin (Caveolae-vermittelt) und ein Makropinozytose-Hemmer EIPA (Ethylisopropylamilorid) (Abb. 5C und D). Wir beobachten, dass die Einführung von Nystatin und Chlorpromazin die phagozytische Effizienz wirksamer hemmen könnte als EIPA und Chloroquinphosphat, was zu einer deutlich verringerten Zellfluoreszenz im Vergleich zu normalem 37 °C führt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass COS-BA/Ce6-NPs durch mehrere Mechanismen internalisiert wurden, hauptsächlich durch die Clathrin- und Caveolae-vermittelten Endozytosewege. Aufgrund der erhöhten 1 O2-Erzeugung durch intermolekulare Wechselwirkungen weisen COS-BA/Ce6-NPs eine deutlich höhere interzelluläre ROS-Ausbeute auf als Ce6, was durch die stärkere grüne Fluoreszenz der DCFH-Sonde angezeigt wird (Abb. 5E), was auf eine höhere photodynamische Effizienz schließen lässt. MTT-Assays zeigen, dass COS-BA/Ce6-NPs unter Bestrahlung eine deutlich stärkere Hemmwirkung auf 4T1-Zellen ausüben als äquivalentes Ce6, während sie ohne Bestrahlung eine relativ moderate Zytotoxizität aufweisen (Abb. 5F). Bezeichnenderweise war der IC50 von Ce6 (0,53 mg/ml) in COS-BA/Ce6-NPs viel niedriger als der von freiem Ce6 (1,39 mg/ml) (Abb. 5G), was auf eine deutlich verbesserte PDT-Wirksamkeit schließen lässt Dies wird auch durch die Zytotoxizität von COSBA/Ce6-NPs gegen menschliche MCF-7- und HepG2-Krebszellen perfekt demonstriert (Hintergrundinformationen, Abb. S19). Ebenso wurden im Vergleich zu freiem Ce6 auch die relativ niedrigeren IC25-, IC50- und IC75-Werte in Co-Assemblies beobachtet (Abb. 5G). Im Vergleich zu Ce6-PDT allein und einer einzelnen Chemotherapie von NPs im Dunkeln erzielten COS-BA/Ce6-NPs unter Bestrahlung eine wirksamere kombinierte Chemotherapie/PDT gegen die oben genannten drei Krebszellen und zeigten einen Synergismus (Kombinationsindex: CI ˂ 1) ( Abb. 5I). Darüber hinaus bestätigte die Fluoreszenz-Doppelfärbung lebender/toter Zellen mit Calcein-Acetoxymethylester (Calcein-AM) und Propidiumiodid (PI) weiter, dass COS-BA/Ce6-NPs effizient Zellapoptose und -nekrose induzieren konnten, da die behandelten Zellen nahezu gefärbt waren mit rotem PI-Fluoreszenzsignal, wenn nach der Bestrahlung weitere 10 Stunden lang kultiviert wird (Abb. 5H). In der Zwischenzeit zeigten auch unbestrahlte COS-BA/Ce6-NPs (höhere Dosis Ce6: 3,2 mg/ml) eine gewisse chemotherapeutische Aktivität, was durch die gleichzeitigen AM- und PI-Signale sichtbar wurde. Diese bemerkenswert verbesserte PDT-Aktivität von COS-BA/Ce6-NPs wurde durch die AM/PI-Färbung nach einer weiteren 20-stündigen Behandlung weiter bestätigt (Hintergrundinformationen, Abb. S20). Darüber hinaus implizierte die offensichtlich erhöhte Lebensfähigkeit der Zellen dies, wenn Natriumazid (SA) und D-Mannitol (DM), ein separater spezieller Quencher von 1 O2 und $OH48, zu den COS-BA/Ce6 NPs-PDT-behandelten 4T1-Zellen hinzugefügt wurden Photoreaktionen vom Typ I ($OH) und Typ II (1 O2) fanden gleichzeitig im COSBA/Ce6-NP-vermittelten PDT-Prozess statt (Abb. 5J). Darüber hinaus weisen COS-BA/Ce6-NPs insbesondere eine bessere Blutverträglichkeit auf, was durch die vernachlässigbare Hämolyse roter Blutkörperchen angezeigt wird (Abb. 5K), was auf das Potenzial für biomedizinische Anwendungen durch intravenöse Verabreichung schließen lässt.
3.6. In-vivo-Bioverteilung von COS-BA/Ce6-NPs
Anschließend, vor der In-vivo-Verteilungsuntersuchung, beurteilten wir als nächstes die Pharmakokinetik von COS-BA/Ce6-NPs, indem wir die Ce6-Konzentration im Blut nach intravenöser Injektion mit äquivalenten Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs überwachten. Die Ce6-Konzentrations-Zeit-Profile im Blut (Abb. 6A) und die vergleichenden pharmakokinetischen Parameter (Tabelle S1 mit Hintergrundinformationen) belegen eindeutig, dass COS-BA/Ce6-NPs eine längere Zirkulation im Blutkreislauf haben, was eine stärkere Anreicherung am Tumor ermöglichen könnte Websites. Insbesondere COS-BA/Ce6-NPs zeigten eine schnelle Bluteliminierung innerhalb von 2 Stunden, was auf eine günstige biologische Abbaubarkeit schließen lässt. Dementsprechend untersuchten wir anschließend die In-vivo-Bioverteilung und die Fähigkeit zur Tumorakkumulation von COS-BA/Ce6-NPs (Abb. 6B und C). Ähnlich wie allgemein beschriebene Ce6-Nanokomposite33 können COS-BA/Ce6-NPs schnell im gesamten Körper verteilt werden. Insbesondere während der ersten 4 Stunden zeigten die Anordnungen offensichtlich eine stärkere Fluoreszenzemission an Tumorstellen als freies Ce6, was auf eine verbesserte Retention und tumorgezielte Akkumulierungsfähigkeit von COS-BA/Ce6-NPs schließen lässt, die wahrscheinlich auf den passiven EPR-Effekt (Enhanced Permeability Retention) zurückzuführen ist bereitgestellt durch die Nanopartikel14. Sechs Stunden nach der Injektion nahm die Fluoreszenzintensität an den Tumorstellen allmählich und schnell ab. Bemerkenswerterweise zeigten COS-BA/Ce6-NPs im Gegensatz zu den häufig berichteten Nanokompositen mit deutlich erhöhter Tumorakkumulation im Vergleich zum freien positiven Arzneimittel29 24 Stunden nach der Injektion keine sehr deutliche Akkumulation an Tumorsitzen als freies Ce6 (Abb. 6C), was der Fall war weiter unterstützt durch die Bildgebung des herausgeschnittenen Tumors (Abb. 6D und E). Die hervorragende biologische Abbaubarkeit von NPs könnte für die Einführung natürlicher kleiner organischer Moleküle verantwortlich sein. Dies wurde auch bei anderen durch kleine Moleküle vermittelten Nanoanordnungen von Terpenoiden beobachtet49. Darüber hinaus zeigten COS-BA/Ce6-NPs auch eine ähnliche Gewebeverteilung wie freies Ce6 (Abb. 6E), und die durchschnittliche Fluoreszenzintensität ex vivo war im Allgemeinen niedriger als die in vivo dargestellte, was weiter auf eine gute biologische Abbaubarkeit hindeutet. Unter Berücksichtigung des engen Fluoreszenzniveauunterschieds zwischen 2 und 4 Stunden nach der Injektion von NPs und Ce6 sowie der experimentellen Durchführbarkeit, die ausreichende Intervalle für die Bestrahlung ermöglicht, wurde außerdem 4 Stunden nach der Verabreichung als Lichtzeitpunkt für die nachfolgende PDT-Therapie gewählt.
In Anbetracht der im Vergleich zu freiem Ce6 nach 24 Stunden nicht sehr ausgeprägten Tumorakkumulation haben wir zur weiteren Validierung des erhöhten EPR-Effekts, den COS-BA/Ce6-NPs haben, sofort die Ex-vivo-Fluoreszenzbilder von Tumoren zu verschiedenen Zeitpunkten nach der intravenösen Injektion von Nanoarzneimitteln überwacht ( Abb. 6F und G). Bemerkenswerterweise zeigten COS-BA/Ce6-NPs entweder 20 Minuten oder 12 Stunden nach der Injektion tatsächlich eine stärkere Fluoreszenzemission an Tumorstellen als freies Ce6, was eine ausgezeichnete und verbesserte Fähigkeit zur Tumorakkumulation demonstrierte. Mittlerweile schwächten sich mit der Zeit die im Tumorgewebe verbliebenen Fluoreszenzintensitäten allmählich ab (Abb. 6G), was völlig mit den Ergebnissen der In-vivo-Fluoreszenzbildgebung bei Tieren übereinstimmt. Dieser schnelle biologische Stoffwechsel und die verstärkte Tumorakkumulation verhinderten eindeutig eine potenzielle langfristige Akkumulationstoxizität und gewährleisteten eine hocheffiziente Antitumortherapie mit besserer Biosicherheit.
Abbildung 5 In-vitro-Antikrebswirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs. Zelluläre Internalisierung von (A) 4T1-Krebszellen und (B) normalen LO2-Zellen, die in freien Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs für 0,5 und 3 Stunden inkubiert wurden, und entsprechende durchflusszytometrische Analyse der Fluoreszenzintensität. (C) Aufnahmehemmung spezifischer endozytischer Signalwegstudien und (D) entsprechende Fluoreszenzintensität von Zellen, gemessen durch Durchflusszytometrie nach Inkubation mit COSBA/Ce6-NPs mit/ohne endozytische Inhibitoren, einschließlich Chlorpromazin, Chloroquin, Nystatin und Ethylisopropylamilorid (EIPA). Maßstabsbalken Z 20 mm. (E) Zelluläre ROS-Erzeugung, induziert durch freie Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs (äquivalentes Ce6: 1,6 mg/ml). Maßstabsbalken Z 20 mm. (F) Zelllebensfähigkeit von 4T1-Zellen nach verschiedenen Behandlungen für 24 Stunden. (G) Die IC25-, IC50-, IC75-Analyse von freien Ce6- und COS-BA/Ce6-NPs gegen 4T1-, MCF-7- bzw. HepG2-Zellen. (H) Calcein-AM/Propidiumiodid (PI) Lebend-/Totfärbung von mit COS-BA/Ce6-NPs (Ce6: 1,6 mg/ml) behandelten 4T1-Zellen nach weiterer 10-stündiger Inkubation sowie nicht bestrahlter COS- BA/Ce6-NPs (Ce6: 3,2 mg/ml). Maßstabsbalken Z 50 mm. (I) Kombinationsindex (CI) von COS-BA/Ce6-NPs auf 4T1-, MCF-7- und HepG2-Zellen, bestimmt durch Berechnung des Chou Talalay-Theorems. (J) PDT-Mechanismen (Typ I und Typ II), die durch Bestrahlung von COS-BA/Ce6-NPs induziert und durch spezifische 1 O2- und $OH-Löscher Natriumazid (SA) bzw. D-Mannitol (DM) bewertet werden. (K) Prozentuale Hämolyse der roten Blutkörperchen nach 4-stündiger Inkubation mit COS-BA/Ce6-NPs. Die Daten werden als Mittelwerte SD (n Z 3) ausgedrückt. *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 und ***P ˂ 0,001 zeigen die signifikanten Unterschiede.
Abbildung 6 In-vivo-Blutzirkulation und Bioverteilung von COS-BA/Ce6-NPs. (A) Ce6-Konzentrations-Zeit-Profile im Blut nach iv-Injektionen von äquivalentem Ce6 oder koassemblierten COS-BA/Ce6-NPs (n Z 3). (B) Ganzkörper-Fluoreszenzbilder von 4T1-tumortragenden Mäusen nach iv-Injektionen der angegebenen Medikamente zu verschiedenen Zeitpunkten. (C) Durchschnittliche Fluoreszenzintensität, die von den Tumorstellen in (B) erhalten wurde. (D) Ex-vivo-Fluoreszenzbilder von Tumoren und Hauptorganen, die nach 24 Stunden aus den oben genannten Mäusen herausgeschnitten wurden, und entsprechendes (E) quantitatives Ergebnis der Fluoreszenzintensität (n Z 3). (F) Ex-vivo-Fluoreszenzbilder von Tumoren und wichtigen Organen zu verschiedenen Zeitpunkten nach iv-Injektionen von Ce6- oder COS-BA/Ce6-NPs und (G) entsprechende Fluoreszenzintensitätsanalyse von Tumoren. Die Daten werden als Mittelwerte SD (n Z 3) ausgedrückt.
3.7. In-vivo-Chemotherapie/PDT-kombinatorische Antitumorbehandlung
Motiviert durch die einzigartige Ruheeigenschaft, gute biologische Abbaubarkeit und PDT-Aktivität wurde die In-vivo-Chemotherapie/PDT-Kombinations-Antitumortherapie untersucht. 4T1-tumortragende Mäuse wurden nach dem Zufallsprinzip in 6 Gruppen eingeteilt und ihnen wurde alle 2 Tage insgesamt drei Dosen intravenös mit äquivalentem Ce6 (3,5 mg/kg Körper) injiziert. 4 Stunden nach der Injektion wurden die Tumorstellen der Mäuse in den Lichtgruppen 15 Minuten lang bestrahlt (Abb. 7A). In der Zwischenzeit wurden jeden zweiten Tag die entsprechenden Tumorvolumina oder Körpergewichte aufgezeichnet. Nach 14-tägiger Behandlung (Abb. 7B) waren freies Ce6 mit Bestrahlung und freies COS-BA bei der Tumorsuppression unwirksam, was wahrscheinlich auf die begrenzte Medikamentenakkumulation im Tumorgewebe zurückzuführen ist. Im Gegensatz dazu wurde nach der Bestrahlung von COS-BA/Ce6-NPs die deutlichste Tumorhemmung beobachtet, was die hervorragende Effizienz der Chemotherapie/PDT-Kombination bestätigt. Die durchschnittlichen Tumorgewichte (Abb. 7D) und die entsprechenden Fotos von sezierten Tumoren (Abb. 7E) zeigten beide die beste Antitumorwirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs unter Bestrahlung, da behandelte Mäuse die kleinsten Tumorgrößen aufwiesen als diejenigen anderer Gruppen. Das mittlere Tumorhemmungsverhältnis von PDT-behandelten COS-BA/Ce6-NPs erreichte 80,3 % und war damit höher als das von freiem Ce6-PDT (42,4 %) und freiem COS-BA (38,5 %). Obwohl frühere In-vitro-Studien gezeigt haben, dass COS-BA/Ce6-NPs ohne Licht eine ruhende Funktion der chemotherapeutischen Aktivität zeigten, weisen sie im Vergleich zu freiem COS-BA immer noch eine erhöhte Antitumoreffizienz (49,5 %) auf (Abb. 7D). Wir vermuteten, dass zwei mögliche Gründe zu diesem Ergebnis beitragen: Der eine ist die höhere Akkumulation von COS-BA/Ce6-NPs im Tumor aufgrund des weithin berichteten EPR-Effekts. Ein weiterer Faktor ist die schwach saure Mikroumgebung des Tumors, die die Freisetzung von hochtoxischem COS-BA stimuliert. Aufgrund der höheren kritischen Mizellenkonzentration (CMC, 187 mg/ml) von COS-BA (Hintergrundinformationen Abb. S21) könnte es im Monomerzustand in der Tumorumgebung vorliegen und somit die verbesserte Chemotherapie von nicht bestrahltem COS-BA begünstigen. BA/Ce6-NPs. Um die überlegene Antikrebswirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs weiter zu verifizieren, wurde außerdem eine Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) von Tumoren durchgeführt (Abb. 7G).
Abbildung 7 Wirksamkeitsstudie mit einem subkutanen 4T1-Xenotransplantatmodell. (A) Schematische Darstellung der In-vivo-PDT-Behandlung. (B) Tumorwachstumsprofile, (C) Veränderungen des Körpergewichts und (D) herausgeschnittene Tumorgewichte mit Tumorhemmverhältnissen von 4T1-tragenden Mäusen nach verschiedenen Behandlungen in den angegebenen Gruppen (n Z 5 für jede Gruppe). (E) Bilder von herausgeschnittenen Tumoren von repräsentativen Mäusen nach der Behandlung. (F) Analyse der Serumbiochemie nach 14-tägiger Behandlung mit COS-BA/Ce6-NPs. (G) Repräsentative H&E-Färbung exzidierter Tumorabschnitte nach verschiedenen Behandlungen. Maßstabsbalken Z 50 mm. (H) TUNEL-Färbung von PDT-behandelten Tumorabschnitten mit freiem Ce6 und COS-BA/Ce6-NPs. Maßstabsbalken Z 20 mm **P < 0,01 zeigt die signifikanten Unterschiede an.
Die Ergebnisse zeigten, dass mit COS-BA/Ce6-NPs-PDT behandelte Tumorabschnitte eine schwerwiegende Gewebeschädigung und Kernmangel aufwiesen, während in den anderen Gruppen eine mäßige Gewebenekrose beobachtet wurde. Gleichzeitig erhöhten COS-BA/Ce6-NPs unter Bestrahlung im Vergleich zu freiem Ce6-Licht die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen deutlich, die eine stärkere braune Kernfärbung zeigten (Abb. 7H), was die hervorragende Chemotherapie/PDT-Kombinationstherapie weiter bestätigt. Darüber hinaus wurden in allen Gruppen keine offensichtlichen Unterschiede im Körpergewicht beobachtet (Abb. 7C). Selbst wenn die COSBA/Ce6-NPs oder Ce6-Light-Gruppen während der Verabreichung einen geringfügigen Verlust an Körpergewicht aufwiesen, normalisierten sich die Körpergewichte nach einigen Tagen wieder. In den am Ende der Behandlungen entnommenen Hauptorganen konnten keine offensichtlichen Schäden oder entzündlichen Läsionen festgestellt werden (Hintergrundinformationen, Abb. S22), was beides auf eine geringe/keine systemische Toxizität und eine gute biologische Sicherheit von COS-BA/Ce6-NPs hinweist. Obwohl COS-BA/Ce6-NPs hauptsächlich im Lebergewebe akkumuliert werden, zeigten die entsprechenden Leberfunktionsmarker (ALT, AST und ALP) darüber hinaus keine signifikanten Veränderungen im Vergleich zu normalen gesunden Mäusen (Abb. 7F), was auf eine bessere Biokompatibilität schließen lässt. Darüber hinaus schienen auch die Nierenfunktionsmarker (BUN, CRE und UA) und biochemischen Parameter (ALB und TBIL) denen normaler Mäuse ähnlich zu sein, was weiter auf eine bessere Biosicherheit hindeutet. Es ist klar, dass diese Prodrug-organischen COS-BA-vermittelten Coassemblys kleiner Moleküle (COS-BA/Ce6-NPs) mehrere vorteilhafte therapeutische Eigenschaften besitzen, die attraktive Möglichkeiten für Anwendungen in der klinischen Medizin eröffnen.
3.8. Antitumorimmunität durch kombinierte Chemotherapie/PDT und Anti-PD-L1-Blockade
Kürzlich haben zahlreiche innovative Studien gezeigt, dass die Kombination der Krebsimmuntherapie mit anderen Behandlungsmodalitäten effektiv tumorspezifische Immunantworten auslösen kann, um primäre oder entfernte Tumoren zu eliminieren1. Ermutigt durch die einzigartige Chemotherapie-Ruhefunktion und die hervorragende Chemotherapie/PDT-Antitumorwirksamkeit von COS-BA/Ce6-NPs fragen wir uns daher, ob sie mit Hilfe eines Immunadjuvans Anti-PD-L1 auch immunologische Reaktionen auslösen könnten, um eine hocheffiziente Antitumortherapie zu bewirken . Könnte es entfernte Tumoren behandeln, die nicht direkt mit der PDT-Behandlung behandelt werden können, und so eine alternative Strategie für klinische Krebsanwendungen bieten? Um diese Hypothese zu testen, wurde in dieser Studie ein „Zwei-Tumoren“-Modell erstellt und detaillierte Versuchsabläufe wurden in Abb. 8A dargestellt. Typischerweise wurden zwei 4T1-Tumoren sowohl in die linke als auch in die rechte Flanke jeder Maus geimpft. Da Anti-PD-L1 allein keine auffällige immuntherapeutische Wirkung hat50, wurden die Experimente in fünf Gruppen aufgeteilt, darunter eine unbehandelte Gruppe, COS-BA/Ce6-NPs, COS-BA/Ce6-NPs mit Anti-PD-L1, COS- BA/Ce6-NPs mit Licht, COS-BA/Ce6-NPs mit Licht und Anti-PD-L1. Nach einer einzelnen iv-Injektion von NPs (Ce6: 3,5 mg/kg) wurden die rechten Tumoren (Primärtumor) in den Lichtgruppen 15 Minuten lang bestrahlt, um die immunologischen Wirkungen von PDT/Chemotherapie zu bewerten, während die linken Tumoren (entfernte Tumoren) in allen Gruppen ohne Behandlung wurden für eine individuelle Chemotherapie ausgewählt. Anschließend wurde den Mäusen in den Immungruppen an den Tagen 2, 4 und 6 insgesamt drei Dosen iv mit Anti-PD-L1-Antikörper (15 mg pro Maus und Injektion) injiziert. Unabhängig von der PDT-Behandlung könnten COS-BA/Ce6-NPs plus Anti-PD-L1 das Fortschreiten des Primärtumors wirksam hemmen (Abb. 8B). Und die entsprechenden durchschnittlichen Tumorhemmungsverhältnisse erreichten einzeln 86,7 % (Bestrahlung) und 76,5 % (keine Bestrahlung), weitaus höher als bei einer individuellen Chemotherapie (5,7 %) oder Chemotherapie/PDT-Behandlung (27,4 %) (Abb. 8C). . Die Fotografien von sezierten Tumoren (Abb. 8D) und 4T1-tragenden Mäusen (Hintergrundinformationen Abb. S23) nach 14 Tagen Behandlung stützten die obige Schlussfolgerung auch visuell. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sowohl NP-basierte Chemotherapie als auch Chemotherapie/PDT die Antitumorimmunität wirksam aktivieren können. Am auffälligsten ist, dass Anti-PD-L1-Blockade plus NPs auch eine bemerkenswerte Tumorhemmwirkung auf nicht bestrahlte entfernte (linke) Tumoren hatten (Abb. 8E und F), die im Allgemeinen stärker war als COS-BA/Ce6-NPs allein, was der Fall war Dies wird auch durch die entsprechenden sezierten Tumore und Mäusebilder nach der Behandlung bestätigt (Abb. 8D und Abb. S23), was die effiziente Antitumor-Immunantwort, die durch COS-BA/Ce6-NPs induziert wird, weiter demonstriert.
Um diese effiziente Antitumor-Immunantwort vollständig zu erforschen, wurden zytotoxische CD8þ-T-Lymphozyten (CTLs), ein kritischer Immunozyten für die Krebsimmuntherapie4, weiter untersucht, indem die Immunzellen im rechten oder linken Tumor nach 14-tägiger Behandlung analysiert wurden. Es wurde festgestellt, dass COS-BA/Ce6-NPs plus Anti-PD-L1 mit oder ohne PDT-Behandlung eine robuste CD8þ-CTL-Infiltration in den Primärtumoren induzierten (Abb. 8H und J). Die CD8þ-CTL-Infiltration betrug nach COS-BA/Ce6-NPs-basierter Chemotherapie/PDT plus Anti-PD-L1-Behandlung bis zu 11,3 %, etwas höher als bei COS-BA/Ce6 NPs plus Anti-PD-L1 (9,63 %). viel höher als in anderen Gruppen ohne Anti-PD-L1, einschließlich Behandlung mit COS-BA/Ce6-NPs-basierter Chemotherapie (5,12 %) oder Chemotherapie/PDT allein (4,07 %). In ähnlicher Weise wurde im Vergleich zu nichtimmunen Gruppen auch bei Mäusen nach COS-BA/Ce6-NPs plus AntiPD-L1 mit oder ohne PDT-Behandlung eine signifikant erhöhte CTL-Infiltration in den linken (entfernten) Tumoren beobachtet (Abb. 8I und K). Dies impliziert hochwirksame Immunantworten, die durch Chemotherapie oder Chemotherapie/PDT-Kombinationstherapie induziert werden. In der Zwischenzeit führten nach der Einführung von Anti-PD-L1 sowohl die COS-BA/Ce6--basierte Chemotherapie als auch die Chemotherapie/PDT zu einer starken Produktion mehrerer Zytokine, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der zytotoxischen Funktionen von CTLs8, einschließlich Tumoren, spielen Nekrosefaktor-Alpha (TNF-a) (Abb. 8L) und Interferon-Gamma (IFN-g) (Abb. 8M) in den Serumproben von Mäusen nach 14-tägiger Behandlung, was ein weiterer Beweis dafür ist, dass es wirksame Antitumor-Immunantworten gab. Darüber hinaus wurden in verschiedenen Behandlungsgruppen keine offensichtlichen Veränderungen des Körpergewichts beobachtet (Abb. 8N), was auf die günstige biologische Sicherheit dieser kombinierten Chemotherapie/PDT/Immuntherapie hinweist. Insgesamt stellten wir fest, dass Anti-PD-L1-plus-COSBA/Ce6-NPs mit Licht eine etwas höhere Tumorhemmungsrate (86,7 %) als die nicht bestrahlte Gruppe (76,5 %) gegenüber den richtigen Tumoren zeigten Aufgrund des Einflusses der PDT (Abb. 8B‒D) wurden keine signifikanten Unterschiede in der therapeutischen Wirkung auf die linken Tumoren in Gegenwart (77,8 %) oder Abwesenheit (78,4 %) der PDT beobachtet (Abb. 8E‒G). Wir vermuten, dass die folgenden möglichen Gründe zu diesem Phänomen führen können. Erstens haben sich häufende Studien zum Mechanismus der Chemotherapie oder PDT zur Verstärkung der immunologischen Wirkungen der Anti-PD-L1-Checkpoint-Blockade gezeigt, dass diese Behandlungsmodalitäten eine akute Entzündung im Tumorbereich auslösen und dadurch die Präsentation tumorassoziierter Antigene gegenüber T. erhöhen können Zellen, wodurch Krebszellen dazu veranlasst werden, ICD8,9 zu durchlaufen. Tumorzellen, die sich einer ICD unterziehen, würden „Eat Me“-Signale hochregulieren, indem sie das Calreticulin (CRT) auf den Oberflächen immunogen absterbender Tumorzellen freilegen, und „Danger“-Signale durch die Freisetzung von High-Mobility Group Box 1 (HMGB1), was die Aktivierung dendritischer Zellen fördert um CTLs zu aktivieren, deren Aktivität durch Anti-PD-L1 verstärkt werden könnte, was zu einer deutlich verbesserten Immuntherapie gegen Krebs führen könnte51.
Abbildung 8 Antitumorwirkung einer auf COS-BA/Ce6-NPs basierenden Chemotherapie/PDT plus Checkpoint-Blockade-Anti-PD-L1-Immuntherapie. (A) Schematische Darstellung einer CNPs-basierten Chemotherapie/PDT mit Anti-PD-L1-Therapie. (BeD) (B) Die Tumorwachstumsprofile, (C) durchschnittliche Tumorgewichte und (D) Bilder von herausgeschnittenen Tumoren von repräsentativen Mäusen für Primärtumoren (rechts) nach verschiedenen Behandlungen für 14 Tage, wie angegeben. (EeG) (E) Die Tumorwachstumskurven, (F) durchschnittliche Tumorgewichte und (G) Bilder von herausgeschnittenen Tumoren für nicht bestrahlte entfernte (linke) Tumoren nach verschiedenen Behandlungen wie angegeben. (H) Populationen von CD8þ-T-Zellen in rechten Tumoren und (J) Prozentsätze der CTL-Infiltration wurden nach 14 Tagen Behandlung quantitativ durch Durchflusszytometrie nachgewiesen. (I, K) Populationen von CD8þ T-Zellen in linken Tumoren am Tag 14 wurden quantitativ durch Durchflusszytometrie nachgewiesen (n Z 3). Sekretion von Zytokinen in Seren nach 14-tägiger Behandlung, einschließlich (L) IFN-g und (M) TNF-a, gemessen durch ELISA-Assay (n Z 3). (N) Veränderungen des Körpergewichts von Mäusen während verschiedener Behandlungen. *P < 0.05, **P < 0.01 und ***P < 0,001 zeigen die signifikanten Unterschiede.
Zweitens konnten in dieser Arbeit COS-BA/Ce6-NPs gleichzeitig auf den linken und rechten Tumor verteilt werden, wobei sowohl die linke Chemotherapie als auch die rechte Chemotherapie/PDT ein großes Potenzial haben, Tumorzellen zu induzieren, die sich einer ICD unterziehen. Mittlerweile werden COS-BA/Ce6-NPs nur in einer Dosis verabreicht, die Immuntherapie hängt hauptsächlich von drei Dosen Anti-PD-L1 ab, ob Chemotherapie oder Chemotherapie/PDT, sie sind nur Primer. Die therapeutischen Unterschiede bei der Induktion von Tumorzell-ICD zwischen individueller Chemotherapie und kombinierten Chemotherapie/PDT-Behandlungen sind möglicherweise nicht sehr ausgeprägt. Der Prozentsatz der CD8þ-CTLs im linken (Abb. 8I und K) und rechten Tumor (Abb. 8H und J) stützte ebenfalls die obige Spekulation. Es wurde kein signifikanter Unterschied bei den CD8þ-CTLs in Gegenwart oder Abwesenheit von PDT beobachtet. Daher erzielten COS-BA/Ce6-NPs plus Anti-PD-L1 mit oder ohne Bestrahlung eine ähnliche Antikrebswirksamkeit gegen die linken Tumoren. Da 4T1-Zellen darüber hinaus geringe PD-L152-Spiegel exprimieren, wurde weithin nachgewiesen, dass Anti-PD-L1 allein eine auffällige immuntherapeutische Wirkung auf 4T1-Brustkrebs hat53,54. Obwohl die durch COS-BA/Ce6-NPs vermittelten ICD-Effekte weitere Untersuchungen erfordern, haben die präsentierten Ergebnisse gezeigt, dass COS-BA/Ce6-NPs mit Unterstützung von Anti-PD-L1 bemerkenswert verstärkte Immunantworten erzielen. Insgesamt scheint es, dass COS-BA/Ce6-NPs tatsächlich die Krebsimmuntherapie von Anti-PD-L1 verstärkten und nicht nur eine Kombinationstherapie. Obwohl Anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6-NPs mit oder ohne PDT-Behandlung keine signifikanten Unterschiede in der therapeutischen Wirkung zeigten, zeigten beide offensichtlich eine erhöhte Antitumorwirksamkeit im Vergleich zu einer Dosis COS-BA/Ce6-NPs. Das heißt, selbst wenn ohne Lichtbehandlung nach Einführung des Immunadjuvans AntiPD-L1 die Immunogenität von Tumorrückständen nach einer Chemotherapie mit COS-BA/Ce6-NPs gesteigert werden kann, was zu bemerkenswerten systemischen Antitumor-Immunantworten und damit zu einer wirksamen Unterdrückung führt von primären oder entfernten Tumoren. Daher sollte es möglich sein, Primär- und Metastasentumoren während der klinischen Krebsimmuntherapie durch wiederholte Behandlungen mit NPs zu eliminieren. Insgesamt liefern diese Ergebnisse eindeutig Belege für hochwirksame und synergistische Antitumor-Immunantworten, die durch COS-BA/Ce6-NPs in Kombination mit einer Anti-PD-L1-Blockade, entweder mit Chemotherapie allein oder in Kombination mit Chemotherapie/PDT, induziert werden.
Cistanche tubulosa – verbessert das Immunsystem
4. Schlussfolgerung
Zusammenfassend haben wir gezielt ein biokompatibles, biologisch abbaubares, wenig toxisches, aber hocheffizientes und klinisch verfügbares transformiertes photochemotherapeutisches Nano-Prodrug COS-BA/Ce6 NPs entworfen, synthetisiert und entwickelt, indem wir drei multifunktionale Komponenten, selbstorganisierte natürliche kleine Moleküle Betulinsäure, kombiniert haben (BA), ein wasserlösliches COS und ein wenig toxischer Photosensibilisator Ce6 für die kombinierte Chemotherapie/PDT. Anschließend löst es in Kombination mit einer Anti-PD-L1-Blockade, entweder mit Chemotherapie allein oder in Kombination mit Chemotherapie/PDT, hochwirksame und synergistische Antitumor-Immunantworten aus. Insbesondere zeigen wir, dass eine molekulare Hohlnetzwerkanordnung die Bildung von Nanopartikeln mit Schalenstruktur erleichtern könnte. Modifikationen von wasserlöslichem COS könnten die Antikrebsaktivität lipophiler natürlicher kleiner Moleküle durch die Konstruktion eines amphiphilen Prodrugs erheblich steigern. Wir zeigen auch, dass die resultierenden Nanomedikamente mehrere vorteilhafte therapeutische Eigenschaften aufwiesen, insbesondere eine intelligente „Ruhe“-Funktion mit heimtückischen Chemotherapieeffekten. In Kombination mit der ausgeprägten pH-Reaktionsfähigkeit weisen diese Co-Anordnungen bei normalem Gewebe eine geringe Toxizität und Biosicherheit auf, sind jedoch bei Tumorgewebe hochtoxisch. Zusammen mit der verbesserten 1-O2-Erzeugung, der guten biologischen Abbaubarkeit und der Biokompatibilität trugen sie alle zu einer hocheffizienten, synergistischen und sicheren Chemotherapie/PDT/Immuntherapie gegen Krebs bei. Insbesondere eine individuelle Chemotherapie ohne PDT-Behandlung kann systemische Antitumor-Immunantworten aktivieren und attraktive Möglichkeiten für eine klinisch synergistische Chemotherapie-Immuntherapie gegen Krebs eröffnen. Insgesamt liefert diese Arbeit vielversprechende Erkenntnisse für die Entwicklung natürlicher multifunktionaler, hoch bioaktiver und gering toxischer Nano-Immunstimulanzien für die klinische Immuntherapie.
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