Biochemische und histopathologische Reaktionen von Biomphalaria Alexandrina auf RIPEX (Pflanzenwachstumsregulator)Ⅰ

Abstrakt

Hintergrund

Pflanzenwachstumsregulatoren werden in der Landwirtschaft häufig zur Steigerung des Wachstums und der Reifung von Pflanzen eingesetzt, gefährden jedoch das aquatische Ökosystem. In der aktuellen Studie wurden die Auswirkungen einer subletalen Exposition gegenüber 48-prozentigen RIPEX-EC-Konzentrationen (8 und 16 µL/L) auf oxidative Stressparameter, Sexualhormone, potenzielle Immunenzyme, differenzielle Hämozytenzahlen und die Histopathologie der Verdauungsdrüsen und des Ovotestis untersucht Biomphalaria alexandrina-Schnecken.

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Ergebnisse

Die RIPEX-Exposition verursachte insgesamt einen Anstieg der Superoxiddismutase- und Glutathion-S-Transferase-Aktivitäten in B. Alexandrina. Allerdings hemmt eine extreme RIPEX-Exposition die SOD-Aktivität bei Schnecken. Die Malondialdehyd-Aktivität zeigte nach allen Expositionsperioden einen Anstieg bei B. Alexandrina, das beiden Konzentrationen ausgesetzt war. RIPEX verursachte auch einen signifikanten Anstieg des Testosterons bei Schnecken, die 16 µL/L ausgesetzt waren, senkte jedoch den Hormonspiegel bei Schnecken, die 8 µL/L nach 7 Tagen ausgesetzt waren. Bei Östradiol kam es nach 3 Tagen Exposition gegenüber 16 µl/L und 7 Tagen Exposition gegenüber 8 µL/L zu einem signifikanten Anstieg. Die RIPEX-Exposition erhöhte auch die Aktivitäten der Enzyme Myeloperoxidase und Adenosin-Desaminase in den Verdauungsdrüsen von Schnecken. Es erhöhte die Gesamtzahl der Hämozyten der exponierten Schnecken sowie die Anzahl der Granulozyten. Schneckenverdauungsdrüsen und Ovotestis zeigten nach 7 Tagen RIPEX-Exposition pathologische Veränderungen.

Schlussfolgerungen

Diese Ergebnisse legen nahe, dass RIPEX für B. Alexandrina toxisch ist und dass diese Schnecke als Bioindikator für eine Umweltkontamination mit Pflanzenwachstumsregulatoren verwendet werden kann.

Schlüsselwörter

Biomphalaria alexandrina, RIPEX, Testosteron, Östradiol, Myeloperoxidase, Adenosin-Desaminase, Histopathologie

1. Hintergrund

Die Verschmutzung von Oberflächengewässern durch Agrarchemikalien ist ein wachsendes globales Umweltproblem, insbesondere in Gebieten, in denen die Landwirtschaft rasch expandiert und intensiviert wird. Verschiedene synthetische Chemikalien wie Pestizide oder Düngemittel werden verwendet, um die Erntemenge und -qualität an die Bedürfnisse der Kunden anzupassen [7, 40]. Pflanzenwachstumsförderer sind in vielen Ländern gängige Agrochemikalien [18].

Wenn diese Chemikalien direkt eingeatmet oder mit kontaminiertem Gemüse verzehrt werden, schaden sie der menschlichen Gesundheit [39]. Das Organophosphor-Pestizid Ethephon (2-Chlorethylphosphonsäure) ist eine Ethylen freisetzende synthetische Chemikalie, die üblicherweise als Pflanzenwachstumsregulator (PGR) zur Förderung der Blüteninduktion, der Fruchtreife und anderer physiologischer Reaktionen verwendet wird. Es ist für die Verwendung bei einer Vielzahl von Lebensmitteln, Futtermitteln, Non-Food-Produkten, Gewächshäusern und im Freien angebauten Zierpflanzen zugelassen [3, 50]. Die Laboruntersuchung der Ethephon-Toxizität zeigte, dass Ethephon morphometrische Fehlbildungen der zweiten Antenne, der Sinnesborsten, der Schwanzwirbelsäule und des Rostrums von Daphnia magna verursachte, was zu Funktionsverlust und Tod führte [54].

Abd-El Azeem [1] verzeichnete eine Verringerung der Wachstumsrate, DNA-Schäden und apoptotischen Effekte in Verdauungsdrüsenzellen der Nacktschnecke Deroceras reticulatum nach Ethephon-Exposition. Viele Autoren bestätigten die Toxizität von Ethephon bei Ratten und Vögeln [2, 17, 55]. Darüber hinaus verursachte die Ethephon-Exposition bei Mäusen Genotoxizität, oxidativen Stress und Reproduktionstoxizität [16]. Teratogenität und Funktionsstörungen des Gonadensystems bei Mäusen wurden ebenfalls mit der Ethephon-Exposition in Verbindung gebracht [2, 16]. Es wurde auch gezeigt, dass Ethephon immuntoxisch ist, mutagene Wirkungen hat [26], den oxidativen Stress erhöht und die Desoxyribonukleinsäure- und Ribonukleinsäurekonzentrationen senkt [4].

Ethephon in Gewässern kann die Wasserfauna gefährden; Es liegen jedoch kaum Daten zu seinen Auswirkungen auf Wasserorganismen vor. Mehrere aquatische Arten wurden zum Nachweis von Pflanzenwachstumshormonen in aquatischen Systemen verwendet. Einige dieser Organismen sind jedoch schwierig zu manipulieren und im Labor zu halten, was ihre Verwendung in ökotoxikologischen Bewertungen erschwert [54]. Wassermollusken, einschließlich Schnecken, haben in jüngster Zeit als Testorganismen an Aufmerksamkeit gewonnen, da Wirbellosemodelle für die Umweltüberwachung von Wasserschadstoffen entwickelt werden müssen [21, 45]. Schnecken sind die am häufigsten vorkommende Molluskengruppe in Gewässern. Schnecken stellen als Bioindikatoren eine weniger ausbeuterische Alternative zu höheren Wirbeltieren dar, da sie in einer Vielzahl von Experimenten verwendet werden können, ohne eine ethische Genehmigung einzuholen, und ihre Anschaffung und Wartung kostengünstig sind (13).

In dieser Hinsicht wird die Biomphalaria alexandrina-Schnecke häufig als Indikatororganismus für die Süßwasserverschmutzung durch Pestizide verwendet [29, 30]. Über ihr Potenzial als Bioindikator hinaus fungiert diese Schnecke als Zwischenwirt für die Übertragung von Schistosoma mansoni [35]. Daher können agrochemische Konzentrationen in der Umwelt die Übertragung von Bilharziose durch direkte und indirekte Auswirkungen auf die Zwischenwirts- und Parasitendichte beeinflussen [27]. Die vorliegende Untersuchung zielte darauf ab, die Auswirkungen einer subletalen Exposition gegenüber dem Pflanzenwachstumsregulator RIPEX 48 Prozent EC (der Handelsname von Ethephon, 2-Chlorethylphosphonsäure) auf verschiedene biochemische, immunologische und histologische Aspekte von B. alexandrina zu untersuchen Schnecken als Bioindikatororganismus.

2 Methoden

2.1 Testorganismus

Biomphalaria alexandrina-Schnecken wurden aus dem Manzalah-See in El-Matareya, Gouvernement Dakahlia, Ägypten (31 Grad 11′ N 32 Grad 2′ E) gesammelt und in gut belüftetem Leitungswasser bei einer konstanten Temperatur von 20 Grad gehalten. Sie wurden täglich mit frischen Salatblättern gefüttert. Nach vierwöchiger Haltung unter Laborbedingungen wurden in den nachfolgenden Experimenten gesunde ausgewachsene Schnecken (10–12 mm Gehäusedurchmesser) verwendet.

2.2 Versuchsmaterial und Expositionsbedingungen

Der Pflanzenwachstumsregulator RIPEX (eine Lösungsform mit 48 Prozent Ethephon [2- Chlorethylphosphonsäure (C2H6ClO3P)] und 52 Prozent inerten Inhaltsstoffen) wurde von Chema Industries (Stadt New Nubaria, Behira, Ägypten; Registrierungslizenz-Nr . 1840). Es wurde eine Reihe von Konzentrationen hergestellt. Es wurden Baumnachbildungen mit jeweils zehn Schnecken freigelegt. Nach 1- Tagen der Exposition wurden tote Schnecken gezählt und entfernt und LC50 und LC90 wurden mit statistischer Software für Sozialwissenschaften (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA) berechnet.

2.3 Experimentelles Design

Es wurden zwei subletale Konzentrationen verwendet, die LC10 und LC20 repräsentieren (8 und 16 µL/L). 90 Schnecken wurden in drei Gruppen eingeteilt, jede Gruppe mit drei Replikaten (zehn Schnecken/Replikation): die Kontrollgruppe, die 8 µL/L-exponierte Gruppe und die 16 µL/L-exponierte Gruppe. In Abständen von 1-, 3- und 7-Tagen wurden Biomarker für oxidativen Stress und Enzyme des Immunpotenzials in der Verdauungsdrüse bewertet. Steroidhormone wurden in Ovotestis untersucht. Die differenzielle Hämozytenzahl sowie die Histologie der Verdauungsdrüsen und des Ovotestis wurden beurteilt. Für biochemische Untersuchungen wurden 0,5 g Gewebe (Verdauungsdrüsen oder Ovotestis) aus jeder Gruppe in 0,5 ml Phosphatpuffer (pH 6,5) mit einem Glashomogenisator homogenisiert und 10 Minuten lang bei 10,{19}}×g und 4 Grad zentrifugiert . Die resultierenden Überstände wurden für nachfolgende Tests verwendet.

2.4 Bestimmung von Markern für oxidativen Stress

2.4.1 Superoxiddismutase (SOD, EC 1.15.1.1)

Die SOD-Aktivität wurde mit dem EnzyChrom™ Superoxide Dismutase Assay Kit (Kat.-Nr.: ESOD{{0}}; BioAssay Systems, Hayward, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Das Gewebehomogenisat wurde mit kaltem Lysepuffer (50 mM Kaliumphosphat, 0,1 mM EDTA und 0,5 Prozent Triton X-100) 5 Minuten lang bei 4 Grad und 12 {8}g zentrifugiert , und der Überstand wurde zur Bestimmung von SOD gesammelt [43]. Die Aktivität von SOD wurde anhand der optischen Dichte (OD) bei 440 nm gemessen.

2.4.2 Glutathion-S-Transferase (GST, EC 2.5.1.18)

Dieses Enzym katalysiert die GSH-Konjugation mit {{0}}Chlor-2,4-Dinitrobenzol (CDNB). Die Messung erfolgt spektrophotometrisch bei 340 nm. Die Reaktionsmischung enthält Kaliumphosphatpuffer 0,1 M, pH 6,5, im Kaliumphosphatpuffer gelöstes GSH (140 mg/100 ml) und CDNB 4 mg/ml in Ethylalkohol. Eine Einheit Enzymaktivität ist definiert als die Enzymmenge, die die Bildung von 1 μmol S-Konjugat pro Minute katalysiert [11].

2.4.3 Malondialdehyd (MDA)

Malondialdehyd in ganzen Homogenaten wurde als Thiobarbitursäure-reaktive Substanz (TBARS) gemäß der Standardmethode von Ohkawa et al. bestimmt. [37]. Die Reaktionsmischung enthielt 0,1 ml des Gewebehomogenats, ein gleiches Volumen Natriumdodecylsulfatlösung, 0,75 ml Essigsäure, 0,75 ml Thiobarbitursäure, und 0,3 ml destilliertes Wasser. Diese Komponenten wurden in einem Vortex gemischt und 1 Stunde lang in einem kochenden Wasserbad inkubiert und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zehn 0,5 ml destilliertes Wasser und 2,5 ml n-Butanol wurden in jedes Röhrchen gegeben und mit einem Vortex kräftig gemischt und dann 10 Minuten lang in einer Zentrifuge bei 2.500 × g rotiert. Die Absorption wurde bei 532 nm abgelesen.

2.5 Hormonbestimmung

2.5.1 Testosteron

Testosteron wurde mit einem Testosteron-ELISA-Kit (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) (Kat.-Nr.: ADI-900-065; Enzo Life Sciences, NY, USA) bestimmt. Testosteron ist das Hauptandrogen, das sowohl die primäre als auch die sekundäre sexuelle Entwicklung beeinflusst Sexualtrieb. 100 µL Standardverdünnungsmittel (Assay-Puffer 3 oder Gewebekulturmedium) wurden in die Vertiefungen für unspezifische Bindung und maximale Bindung (0 pg/ml Standard) pipettiert. Danach 100 µL Standard Nr. 1 bis Nr. 5 in die entsprechenden Vertiefungen geben. Die Probe (100 µL) wurde in die entsprechenden Vertiefungen und 50 µL Assay-Puffer 3 in die Vertiefungen für unspezifische Bindung pipettiert. Außerdem wurden 50 µL gelber Antikörper in jede Vertiefung gegeben, mit Ausnahme der Leer-, Gesamtaktivitäts- und unspezifischen Bindungsvertiefungen. Die Inkubation der Platte bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler für 1 Stunde bei 500 U/min. Danach wurden 50 µL des blauen Konjugats in jede Vertiefung gegeben, mit Ausnahme der Vertiefungen mit Gesamtaktivität und leeren Vertiefungen. Nach dem Entleeren des Inhalts aus den Vertiefungen erfolgte das Waschen durch dreimaliges Hinzufügen von 400 µL Waschlösung zu jeder Vertiefung. Blaues Konjugat (5 µL) wurde in die Vertiefungen mit Gesamtaktivität gegeben und 200 µL einer Lösung von p-Nitrophenylphosphat wurden in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang bei 37 Grad ohne Schütteln inkubiert. Die Ablesung der Platte bei 405 nm erfolgte nach Zugabe von 50 µL Stopplösung in jede Vertiefung [12, 48].

2.5.2 Östradiol

Östradiol wurde unter Verwendung eines Östradiol-ELIZA-Kits (Kat.-Nr.: 501890; Cayman Chemical, Michigan, USA) gemäß den Protokollen des Herstellers bestimmt. Das Prinzip dieser Reaktion basiert darauf, dass die Konzentration des Östradiol-Acetylcholinesterase (AChE)-Tracers konstant ist, die Konzentration des nativen Östradiols jedoch variiert, weshalb die Menge des Östradiol-Acetylcholinesterase (AChE)-Tracers, der an das Östradiol-Antiserum bindet, umgekehrt proportional zur Konzentration des nativen Östradiols ist im Brunnen. 100 µL ELISA-Puffer wurden in die Vertiefungen für unspezifische Bindung und maximale Bindung gegeben. Zugabe von 50 µL aus Röhrchen Nr. 8 in beide untersten Standardvertiefungen (Standard 8) und 50 µL aus Röhrchen Nr. 7 in jede der nächsten Standardvertiefungen (Standard 7). In jede Vertiefung wurde eine Probe (50 µL) gegeben. Estradiol AChE Tracer (50 µL) wurde zu jeder Gesamtaktivitäts- und Blindvertiefung hinzugefügt. Anschließend wurde in jede Vertiefung Östradiol-ELISA-Antiserum (50 µL) gegeben, mit Ausnahme der Vertiefungen mit Gesamtaktivität, unspezifischer Bindung und leeren Vertiefungen. Nach Inkubation mit einem Orbitalschüttler (2 Stunden bei Raumtemperatur) wurde die Absorption bei 414 nm gemessen [52].

2.6 Bestimmung des Immunpotenzials von Enzymen

2.6.1 Myeloperoxidase (MPO, EC 1.11.2.2)

Eine Einheit MPO-Aktivität ist definiert als die Menge an Enzym, die das Substrat hydrolysiert und Taurinchloramin erzeugt, um 1,0 μmol TNB pro Minute bei 25 Grad zu verbrauchen. MPO wurde unter Verwendung eines kolorimetrischen Myeloperoxidase-Aktivitätstestkits (Kat.-Nr.: MAK068; Sigma-Aldrich, MO, USA) bestimmt. Die Absorption wurde bei 412 nm gemessen.

2.6.2 Adenosin-Desaminase (ADA, EC 3.5.4.4)

ADA ist ein Enzym, das die Umwandlung von Adenosin und 2'-Desoxyadenosin in Inosin und 2'-Desoxyinosin katalysiert. ADA wurde nach den Grundsätzen des Adenosin-Desaminase-Aktivitäts-Assay-Kits des technischen Bulletins (Kat.-Nr.: MAK400; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bestimmt. Eine Einheit Adenosin-Desaminase ist die Menge an Enzym, die Adenosin hydrolysiert, um 1,0 μmol Inosin pro Minute bei 37 Grad zu ergeben. Die Reagenzien sind 1×ADA-Assaypuffer (41 μL), ADA-Konverter (2 μL), ADA-Entwickler (2 μL) und ADA-Substrat (5 μL).

2.7 Differenzielle Hämozytenzahl

Die Hämolymphe wurde nach Sminia [47] aus der Schnecke (Kontrolle, exponiert) gewonnen. Nachdem die Schnecke am Kopf-Fuß-Bereich mit einer Pasteurpipette berührt worden war, musste sie sich tief in ihr Gehäuse zurückziehen und Hämolymphe ausstoßen, die für eine differenzielle Hämozytenzählung gesammelt wurde. Zur Ausbreitung wurde Hämolymphe auf den Objektträger gestrichen. Nach 5-minütiger Fixierung in 99,8-prozentigem Methanol wurde der Objektträger zum Trocknen bei Raumtemperatur in einem 45-Grad-Winkel gedreht und 20 Minuten lang mit Giemsa-Färbung gefärbt. Es wurde festgestellt, dass die Differenzierung der Hämozyten proportional zur Zählung von 100 war.

2.8 Histologische Untersuchungen

Histologische Untersuchungen wurden nach 7-tägiger Exposition gegenüber 8 und 16 µL/L RIPEX durchgeführt. Die Verdauungsdrüsen und die Ovotestis wurden herauspräpariert und sofort in Bouin᾿s-Flüssigkeit fixiert. Nach einem Tag Fixierung wurden die Proben dann durch eine Reihe von Alkoholen dehydriert und in Xylol geklärt. Es wurden Paraffinwachsblöcke hergestellt [42]. Zehn Sekten. (5–7 μm Dicke) wurden geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (Mayer's H und E) gefärbt. Nach dem Färben wurde gründlich mit Leitungswasser gewaschen. Histologische Schnitte wurden mit einer fotoautomatischen Kamera (Optika, Italien) fotografiert.

2.9 Statistische Analyse

Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt und mit statistischer Software für Sozialwissenschaften (SPSS; IBM Corp. Armonk, NY, USA) analysiert. Eine Zwei-Wege-ANOVA-Varianzanalyse wurde verwendet, um Unterschiede zwischen der Kontroll- und der exponierten Gruppe, zwischen den verschiedenen Konzentrationen und den Zeitpunkten der Exposition zu identifizieren. Das Signifikanzniveau wurde auf p kleiner oder gleich 0,05 festgelegt.

Der Mechanismus von Cistanche verstärkt die Testosteronwirkung

Es wurde festgestellt, dass Cistanche den Testosteronspiegel auf verschiedene Weise steigert. Erstens enthält es Verbindungen, die als Echinacosid und Acteosid bekannt sind und nachweislich die Produktion des luteinisierenden Hormons (LH) in der Hypophyse steigern. LH regt die Leydig-Zellen in den Hoden an, Testosteron zu produzieren. Cistanche enthält außerdem Polysaccharide und Phenylethanoidglykoside, die nachweislich antioxidative und entzündungshemmende Eigenschaften haben. Dies kann dazu beitragen, oxidativen Stress und Entzündungen in den Hoden zu reduzieren, die die Testosteronproduktion beeinträchtigen können. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Cistanche die Expression von Genen erhöht, die an der Testosteronsynthese beteiligt sind, und die Aktivität von Enzymen verringert, die Testosteron abbauen, wie z. B. {{1} }Alpha-Reduktase. Insgesamt wird angenommen, dass die Kombination dieser Mechanismen zur testosteronsteigernden Wirkung von Cistanche beiträgt.

Hoda H. Abdel-Azeem1*, Azza H. Mohamed1 und Mohamed R. Habib2