Kapitel 5 Änderungen der Enzymaktivität während der Enzymfermentation
Oct 29, 2024
Kapitel 5 Änderungen der Enzymaktivität während der Enzymfermentation
Protease, Lipase undSuperoxiddismutase (SOD)sind die wichtigsten funktionellen Enzyme vonmikrobielle Enzymgesundheit Lebensmittel. Darunter,Proteasespielt eine Rolle inFörderung der Hydrolyse von Protein in Lebensmittelnim menschlichen Körper. Darüber hinaus kann es auch einige sterbende Zellen zersetzen, Schmutz auf der Hautoberfläche und den Poren entfernen und eine Rolle beim Peeling spielen, sodass es in Badprodukten häufig verwendet wird. Lipase wirkt auf die Esterbindung zwischen Fettsäuren und Glycerin, und das Hydrolyse -Substrat ist im Allgemeinen natürliche Öle. Daher ist es in vielen Gewichtsverlust Lebensmitteln und Gesundheitsprodukten zu sehen. Viele Frauen sind äußerst besorgt über das Thema Gewichtsverlust, weshalb Enzyme auf der ganzen Welt schnell populär geworden sind.Enzyme sind reich an Lipasewas bedeutet, dass sie einen hohen Forschungswert und die Anwendungsaussichten haben.Seitist ein spezielles Metallenzym, das die Dismutationsreaktion von katalysiertSuperoxid -AnionenradikaledanachEntfernen von Superoxidanionenradikalenim Körper. Es ist eine schützende Barriere für Organismen, daher wird es im medizinischen Bereich weit verbreitet.
Dieses Kapitel nimmt als Beispiel das Apple -Enzym an. Ausgehend von der Anfangsphase der Fermentation dieAktivitäten von SuperoxiddismutaseAmylase, Lipase, Protease und Cellulase in der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe wurden alle 15 Tage gemessen, um den sich ändernden Trend der Enzymaktivität während des gesamten Fermentationsprozesses umfassend und systematisch widerzuspiegeln.
Klicken Sie hier, um weitere Details zu erhalten
Hilfsberechtigter Dienst von Wecistanche-dem größten Cistanche-Exporteur in China:
E -Mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950
5.1 Materialien und Methoden
5.1.1 Materialien
(1) Experimentelle Materialien
Waschen Sie frische Äpfel mit sterilem Wasser unter sterilen Bedingungen, trocknen Sie sie auf natürliche Weise auf einem sterilen Operationstisch, schälen Sie sie und schneiden Sie sie für die spätere Verwendung in Scheiben. Fügen Sie Weißzucker und Äpfel in ein sterilisiertes Glas mit einem Massenverhältnis von 1: 1 hinzu. Aktivieren Sie die für das Experiment erforderlichen Bakterien und inokulieren Sie sie gemäß dem optimalen Schema in das Enzym (dieser Betriebsschritt wird für die Kontrollgruppe weggelassen), versiegeln Sie es und legen Sie es an einem kühlen und trockenen Ort. Nehmen Sie nach 3 Monaten Raumtemperaturfermentation eine Probe, um die gesamte Enzymflüssigkeit zu erhalten, die das Zellstoff enthält, und filtern Sie sie. Nehmen Sie den Überstand als experimentelle Probe. Nachdem die Probe bei 10, 000 RPM für 15 Minuten in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge, zentrifugiert wurde, wird sie zur Messung relevanter Daten verwendet. Es ist erwähnenswert, dass bei der Herstellung von Enzymen, um unnötige Kontaminationen zu vermeiden, alle unsere Operationen unter sterilen Bedingungen durchgeführt wurden.
(2) Hauptinstrumente
Die für das Experiment erforderlichen Instrumente sind die gleichen wie 3.1.1 (2).
5.1.2 Methoden
(1) Bestimmung der Superoxiddismutase (SOD) -Aktivität [66]
Die Pyrogallol -Lösung wurde für einen bestimmten Zeitraum in einem Wasserbad von 25 Grad konstanter Temperatur vorgeheizt. Gemäß Tabelle 5.1 wurde dem Testrohr eine geeignete Menge Puffer, destilliertes Wasser und das gleiche Volumen an Salzsäure oder Pyrogallol -Lösung gegeben. Das Wasserbad der konstanten Temperatur wurde für 2 0 min auf 25 Grad eingestellt. Nachdem die gemischte Flüssigkeit schnell geschüttelt worden war, wurde sie sofort in die Küvette injiziert. Der Absorptionswert A0 der Probe wurde alle 30 Sekunden bei einer Wellenlänge von 325 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers gemessen.
Tab.5.1 Fügen Sie die Menge des benachbarten Benzol -Drei -Phenol -Reagenz zur Bestimmung der Autoxidationsrate hinzu
Die Methode zur Bestimmung der SOD -Aktivität ist im Grunde die gleiche wie die obige Operation. Der einzige Unterschied besteht darin, dass {{0}}}}. 5 ml Enzymprobenlösung von verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt werden, muss zuerst hinzugefügt werden. Gleichzeitig wird das gleiche Volumen an destilliertem Wasser hinzugefügt. Die gemessene Absorption ist Asod. The inhibition rate and SOD enzyme activity are calculated according to formula 5.1 and formula 5.2: Inhibition rate (%)=(△A0-△ASOD)/△A0×100 (5.1) Enzyme activity (U/mL)=inhibition rate/50% × V1/V2×n (5.2) wobei: v1 das Gesamtvolumen der Lösung, ML; V2 ist das Volumen der Enzymprobenlösung ML; △ A0 ist die Autooxidationsrate von Pyrogallol; △ Asod ist die Änderungsrate der Probenabsorptionswert; N ist die Verdünnung Multiple (2) Bestimmung der Amylaseaktivität In dieser Studie wurde die kolorimetrische Iod-starken-Methode zur Bestimmung der Amylaseaktivität verwendet. Die spezifischen Betriebsschritte beziehen sich auf das "Nationale klinische Laborbetriebsverfahren" [67]. Es ist hauptsächlich in die folgenden zwei Punkte unterteilt:
① Vorbereitung der Lösung
Buffered starch solution ({{0}}.4g/L): Accurately weigh 9g of sodium chloride, 22.6g of anhydrous disodium hydrogen phosphate, and 12.5g of anhydrous potassium dihydrogen phosphate, dissolve them in 500mL of distilled water, and heat until the Lösung kocht; Genau 0,4 g löslicher Stärke wiegen, sie in 10 ml destilliertem Wasser auflösen, gleichmäßig mischen und sich in eine Paste einstellen. Die Stärkelösung in eine Paste in die obige Kochlösung einstellen und den Becher wiederholt waschen, bis die Stärke vollständig auf die kochende Wasserlösung übertragen wird. Nach dem gleichmäßigen Rühren mit einer Glasstange bis zur Raumtemperatur abkühlen lassen, 5 ml einer 37% igen Haarformaldehydlösung hinzufügen und mit destilliertem Wasser zu 1 l verdünnen. Der pH -Wert der Lösung beträgt 7,0 ± 0,1 und wird zur Verwendung in den Kühlschrank gegeben.
Iodin -Stammlösung (0. 1 mol/l): 1,7835 g Kaliumjodat und 22,5 g Kaliumiodid in sauberer 500 ml genau wiegen
Becher, langsam und gleichmäßig 4,5 -ml -konzentrierte Salzsäure addieren, während des Additionsprozesses kontinuierlich rühren, mit destilliertem Wasser auf die Skala verdünnen und gleichmäßig rühren. Legen Sie es zum Gebrauch in den Kühlschrank und lagern Sie es in einer braunen Reagenzflasche.
Iodin -Anwendungslösung ({{0}}. 01mol/l): Nehmen Sie eine bestimmte Menge an Jod -Stammlösung (0,1 mol/l), verdünnen Sie es 10 -mal mit destilliertem Wasser, legen Sie es für die Verwendung in den Kühlschrank und speichern Sie es für bis zu 1 Monat.
② Versuchsbetriebsschritte
Nehmen Sie die Enzymlösung und verdünnen Sie sie 10 -mal mit physiologischer Kochsalzlösung und arbeiten Sie gemäß Tabelle 5.2. Well mischen, die Wellenlänge des Spektrophotometers beträgt 660 nm und der Lichtweg der kolorimetrischen Tasse 10 mm. Null mit destilliertem Wasser und lesen Sie die Absorption jedes Röhrchens. Berechnen Sie die Amylase -Aktivität basierend auf der grundlegenden Berechnungsformel 5.3.
Tab.5.2 Betriebsschritte der Bestimmung der Amylase
(3) Bestimmung der Lipaseaktivität
Die Bestimmungsmethode wurde gemäß QB/T {{0}} [68] durchgeführt. Eine 2% ige Enzym -Testlösung wurde mit 0. 0 25 mol/l Phosphatpuffer (pH 7,5) hergestellt, Phenolphthalein wurde als Indikator verwendet und Fettsäuren wurden mit einer Standard -Natriumhydroxidlösung titriert. Die Lipaseaktivität wurde basierend auf dem Volumen des im Experiments verbrauchten Natriumhydroxids berechnet. Die Regel lautet: bei einem pH -Wert von 7,5 und einer Umgebungstemperatur von 40 Grad, 1 ml flüssiger Enzymlösung hydrolysiert Lipase 1 min, um 1 & mgr; mol Fettsäure zu produzieren, die eine Lipase -Aktivitätseinheit ist, die als U/ml ausgedrückt wird. Anschließend wurde die Lipaseaktivität gemäß der Formel 5.4: Enzymaktivität (U/ml)=(BA) × C/0,05 × 50 × 1/15 × N {= 200/3 × (Ba) × C × N (5.4) berechnet, bei dem das Volumen von Natrium -Hydroxide -Lösung, ml. A ist das Volumen der Natriumhydroxid -Standardlösung, die in der Blindkontrollgruppe ML verbraucht wird; C ist die Konzentration der Natriumhydroxidstandardlösung mol/l; 0,05 ist der Umwandlungsfaktor der Konzentration der Natriumhydroxidstandardlösung; 50 ist der Fettsäurehalt der Natriumhydroxidlösung; 15 min ist die Reaktionszeit; n ist die Verdünnung mit mehreren.
(4) Bestimmung der Proteaseaktivität
Siehe GB/T 23527-2009 [69] mit leichten Modifikationen.
① Vorbereitung der Standardkurve
Nehmen Sie 1 ml Tyrosin -Standardlösung mit unterschiedlichen Massenkonzentrationen, die 0, 1 0, 20, 30, 40 und 50 mg/l sind, und fügen Sie 5 ml 0,4 mol/l Natriumcarbonatlösung und 1 ml Folin -Reagenzierungslösung hinzu. 20 Minuten bei einer Temperatur von 40 Grad reagieren. Entfernen Sie nach Abschluss der Reaktion die Reaktionslösung und messen Sie den Absorptionswert der Lösung bei einer Wellenlänge von 680 nm mit einem Spektrophotometer. Zeichnen Sie eine Tyrosin -Standardkurve mit Tyrosinkonzentration als horizontale Achse und Absorptionswert als vertikale Achse.
Neue Kräuterkistanchen mit starker antioxidatischer Kraft
② Bestimmung der Proteaseaktivität
Experimentelle Gruppe: Nehmen Sie 1 ml Kaseinlösung mit einer Konzentration von 10 g/l und mischen Sie sie gleichmäßig mit 1 ml der zu testenden Probenlösung und reagieren Sie sie 10 Minuten bei einer Umgebungstemperatur von 40 Grad; Filtern und erhalten Sie das Filtrat nach dem Stehen, nehmen Sie 1 ml Filtrat, 5 ml Natriumcarbonatlösung und 1 ml Folin -Reagenz, mischen Sie gleichmäßig und reagieren Sie 20 Minuten bei einer Umgebungstemperatur von 40 Grad; Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um den Absorptionswert der Lösung bei einer Wellenlänge von 680 nm zu messen.
Blindkontrollgruppe: Nehmen Sie 1 ml der Probenlösung, die getestet werden soll, Trichloressigsäure hinzufügen, reagieren Sie vollständig, um die Protease zu inaktivieren, und andere Betriebsmethoden sind mit der experimentellen Gruppe die gleichen.
Berechnen Sie die Proteaseaktivität gemäß der Formel 5.5:
Proteaseaktivität (u/ml)=Ak × 4/10 (5,5) wobei: a die Absorption der Enzymlösung in der experimentellen Gruppe ist; K ist die Menge an Tyrosin, wenn die Absorption gleich 1 ist; 4 ist das Gesamtvolumen der Reaktionslösung ML; 10 ist die Reaktionszeit, min.
(5) Bestimmung der Cellulaseaktivität [70]
Die Aktivität von Cellulase in Enzymen wird im Allgemeinen durch die Menge der Glukose exprimiert, die durch eine bestimmte Menge an Enzymlösung pro Zeiteinheitszeit freigesetzt wird. Das Prinzip der Verwendung der Filterpapiermethode zur Messung der Cellulaseaktivität ist, dass Cellulase Cellulose im Filterpapier zersetzen kann, um sekundäre Metaboliten wie Glucose zu erzeugen, und Glucose kann mit 3, 5- Dinosalicylsäure, reagieren, um einen gelben Komplex zu bilden. Die Farbe dieser Reaktion ist relativ hell, was die Menge an Glukose und anderen reduzierenden Zucker gut bestimmen kann.
①3, 5- dinitrosalicylsäure -kolorimetrischer Wirkstoff
Genau wie 1 0 g von 3, 5- dinitrosalicylsäure mit einem Schmelzpunkt von 168-169 Grad, auflösen Sie es mit destilliertem Wasser. Fügen Sie 20 g Natriumhydroxid und 200 g Natrium -Tartrat, das feste Erheimen, und das Feststoff, das feste, das Feststoff, das Feststoff, das Feststoff, das Feststoff, das Feststoff, das vollständig entlolvierte, mit 500 g mit 500 ml mit 500 ml mit 500 ml mit 500 ml, mit 500 ml, mit addiertem Erhitzen, addiert 2 g addiert 2 g add. Phenol und 0,5 g wasserfreies Natriumsulfit, kontinuierlich während des Additionsprozesses, bis er vollständig gelöst ist. Heizen Sie nach dem gleichmäßigen Mischen auf die Raumtemperatur ab, übertragen Sie alle auf 1000 ml Volumendflächen.②zymatische Hydrolyse
Pipette {{0}}, 0. 5, 1. 0, 1.5, 2,0 ml Enzymprobenlösung in 2 ml Essigsäure-Sodium-Acetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,5. Fügen Sie nach 5 Minuten konstantem Wasserbad mit 40 Grad 6 Teile Chromatographie -Filterpapier mit einer Fläche von 1 × 1 cm2 hinzu und beginnen Sie sofort mit dem Zeitpunkt, um die Reaktionszeit auf 60 Minuten zu genau zu machen. Übertragen Sie sofort 10 Minuten in das kochende Wasserbad, und die Cellulase verliert ihre Aktivität.
③ Farbreaktion
Nehmen Sie die Enzym -Probenlösung, fügen Sie 3 ml 3 ml 5- Dinitrosalicylsäure -kolorimetrisches Mittel hinzu, die in ① vorbereitet sind, 15 Minuten lang im kochenden Wasserbad vorbereitet, auf Raumtemperatur abkühlen lassen, 10 ml von destilliertem Wasser gleichmäßig mischen, die Spektrophotometer mit einer Wellenlänge von 550 nm einstellen, die leere Kontrollgruppe und die leere Kontrollgruppe einstellen und die leere Kontrollgruppe zu Null messen.
④ Zeichnung der Glukose -Standardkurve
Bereiten Sie eine Glukose -Standardlösung mit einer Konzentration von 1 mg/ml genau vor und verwenden Sie destilliertes Wasser, um die Glukose -Standardlösung mit einem Volumen von 0, 0. 2, {0. 4, 0. 6, 0}}}}}}}}}}}}}}}. von 3, 5- dinitrosalicylsäure kolorimetrisches Mittel, die in ① zubereitet werden, um die Farbentwicklungsreaktion durchzuführen. Zeichnen Sie die Standardkurve mit Glukosekonzentration als horizontale Achse und Absorption als vertikale Achse.
⑤kalkulation
Verwenden Sie den Absorptionswert A nach der Farbentwicklung mit Enzymlösung und berechnen Sie dann die Glukosefreisetzungsmenge M gemäß der Glukose -Standardkurve und berechnen Sie gemäß der Formel 5.6:
Cellulase -Aktivität (u/ ml)=m/ (t · m) (5.6) wobei: m die Glukosefreisetzungsmenge, ug; t ist die enzymatische Hydrolysezeit, min; M ist der Enzymgehalt in der Reaktion, ug/ml.
