Untersuchung der mikrobiellen Enzyme, die während der kombinierten bakteriellen Fermentation und ihrer biologischen Aktivitäten produziert werden ⅲ

Kapitel 3 Studie über die antioxidative Aktivität von Enzymen

 

Viele menschliche Krankheiten haben sich erwiesen, mit denen er in Verbindung stehtaktiver Sauerstoff und freie Radikale, wie zum BeispielEntzündung, Arteriosklerose,Altern, Diabetes, Krebs, usw.Übermäßige freie RadikaleIm Körper kann Protein -Denaturierung, Zellschäden und Tod und sogar pathologische Veränderungen im Körper verursachen. Daher suchen viele Studien im In- und Ausland nach Lebensmitteln, die reich an natürlichen Antioxidans -Zutaten sind, um durch freie Radikale durch Ernährung verursachte Krankheiten zu verhindern und zu regulieren. Mit dem zunehmenden Lebensstandard verlagern die Menschen heute allmählich ihren Fokus auf ihren eigenen Körper, sodass immer mehr Gesundheitsprodukte in einem endlosen Strom entstehen. Es ist jedoch nicht einfach, wirklich nützlich zu sein. Enzyme sind eine Art Essen, das im Leben der Menschen von sich selbst hergestellt werden kann. Die Kosten sind nicht sehr hoch und es gibt viele Vorteile.
Mikrobielle Enzyme haben eine Vielzahl von Gesundheitsfunktionen wie antibakteriell und entzündungshemmend, fördern Stoffwechsel, Verbesserung der Immunität, Aufhellung und Anti-Aging, Entgiftung und Anti-Krebs. Gegenwärtig gibt es relativ wenige Studien zu den antioxidativen Eigenschaften von mikrobiellen Enzymen im In- und Ausland. Daher planen wir, eingehende Forschungen darüber durchzuführen. Dieses Papier nimmt das Apple -Enzym als Forschungsobjekt und verwendet den gesamten Phenolgehalt, wodurch die Stromversorgung, die DPPH · freie Radikale, · Oh freie Radikale, Superoxid -freies Radikal und ABTS -freie Radikalfestigkeit als Bestimmungsindizes zur Durchführung einer umfassenden und systematischen Investition von Apfelenzym nach 3 Monaten für Fermentation für Fermentation für Fermentation für 3 Monate verwendet wird. Die Zusammensetzung und der Gehalt an Antioxidation Wirkstoffen wurden untersucht, und seine antioxidative Aktivität wurde verstanden.

Neue Kistaner mit viel mehr Antioxidationskraft als Bakterienfermentation

Hilfsberechtigter Dienst von Wecistanche-dem größten Cistanche-Exporteur in China:
E -Mail: wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/tel: +86 15292862950

 

 

 

 

3.1 Materialien und Methoden

3.1.1 Materialien

(1) Experimentelle Materialien
Waschen Sie frische Äpfel mit sterilem Wasser unter sterilen Bedingungen, trocknen Sie sie auf natürliche Weise in einem sterilen Operationstisch, schälen Sie sie und schneiden Sie sie für die spätere Verwendung in Scheiben. Fügen Sie Weißzucker und Äpfel in ein sterilisiertes Glas mit einem Massenverhältnis von 1: 1 hinzu. Aktivieren Sie die für das Experiment erforderlichen Bakterien und inokulieren Sie sie gemäß dem optimalen Schema in das Enzym (dieser Betriebsschritt wird in der Kontrollgruppe weggelassen), versiegeln Sie es und legen Sie es an einem kühlen und trockenen Ort. Nehmen Sie nach 3 Monaten Raumtemperaturfermentation eine Probe, um die gesamte Enzymflüssigkeit zu erhalten, die das Zellstoff enthält, und filtern Sie sie. Nehmen Sie den Überstand als experimentelle Stichprobe und zentrifugieren die Probe 15 Minuten bei 10000 U / min in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge, bevor Sie die relevanten Daten ermitteln. Es ist erwähnenswert, dass bei der Herstellung von Enzymen, um unnötige Kontaminationen zu vermeiden, alle unsere Operationen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden.

(2) Hauptinstrumente
Spektrophotometer: V -1100, Shanghai ANTing Scientific Instrument Factory;
Wasserbad konstanter Temperatur: HH -2, Wuhan Litian Technology Instrument Co., Ltd. Andere Instrumente sind die gleichen wie 2.1.3.

3.1.2 Methoden

(1) Bestimmung des Gesamtphenolgehalts [53]
① Vorbereitung der Standardkurve:
Wie genau {{0}}}. 123 g Gallinsäure, löst es in einer geringen Menge destilliertes Wasser auf und übertragen Sie es auf eine 5 0 0 ml volumetrische Flasche, um das Volumen zu erstellen. Nehmen Sie 8 sauber 1 {{1 {0}} ml volumetrische Flaschen, fügen Sie 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2 und 1,4 ml Gallins Säure -Standard -Lösung hinzu. min, kühl und verdünnt auf 20 ml und platzieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption A bei einer Wellenlänge von 650 nm zu messen und eine Standardkurve mit der Absorption A als horizontale Achse und Probenkonzentration als vertikale Achse zu zeichnen. ② Erkennung
Fügen Sie destilliertes Wasser zu 100 & mgr; l, 200 & mgr; l, 300 & mgr; l, 400 & mgr; l und 500 & mgr; l Probenlösungen zu 46 ml hinzu, fügen Sie dann 1 ml Folin-Phenol-Reagenz hinzu, mischen Sie gleichmäßig. Spektrophotometer. Der Gesamtphenolgehalt wird als Gallussäureäquivalente ausgedrückt und der Gesamtphenolgehalt wird gemäß der Standardkurvengleichung berechnet.

(2) Reduktionstest [54]
Fügen Sie 1 0 0 μl, 2 0 0 & mgr; l, 300 & mgr; l, 400 & mgr; l und 500 & mgr; l Probe zu 2,5 ml zu 2,5 ml, mit einer Konzentration von 0,2 mol/l und einem pH -Wert von 6,6, 1,5 ml 1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1%1 bis 1 bis 1 V), 1,5 ml 1%und einen Mass -1%-N -1%-Spotium -Ferricanid (V) und ein 1 -1 -Wert von 2,5 ml, und ein A -pH -Wert von 0,5 ml (V) und eine 50 Grad für 30 Minuten. Fügen Sie dann 2,5 ml Trichloressigsäure (W/V) mit einer Massenkonzentration von 10%hinzu und zentrifugieren bei 3000 U/min 10 Minuten in einer Hochgeschwindigkeitszentrifuge. Nehmen Sie unmittelbar nach dem Ausgang 2,5 ml Überstand in einen Volumenkolben und geben Sie 2,5 ml destilliertes Wasser und 0,5 ml Eisen Chlorid (W/V) mit einer Massenkonzentration von 0,1%. Verwenden Sie destilliertes Wasser als leere Steuerung und messen Sie die Absorption A bei einer Wellenlänge von 700 nm mit einem Spektrophotometer. Die Stärke der Reduzierung der Macht kann anhand des Absorptionswerts beurteilt werden. Je höher der Absorptionswert, desto stärker ist die Reduktionsleistung.

 

(3) Bestimmung des Superoxidanionen -Fassungswirkung

Nehmen Sie 4,5 ml 0. 0 5 mol/l Ph 8.2 Tris-HCl-Puffer und heizen Sie es in einem 25-Grad-Wasserbad für 2 0 min vor. Fügen Sie 1 ml Enzymprobenlösung mit Konzentrationen von 10%, 20%, 30%, 40%und 50%bzw. 0,4 ml 25 mmol/l Pyrogallol -Lösung hinzu. Gut mischen und 5 Minuten lang in einem Wasserbad von 25 Grad reagieren. Fügen Sie 1,0 ml 8 mol/l HCl hinzu, um die Reaktion zu beenden. Verwenden Sie den TRIS-HCL-Puffer als Referenz und messen Sie ein Spektrophotometer, um die Absorption A bei einer Wellenlänge von 299 nm zu messen, um die Sparfrequenz zu berechnen. Für die leere Kontrollgruppe wurden 1 ml Lösungsmittel anstelle von Probe verwendet. Die O 2- Scavenging -Rate wurde gemäß der Formel 3.1: o 2- Scavenging -Rate (%)=(a {1- A2)/a1 × 100 (3.1) berechnet, wobei A1 der Absorbance des Blankohrröhrchens ist; A2 ist die Absorption der Probe.

(4) Bestimmung des Abgaseffekts auf Hydroxylradikale [56]

100μL, 200μL, 300μL, 400μL, 500μL sample solution was added with water to 2mL, then added to 1.4mL of hydrogen peroxide with a molar mass concentration of 6mmol/L, then added with 0.6mL of sodium salicylate with a molar mass concentration of 20mmol/L and 2mL of ferrous sulfate with a molar mass concentration of 1,5 mmol/l und in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur 1H bei 37 Grad erhitzt. Mit destilliertem Wasser nach Null einstellen und die Absorption A bei einer Wellenlänge von 562 nm mit einem Spektrophotometer messen. Führen Sie 3 Replikate für jede Behandlung durch. Berechnen Sie die Hydroxylradikalfängerrate gemäß der Formel 3.2: Hydroxylradikal -Spulenrate (%)=[(a 1- A2)/a1] × 100 (3.2), wobei: a1 die durchschnittliche Absorption des Blankens ist; A2 ist die durchschnittliche Absorption der Probenlösung. (5) Bestimmung des DPPH -Abgas -Abgasseffekts [57]

Neue Kistaner mit viel mehr Antioxidationskraft als Bakterienfermentation

 

Pipette 2 ml Enzymprobenlösung genau mit Konzentrationen von 1 0%, 20%, 30%, 40%und 50%in einen 10 -ml -Volumenkolben und dann 2 ml 80%DPPH -Ethanol -wässriger Lösung in die volumetrische Fließkolk. Die Molmassenkonzentration beträgt 2 × 10-4 mol/l. Lassen Sie es nach dem Mischen 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Messen Sie unter Verwendung von 80% igen Ethanollösung als Referenz die Absorption der Probe bei einer Wellenlänge von 517 nm, die als A1 aufgezeichnet wird. Mischen Sie 2 ml DPPH -Lösung und 2 ml Ethanollösung mit einer Massenkonzentration von 80% und messen Sie ihre Absorption bei derselben Wellenlänge, die als A0 aufgezeichnet wird. Mischen Sie 2 ml Enzymlösung und 2 ml Ethanollösung mit einer Massenkonzentration von 80% und messen Sie ihre Absorption bei derselben Wellenlänge, die als A2 aufgezeichnet wird. Berechnen Sie die DPPH Free Radical Scavenging Rate gemäß der Formel 3.3:
DPPH Free Radical Scavenging Rate (%) {{0}} [1- (a 1- a2)/a 0] × 100 (3,3), wobei: A1 die Absorption von 2 ml DPP -DPP 80% ETHANOL ETHANOL ETANOL ETHANOUS AND ETHANOUS und 2 Ml -Lösung ist. A2 ist die Absorption einer gemischten Lösung von 2 ml Enzymlösung und 2 ml 80% Ethanol durch Massenkonzentration; A0 ist die Absorption einer gemischten Lösung von 2 ml DPPH -Lösung und 2 ml 80% Ethanol durch Massenkonzentration.

(6) ABTS -Fähigkeit für freie Radikale [58]
Fügen Sie eine bestimmte Menge an Kaliumsulfat zu einer 7 mmol/l ABTS -Lösung hinzu, bis die Endkonzentration der gemischten Lösung 2,45 mmol/l beträgt. Legen Sie die gemischte Lösung 12 bis 16 Stunden an einem kühlen und trockenen Ort bei Raumtemperatur. 1 & mgr; l, 3 & mgr; l, 5 & mgr; l, 7 & mgr; l und 9 & mgr; l Probenlösung wurden mit 5 mmol/l Ph7,4 -Phosphatpuffer auf 10 μl ergänzt und dann gleichmäßig mit 10 ml der obigen Kaliumsulfat und ABTS -gemischten Lösung gemischt und mit einer Reaktionstemperatur von 30 Grad und einem Reaktionszeitpunkt von 5 min reagiert. Null mit destilliertem Wasser und messen Sie die Absorption A bei einer Wellenlänge von 734 nm mit einem Spektrophotometer. Berechnen Sie die Abt -Radikalfängerrate gemäß der Formel 3.4:
ABTS Free Radical Scavenging Rate (%) {= [(a 1- A2)/A1] × 100 (3.4) wobei: a1 die Absorption der Blindkontrollgruppe ist; A2 ist die Absorption der Versuchsgruppe

 

3.2 Ergebnisse und Analyse

3.2.1 Gesamtphenolgehalt

(1) Standardkurve
Die Standardkurve des Gesamtphenolgehalts wurde mit der Konzentration von Gallussäure als horizontaler Achse und des Absorptionswerts A als vertikale Achse gezeichnet, wie in Abbildung 3.1 gezeigt.

 

Abb.3.1 Die Standardkurve des Gesamtphenolgehalts

Aus Abb.3.1 können wir sehen, dass die Standardkurvengleichung y =11. 375x +0. 2593 (x ist die Probenkonzentration, y ist die Absorption), r 2=0}. 9981.

(2) Bestimmung von Proben

Die Ergebnisse der Gesamtphenolgehaltbestimmung von Apfelenzymen in der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe in verschiedenen Konzentrationen sind in Abb.3.2 dargestellt.

 

 

 

Abb.3.2 Die Kurve des Gesamtphenolgehalts

Wie in Abb.3.2 gezeigt, weisen die Apple -Enzyme sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der experimentellen Gruppe einen hohen Gesamtphenolgehalt auf, und beide steigen mit der Zunahme der zugesetzten Probenlösung. Im gleichen Konzentrationsgradienten stieg der Gesamtphenolgehalt des Apple -Enzyms in der Kontrollgruppe von 0. 673 mg auf 2,8 0 7mg und der Gesamtphenolgehalt der experimentellen Gruppe von 0,961 mg auf 4,185 mg. Der gesamte phenolische Gehalt der Versuchsgruppe ist viel höher als der der Kontrollgruppe, und der Aufwärtstrend ist offensichtlicher. Nach dem gesamten phenolischen Gehalt ist die Gesamt -Antioxidationsaktivität der Versuchsgruppe größer als die der Kontrollgruppe.

 

3.2.2 Stromverringerung

Die Ergebnisse der Reduzierung der Leistungsbestimmung von Apfelenzymen in der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe in verschiedenen Konzentrationen sind in Abbildung 3.3 dargestellt.

 

Wie in Abbildung 3.3 gezeigt, ähnelt der sich ändernde Trend zur Reduzierung der Leistung von Apple -Enzymen dem sich ändernden Trend des Gesamtphenolgehalts. Die Reduktionsleistung der Versuchsgruppe ist höher als die der Kontrollgruppe, und ob es sich um die experimentelle Gruppe oder die Kontrollgruppe handelt, innerhalb des im Experiments dargestellten Konzentrationsbereichs zeigt die Reduktionsleistung einen zunehmenden Trend mit zunehmender Menge der zusätzlichen Probenlösung. Die experimentellen Daten bestätigten auch, dass die antioxidative Aktivität der Versuchsgruppe in Bezug auf die Reduzierung der Leistung größer ist als die der Kontrollgruppe.

 

 

3.2.3 Superoxidanion freie Radikalfestigkeit

Die Ergebnisse der Fähigkeit von Apple -Enzymen in der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe der experimentellen Gruppe in verschiedenen Konzentrationen sind die Ergebnisse der Fähigkeit von Apple -Enzymen von Superoxidanionen und der Versuchsgruppe in Abbildung 3.4 dargestellt.

Wie in Abbildung 3.4 gezeigt, gibt es einen großen Unterschied in der Fähigkeit zur freien Radikalfestung von Superoxidanionen zwischen der experimentellen Gruppe und der Kontrollgruppe. Innerhalb des im Experiments vorgestellten Konzentrationsbereichs ändert sich die Fähigkeit des Superoxidanionen freien Radikalen der Versuchsgruppe, wenn die Probenkonzentration 10%bis 20%beträgt, und die Änderung ist nach der Konzentration nicht offensichtlich. Wenn die Konzentration 50%beträgt, beträgt die Fähigkeit des Superoxidanionen freien Radikalen bis zu 85,4%. Die von der Kontrollgruppe gezeigte Fähigkeit zum freien Radikalfest der Superoxid ist deutlich aus dem Trenddiagramm zu sehen. Mit zunehmender Enzymkonzentration nimmt diese Fähigkeit zur freien Radikalabstimmung zu, ändert sich langsam und neigt allmählich zu einem stabilen Zustand. Die Abgasfähigkeit erreicht maximal 42,6%. Die Versuchsgruppe ist fast doppelt so hoch wie die Kontrollgruppe.

 

 

3.2.4 HYDROXYL FRAVE RADICAL ABSCHAFFUNG

Die Veränderungen in der Fähigkeit des Hydroxylfreenradikals der Apple -Enzyme in der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe in verschiedenen Konzentrationen sind in Abb. 3.5 dargestellt.

 

 

Abb.3.5 Die Kurve des Scaving -Hydroxyl -freien Radikals

 

Aus Abb. 3.5 ist ersichtlich, dass innerhalb des im Experiments vorgestellten Konzentrationsbereichs die Fähigkeit des Hydroxylfreien Radikals der Enzyme in der Versuchsgruppe und die Kontrollgruppe mit zunehmender Menge der zugesetzten Menge erhöht wurden. Die Fähigkeit des Hydroxyl -freien Radikals der Versuchsgruppe war niedriger als die der Kontrollgruppe und zeigte sich bei niedrigen Konzentrationen sehr schlecht. Bei hohen Konzentrationen nahm die Fähigkeit zur frequenfusigen Hydroxyl -Free Radical signifikant zu. Der Grund könnte sein, dass während des Fermentationsprozesses die Arten und der Inhalt von Mikroorganismen in den Apfelenzymen in der Versuchsgruppe und der Kontrollgruppe unterschiedlich waren, und der Inhalt der sekundären Metaboliten und Komponenten jedes durch die Fermentation erzeugten Produkts war so unterschiedlich, sodass die gezeigte Antioxidantkapazität unterschiedlich war.

 

3.2.5 DPPH · Fähigkeit zur freden Radikalen

Im Vergleich zu anderen Nachweismethoden wird die Fähigkeit von DPPH · Free Radical Scavenging häufig verwendet, um die antioxidative Aktivität in kurzer Zeit zu bewerten [59]. Die DPPH · FRAVE RADICAL ABSCHAVENGING -Fähigkeit in verschiedenen Konzentrationen wurde gemäß den Ergebnissen der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe von Apfelenzymen aufgetragen, wie in Abbildung 3.6 gezeigt.

Wie in Abbildung 3.6 gezeigt, betrug die Konzentration des Kontrollgruppen -Apfel -Enzyms unter 30%das DPPH · Freadical Scavenging -Fähigkeit weniger als 50%, das Apfelenzym der experimentellen Gruppe zeigte jedoch auch eine höhere DPPH -· Free Radical -Spulenfestigkeit bei niedrigen Konzentrationen. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Aspergillus oryzae, Hefe, thermophilem Streptokokken und bulgarischem Lactobacillus für die DPPH · FREEDISCHE FRAUENFACKING -Fähigkeit des Enzyms von Vorteil ist. Wenn die Enzymkonzentration 50%beträgt, liegt diese Fähigkeit bis zu 91,4%, was bei gleicher Konzentration viel höher ist als die 69,8%der Kontrollgruppe.

 

3.2.6 ABTS Radical Scavenging -Kapazität

Die Ergebnisse der ABTS Radical Scavenging -Kapazität der Apfelenzyme in der Kontrollgruppe und der experimentellen Gruppe in verschiedenen Konzentrationen sind in Abb. 3.7 dargestellt.

Abb.3.7 Die Kurve der ABTS -Radikalfängerkapazität
Aus Abb. 3.7 ist ersichtlich, dass die Abgasrate der Apfelenzyme in der Versuchsgruppe höher ist, wenn die Enzymadditionsmenge größer als 5 μl ist. Die Studie von Erel et al. zeigten, dass die Abgaskapazität von ABTS -Radikalen weitgehend von der höheren Konzentration an phenolischen Substanzen abhängt [60]. Die Ergebnisse der Bestimmung des Gesamtphenolgehalts zeigten, dass der Gesamtphenolgehalt der Versuchsgruppe höher war als der der Kontrollgruppe. Die experimentellen Ergebnisse in Abb. 3.7 haben gerade verifiziert, dass die Abgaskapazität von ABTS -Radikalen größer ist als die der Kontrollgruppe.

 

3.3 Zusammenfassung dieses Kapitels

In diesem Kapitel untersucht die Beziehung zwischen der antioxidativen Aktivität von Apfelenzymen, die durch Fermentation mit vier ausgewählten Äpfelsstämmen, der Konzentration von Enzymproben und dem Vergleich der antioxidativen aktiven Komponenten und der Fähigkeit zur freadikalen Sperrung zwischen der experimentellen Gruppe und der Kontrollgruppe erzeugt werden. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass der Gesamtphenolgehalt des Apple -Enzyms in der Kontrollgruppe niedriger ist als der in der experimentellen Gruppe und deren Reduktionsleistung, Superoxid -Anion -freier Radikal, DPPH -freie Radikal- und Abt -Free -Radical -Spulenfestigkeit sind besser als die in der Kontrollgruppe. Das Enzym in der Kontrollgruppe verfügt über eine besonders gute Abgasfähigkeit für hydroxylfreie Radikale.
Im Allgemeinen zeigte die experimentelle Gruppe eine höhere antioxidative Aktivität, was die Durchführbarkeit des künstlichen Hinzufügens von Stämmen für mikrobielle Enzyme weiter bestätigte. Auf diese Weise haben mikrobielle Enzym -Lebensmittel aufgrund der ursprünglichen natürlichen Fermentation mehr Substanzen, die für die menschliche Gesundheit von Vorteil sind, und können sich besser in die von Menschen erwartete Richtung entwickeln.