Cistanche: Echinacosid-induzierte Stickoxidproduktion in Endothelzellen: Rollen des Androgenrezeptors und des PI3K-Akt-Signalwegs

Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com

LI GU, dANHONG LIAN, YIMEI ZHENG, WEI ZHOU, JINLEI GU und XIN LIU

Einführung

CistancheHoffmg. Et Link ist ein mehrjähriges Parasitenkraut einer Gattung der Orobanchaceae-Familie. KräuterCistanche, der Stamm vonCistanche DeserticolaY.c. MA undCistanche Tubulus(Schenk) R. Weight, wurden als Stärkungsmittel zur Behandlung von Niereninsuffizienz, Impotenz, krankhaftem Leukorrhoe und seniler Verstopfung (1) verwendet, was auf seine androgenähnliche oder sexualhormonregulierende Wirkung zurückzuführen sein kann (2).Echinacosid(EcH; c35H46O20;

Molekulargewicht 786,73; Abb. 1), ist eines der Phenylethanoidglykoside (PhGs), das aus den Stängeln von Herba isoliert wurdeCistancheund weist mehrere biologische Eigenschaften auf, darunter antioxidative, alterungshemmende, entzündungshemmende, hepatoprotektive und neuroprotektive Wirkungen (3). Moderne pharmakologische Untersuchungen haben gezeigt, dass verschiedene Bestandteile von HerbaCistanche, einschließlich EcH, Acteosid, Kankanose, Kankanosid F und Cistanosid F, zeigen gefäßrelaxierende Aktivität (4).

Das Endothel ist ein kritischer Regulator des Gefäßsystems, und Stickoxid (NO) ist ein wichtiger Entspannungsfaktor, der von Endothelzellen freigesetzt wird. Durch die Diffusion in glatte Muskelzellen aktiviert NO die Guanylatcyclase, erhöht die Spiegel von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) und aktiviert dann cGMP-abhängige Proteinkinasen (PKGs), um die Entspannung der glatten Muskulatur zu fördern (5). Es wurde zuvor gezeigt, dass EcH bei 350-400 µM direkt auf die glatte Gefäßmuskulatur wirkt und die durch Hypoxie induzierte Proliferation in glatten Muskelzellen der Rattenpulmonalarterie hemmt (6), während 30-300 µM EcH eine akute Vasorelaxation im Endothel verursachte. intakte Ringe in einer konzentrationsabhängigen Weise und verstärkte cGMP-Produktion in der glatten Muskulatur des Corpus cavernosum von Aortenringen, die durch Phenylephrin kontrahiert wurden (7). Durch Öffnen der NO-cGMP-PKG-BKca-Kanäle in glatten Muskelzellen unterdrückten 100 oder 300 µM EcH die Noradrenalin-induzierte Kontraktion in den Lungenarterien von Ratten, insbesondere in Endothel-denudierten Ringen (8). Endothelzellen sind Schlüsselregulatoren der kardiovaskulären Funktion, und in mehreren Fällen wurde festgestellt, dass die Endothel-abhängige Relaxation auf eine übertragbare Substanz wie NO zurückzuführen war, die aus dem Endothel freigesetzt wurde (9). Der vorgeschaltete molekulare Mechanismus der EcH-induzierten NO-Produktion in vaskulären Endothelzellen erfordert jedoch weitere Untersuchungen.

Im vaskulären Endothel wird die NO-Erzeugung hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) vermittelt. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass der Phosphatidylinositol-3--Kinase (PI3K)-Weg die Serin-Threonin-Proteinkinase B (Akt) aktiviert, die eine direkte eNOS-Phosphorylierung an Serin 1177 (Ser1177) bewirkt (10). Der Androgenrezeptor (AR) ist ein Mitglied der Kernrezeptor-Unterfamilie s3, die die Genexpression kanonisch modifiziert. Daran ist die AR-Lokalisierung in den Caveolae in der Zellmembran beteiligt

die nicht-genomische Regulation der Endothelzellfunktion oder Genexpression durch Auslösen der c-Src/PI3K/Akt-Kaskade, die letztendlich zur eNOS-Phosphorylierung und NO-Produktion führt (11). Es wurde berichtet, dass Testosteron in Endothelzellen der menschlichen Aorta die PI3K/Akt-Signalgebung aktiviert und aufgrund der direkten Interaktion von AR und der p85-Untereinheit von PI3K im kardiovaskulären System schnell die NO-Produktion induziert (12). Es wurde berichtet, dass EcH Hormonmangel-bedingte Symptome verschlimmert und seine Androgen-ähnliche Wirkung aufgrund der kompetitiven Bindung an AR anstelle von Testosteron entfaltet (2). Daher stellte die vorliegende Studie die Hypothese auf, dass der PI3K/Akt-Signalweg an der NO-Produktion durch AR-abhängige eNOS-Phosphorylierung, die durch EcH induziert wird, beteiligt sein könnte. Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die folgenden Wirkungen von EcH zu bewerten: i) Induktion der NO-Produktion und eNOS-Phosphorylierung; ii) Beteiligung von AR an der eNOS-Phosphorylierung; und iii) Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs in humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEcs), einem wohlbekannten experimentellen Modell zur Untersuchung der Regulation von Endothelzellfunktionen und Angiogenese (13).

Materialien und Methoden

Chemikalien und Reagenzien.EcH (Reinheit 92,5 Prozent) wurde von den National Drug Reference Standards im National Institute for the Food and Drug Control erhalten. Antikörper gegen p-Akt (Ser473; Kat.-Nr. ab8805), Akt (Kat.-Nr. ab81283), p-eNOS (Ser1177; Kat.-Nr. ab184154) und eNOS (Kat.-Nr. ab76198) wurden von Abcam bezogen. Die Inhibitoren von Nilutamid und IcI 182780 wurden von Sigma-Aldrich bezogen; Merck KGaA. L-NAME wurde von Adamas-Beta, Ltd. gekauft und Wortmannin wurde von Pribolab gekauft.

Zelle Kultur undMedikament Behandlung.HUVEcs wurden von Sciencell Research Laboratories Inc. erhalten und in Endothelzellmedium (EcM; Sciencell Research Laboratories) mit 5 Prozent (v/v) fötalem Rinderserum (FBS; Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.) und 1 Prozent Endothelzellen kultiviert Wachstumsergänzung (ECGS) bei 37 °C (5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit) (14). Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit Trypsin verdaut und in EcM mit 1 % FBS und 1 % EcGS ausplattiert. Für alle Experimente wurden HUVEcs in einer Konzentration von 1 × 10 4 /ml ausplattiert und bis zum Erreichen der Konfluenz gezüchtet. Vor der Behandlung mit EcH oder anderen Stimulatoren wurden die Zellen zur Induktion in Phenolrot-freiem EcM ohne FBS und EcGS für 6 h inkubiert

Wachstumsstillstand. In den Hemmexperimenten wurden HUVEcs mit verschiedenen Antagonisten oder Inhibitoren vorinkubiert, darunter 10 µM Nilutamid, 10 µM IcI 182780, 0,5 mM L-NAME oder 5 µM Wortmannin, für 30 Minuten, mit oder ohne ECH, bei 37˚C. In allen Gruppen, einschließlich der Kontrolle, wurde dMSO als Lösungsmittel in gleichen Konzentrationen von 0,001 Prozent verwendet.

Messung von intrazellulär Keine Produktion.

Relative Änderungen der zytosolischen NO-Konzentration in HUVEcs wurden unter Verwendung der fluoreszierenden NO-Sonde DAF-FM (Cayman Chemical Company) überwacht, wie zuvor berichtet (12). Kurz gesagt, die Zellen wurden mit 5 µM DAF-FM-Diacetat für 20 min bei 37 °C in einer schwarzen Mikrotiterplatte beladen und mehrmals mit PBS (pH 7,4) gespült. Die Fluoreszenz wurde bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 495 bzw. 515 nm unter Verwendung eines fluoreszierenden Mikroplattenlesegeräts (Biotek Synergy H4; BioTek Instruments, Inc.) und eines kompakten inversen Mikroskops (Nikon Eclipse Ts2R; Nikon Corporation) bestimmt.

Western Fleck Analyse.Wie zuvor berichtet (15), wurden konfluente Monoschichten von Zellen zweimal in eiskaltem PBS gewaschen und mit RIPA-Puffer (P0013d; Beyotime Institute of Biotechnology) lysiert. Die Proteinkonzentration im Überstand wurde unter Verwendung des Bicinchoninsäure-Assayverfahrens (16) gemessen. Anschließend wurden 30 µg Protein pro Spur aufgetragen, mit 10-prozentigen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Magermilch für 1 h bei 25 °C blockiert. Nach Inkubation mit monoklonalen Antikörpern gegen Akt (1:1, 000 Verdünnung), p-Akt (1:500 Verdünnung), eNOS (1:2, 000 Verdünnung) oder p-eNOS (1 :1, 000-Verdünnung) bei 4 °C über Nacht wurden die Membranen mit TBST (enthaltend 0,1 Prozent Tween-20) viermal für ~15 min pro Waschgang bei 25 °C gewaschen. Anschließend wurden die Membranen mit Meerrettichperoxidase-konjugierten sekundären Antikörpern (1:5, 000-Verdünnung; Anti-Maus-Antikörper, Kat.-Nr. A0216, oder Anti-Kaninchen-Antikörper, Kat.-Nr. A0208, Beyotime Institute) inkubiert Biotechnologie) für 1 h bei 25 °C und unter Verwendung eines verbesserten Chemilumineszenz-Kits (Kat.-Nr. 32209, Thermo Fisher Scientific, Inc.) nachgewiesen. Die Bandenintensitäten wurden unter Verwendung der Gelanalysesoftware Image J, Version 1.8.0_112 (National Institutes of Health) quantifiziert.

Klein störend (si) RNS Vorbereitung und Transfektion.Die langen doppelsträngigen RNAs wurden von der Ziel-mRNA des AR und des Östrogenrezeptors (ER) mit den in Tabelle I gezeigten Sequenzen synthetisiert. Die Bedingungen für den siRNA-Knockdown beinhalteten die Transfektion von HUVECs bei 7 0 Prozent Konfluenz, die in nicht-antimikrobiellem Zustand gehalten wurde Kulturmedium in 60 mm kollagenbeschichteten Kulturschalen. Die Transfektion von 5 nM AR-siRNA oder 10 nM ER-siRNA mit Lipofectamine 3000-Reagenz (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) wurde gemäß den Protokollen des Herstellers separat durchgeführt. Die Transfektionseffizienz wurde durch quantitative Reverse-Transkriptions-PcR-Analyse (RT-qPcR) bewertet, wie zuvor berichtet (17). Die Temperaturwechselbedingungen waren wie folgt: 10 min bei 95 °C; 40 Zyklen von 95 ˚C für 5 s und 60 ˚C für 1 min und eine Schmelzkurve bei 95 ˚C für 15 s, 60 ˚C für 1 min und 95 ˚C für 15 s; Für jede Probe wurden drei unabhängige biologische Wiederholungen durchgeführt. Die anschließenden Experimente wurden 48 h nach der Transfektion durchgeführt. Primerpaare wurden unter Verwendung der Software Primer Premier v5.0 (PREMIER Biosoft) mit den folgenden Sequenzen entworfen: AR vorwärts, 5'-GGTTAcAccAAAGGGcTAGAA-3' und rückwärts, 5'-GAcTTGTAGAGAGAcAGGGTAGA-3'; ER vorwärts, 5'-ccAGTAccA ATGAcA AGG GAAG -3' und rückwärts, 5'-TcAcAGGAccAGAcTccATAA-3'; und GAPdH vorwärts, 5'-cAGGGcTGcTTTTAAcTcTGGTAA-3' und rückwärts, 5'-GGGTGGAATcATATTGGAAcATGT-3'.

Statistisch Analyse.Alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Statistische Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests oder der zweifachen ANOVA mit Tukey's post hoc-Test für multiple Vergleiche durchgeführt. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Ergebnisse

EM induziert NEIN Produktion und eNOSphosphorylierung.Wie in 2A und B gezeigt, erhöhte 1 &mgr;M ECH die intrazelluläre NO-Produktion in HUVEcs im Vergleich zu den negativen Kontrollzellen signifikant, während die stimulierende Wirkung von EcH durch Vorbehandlung mit L-NAME auf das Kontrollniveau abgeschwächt wurde. Um die optimale Konzentration zu erhalten, wurde die eNOS-Phosphorylierung 60 Minuten nach der Behandlung mit EcH-Konzentrationen getestet

von {{0}}, 0.01, 0.1, 1 und 10 µM. Die Ergebnisse zeigten, dass EcH in Konzentrationen von 0,01-10 µM die eNOS-Phosphorylierung bei Ser 1177 in einer konzentrationsabhängigen Weise signifikant induzieren kann, wobei die maximale eNOS-Phosphorylierung bei 10 µM EcH-Induktion beobachtet wird (Abb. 2c und d). Darüber hinaus wurde die eNOS-Phosphorylierung an Ser1177 durch Western-Blot-Analyse bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min nach Inkubation mit 1 &mgr;M EcH untersucht. Es wurde beobachtet, dass die eNOS-Phosphorylierung schnell durch EcH bei 5 min ausgelöst wurde und bis zu einer 30-minütigen Inkubation weiter zunahm (Fig. 2E und F). Anschließend blieb das relative Ausmaß der eNOS-Phosphorylierung trotz EcH-Behandlung ab 30 min stabil; daher beeinflusste EcH die Gesamtexpression von eNOS nicht (Fig. 2c und E).

AR vermittelt ECH‑induziert NEIN Produktion und eNOSInterferierende Wirkungen von AR-siRNA-1 und ER-siRNA-2 waren die erfolgreichsten bei der Hemmung der Expression von AR und ER in HUVEcs in der vorliegenden Studie (Abb. 3). Anschließend wurden ein Antagonist für die AR-Funktionshemmungsanalyse und siRNA für die AR-Funktionsverlustanalyse angewendet, um die Beteiligung von AR an der EcH-induzierten eNOS-Aktivierung und NO-Produktion zu bewerten. Wie in Abb. 4A gezeigt, erhöhte 1 µM ECH die NO-Produktion in HUVEcs (P<0.05). pretreatment="" with="" the="" ar="" antagonist="" nilutamide="" (10="" µm)="" abolished="" ech-induced="" no="" production,="" whereas="" ici182789="" (an="" er="" antagonist)="" did="" not="" exert="" the="" same="" effects.="" furthermore,="" the="" effects="" of="" sirna-mediated="" ar="" knockdown="" on="" no="" production="" were="" examined="" in="" cultured="" cells,="" indicating="" that="" no="" production="" was="" diminished="" by="" transfection="" with="" ar="" sirnas;="" however,="" it="" was="" not="" affected="" by="" er="" sirnas="" or="" control="" random="" sirnas="" (fig.="" 4b).="" representative="" western="" blots="" and="" semi-quantitative="" analysis="" (fig.="" 4c="" and="" d)="" revealed="" that="" the="" phosphorylation="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" inhibited="" by="" nilutamide="" and="" ici182789,="" and="" that="" the="" inhibitory="" effect="" of="" nilutamide="" on="" ech-induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" higher="" compared="" with="" that="" of="" ici182789,="" which="" indicated="" that="" inhibi-="" tion="" of="" ar="" function="" had="" a="" greater="" impact="" than="" er="" on="" enos="" phosphorylation="" induced="" by="" ech.="" similarly,="" the="" phosphoryla-="" tion="" of="" enos="" induced="" by="" ech="" was="" reduced="" significantly="" in="" cells="" transfected="" with="" ar-sirna="" and="" er-sirna="" compared="" with="" the="" control="" random="" sirna;="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ar‑sirna="" on="" ech‑induced="" enos="" activation="" was="" significantly="" stronger="" compared="" with="" that="" of="" er-sirna="" (fig.="" 4e="" and="" f).="" therefore,="" the="" aforementioned="" results="" suggested="" that="" ech="" may="" cause="" ar-dependent="" activation="" of="" enos="" to="" induce="" no="" production="" in="">

EM aktiviert das PI3K/Akt Weg.In der vorliegenden Studie wurde die Akt-Phosphorylierung an Ser473 60 min nach EcH-Inkubation bei Konzentrationen von 0, 0.01, 0.1 getestet , 1 und 10 uM. Die Ergebnisse zeigten, dass EcH (0,01-10 µM) die Akt-Phosphorylierung signifikant induzieren kann. Die relativen Expressionsniveaus von p-Akt erreichten ihren Höhepunkt bei 1 und 10 &mgr;M EcH-Behandlung ( 5A und B). Darüber hinaus wurde die Akt-Phosphorylierung durch Western-Blot-Analyse bei 0, 5, 15, 30, 60 und 120 min nach Zugabe von 1 &mgr;M EcH zu HUVEc-Kulturen untersucht. Wie in 5c und d gezeigt, erhöhte EcH schnell die Akt-Phosphorylierung nach 5 min Inkubation, und der maximale Proteinspiegel von p-Akt wurde nach 60 min beobachtet. Im Gegensatz dazu hatte EcH keinen Einfluss auf die gesamte Akt-Expression (Abb. 5A und c). Um die potenzielle Wirkung des PI3K-Signalwegs auf die eNOS-Phosphorylierung zu untersuchen, wurden HUVEcs vor der EcH-Anwendung mit dem PI3K-Inhibitor Wortmannin vorbehandelt. Es wurde festgestellt, dass Wortmannin die EcH-induzierte NO-Produktion auf Grundlinienniveaus reduziert ( 5E ). Ein ähnliches Phänomen wurde unter Verwendung der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet, als die EcH-induzierte DAF-FM-Fluoreszenz untersucht wurde (Abb. 5F). Darüber hinaus kann Wortmannin die Fähigkeit haben, die schnelle eNOS-Phosphorylierung in HUVEcs aufzuheben (Fig. 5G und H). Die oben genannten Ergebnisse legen nahe, dass EcH die eNOS-Phosphorylierung und die NO-Produktion über den PI3K/Akt-Weg aktivieren kann.

Diskussion

EcH ist eine aus Herba isolierte natürliche VerbindungCistanche, mit verschiedenen pharmakologischen Eigenschaften. Es wurde zuvor gezeigt, dass EcH einen Endothel-abhängigen vaskulären Relaxationseffekt ausübt, indem es NO-cGMP-PKG-BKca-Kanäle in glatten Muskelzellen von Blutgefäßen öffnet (7,8). Die aktuellen Ergebnisse belegen, dass ECH eine AR-abhängige Aktivierung von eNOS ausübte, um die NO-Produktion unter Beteiligung des PI3K/Akt-Signalwegs in vaskulären Endothelzellen zu induzieren.

Als innerste Schicht der Gefäßwand kann das Endothel Veränderungen im Blutfluss schnell wahrnehmen und darauf reagieren, was wiederum zu einer Signalübertragung an die darunter liegenden glatten Muskelzellen führt, um den Gefäßtonus zu regulieren (18). Es wurde vielfach berichtet, dass mehrere von Endothelien abgeleitete vasodilatatorische Verbindungen existieren, wobei die Substanz am meisten prototypisch istNO ist, das aus der endothelialen Isoform von eNOS gebildet wird, was zu einer Phosphorylierung führt (19). Unter normalen Bedingungen bleibt eNOS inaktiv, wenn es an Caveolin gebunden ist, und wird mit der folgenden Abfolge von Ereignissen im Endothel aktiviertZellen: i) eNOS dissoziiert von Caveolin-1 und assoziiert mit ca2 plus /caM; ii) Hitzeschockprotein (HSP)90 fördert eNOSDimerisierung und begünstigt eine sterische Bildung zur Rekrutierung von Akt; und iii) Calcineurin dephosphoryliert Thr495, um den Aktivierungszustand (20) zu verstärken. In der vorliegenden Studie war die NO-Produktion bei mit 1 µM ECH behandelten HUVECs signifikant erhöht. Dieses Phänomen ähnelte früheren Ergebnissen, bei denen EcH die NO-Freisetzung erhöhte und die Synthese von cGMP in thorakalen Aortenringen von Ratten stimulierte (7). Darüber hinaus scheinen zwei Phosphorylierungsstellen, Ser1177 und Thr495, besonders wichtig für die Regulierung der eNOS-Aktivität zu sein (20), und die vorliegende Studie zeigte, dass EcH eine akute eNOS-Phosphorylierung an Ser1177 in einer konzentrationsabhängigen Weise induzierte. Darüber hinaus bestimmen die Stimuli, die mit den Auswirkungen auf die eNOS-Proteinspiegel verbunden sind, hauptsächlich die eNOS-mRNA-Stabilität, und wenn der Stimulus über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten wird, erfolgt die eNOS-mRNA-Transkription über die mitogenaktivierte Proteinkinase und den Kernfaktor κB (20). Zusammengenommen weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass die Aktivierung von eNOS bei Ser1177 für die durch EcH induzierte NO-Synthese verantwortlich ist.

Darüber hinaus hat eine zunehmende Zahl von Studien gezeigt, dass AR in Endothelzellen in einer Reihe von menschlichen Geweben exprimiert wird, was auf eine potenzielle Rolle von Androgenen und ihren Analoga hindeutet, die durch AR-vermittelte Prozesse bei der Modulation des menschlichen Endothels wirken Zellhomöostase (21). Im nicht-klassischen PI3K/Akt-Weg kann AR PI3K aktivieren, indem es direkt mit der regulatorischen PI3K-Untereinheit p85 interagiert (22). Die vorliegende Studie zeigte, dass ein AR-Antagonist oder eine AR-siRNA die durch EcH in HUVEcs induzierte NO-Produktion und eNOS-Phosphorylierung verringerte. Es wurde zuvor berichtet, dass Östrogene die eNOS-Phosphorylierung induzieren und die NO-Produktion über die klassische ER-Aktivierung in Endothelzellen stimulieren (23), und die Verabreichung von ECH die Expression von ER im Uterus signifikant verstärkt (24). In der vorliegenden Studie war jedoch die Wirkung von AR im Vergleich zu der von ER auf die EcH-induzierte eNOS-Aktivierung und NO-Produktion stärker ausgeprägt. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass EcH innerhalb von Minuten über die AR-beteiligte eNOS-Aktivierung in HUVEcs eine akute NO-Produktion verursachte, was mit der nicht-genomischen Natur der Reaktion in Endothelzellen übereinstimmt. Das AR ist mit Gerüstproteinen, einschließlich HSP90, HSP70 und Kinase Src, im Zytoplasma assoziiert und kann innerhalb von 5 Minuten nach der Testosteronbehandlung vom AR-Komplex zur Membran transportiert werden (23). Basierend auf der „Target Fishing“-Strategie wurde HSP90 als PhGs-gekoppeltes Target identifiziert, was darauf hinwies, dass EcH die Dissoziation von AR von den Gerüstproteinen erleichtern könnte (25). Eine andere Studie legte nahe, dass sich EcH im Hypothalamus mit der AR-Tasche an den Aminosäuren Met-894 und Val{-713 verbinden und den Transport von zytoplasmatischem AR zum Kern hemmen könnte (26). Der zugrunde liegende Mechanismus, durch den EcH die zytoplasmatische AR-Translokation zur Membran vermittelt, erfordert jedoch weitere Untersuchungen. Daher ist weitere Forschung erforderlich, um den Mechanismus aufzuklären, durch den EcH eine AR-abhängige eNOS-Aktivierung erreicht, und wie er mit der Bindung an HSP90 in vaskulären Endothelzellen in Verbindung gebracht werden kann.

Der PI3K/Akt-Weg ist eine der wichtigsten Signalkaskaden, deren Aktivierung durch die Produktion von Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat induziert wird, um die N-terminale Pleckstrin-Homologiedomäne der Ser/ Thr-Kinase Akt. Dies erleichtert die Rekrutierung von Akt zur Plasmamembran (27). Der PI3K/Akt-Weg spielt möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der durch EcH induzierten NO-abhängigen Relaxation.

Die vorliegende Studie zeigte, dass die EcH-induzierte NO-Produktion signifikant reduziert war, wenn die Zellen mit dem PI3K-Inhibitor Wortmannin inkubiert wurden. Ein früherer Bericht zeigte, dass 15 mg/kg EcH den PI3K/Akt-Signalweg in 5-Fluorouracil-supprimierten Knochenmarkszellen aktivierten (28). In der vorliegenden Studie verringerten PI3K-Inhibitoren die EcH-induzierte eNOS-Phosphorylierung bei Ser1177 signifikant. Darüber hinaus wurde die Akt-Aktivität überwiegend durch vorgeschaltete Regulationswege reguliert, insbesondere durch die PI3K-abhängige Phosphorylierung an Ser473 (20). In der vorliegenden Studie induzierte EcH dosisabhängig die Akt-Phosphorylierung an Ser473; In ähnlicher Weise zeigte eine frühere Studie, dass 5, 10 oder 20 µM EcH eine dosisabhängige kardioprotektive Wirkung gegen eine Anoxie-/Reperfusionsbehandlung ausübten, indem sie möglicherweise p-Akt und SLc8A3 hochregulierten (29). Die Transkriptionsregulation des Akt-Gens ist noch weitgehend unbekannt (30); Daher konzentrierte sich die vorliegende Studie auf die posttranskriptionalen regulatorischen Wirkungen von EcH auf Akt. Unter Berücksichtigung der oben genannten Ergebnisse wurde gefolgert, dass die Anwendung von EcH auf HUVEcs zur Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs führen kann, der eNOS phosphoryliert und anschließend die NO-Produktion erhöht.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EcH ein Naturprodukt ist, das hauptsächlich aus Herba isoliert wirdCistanche.Der potenzielle Mechanismus, der der EcH-induzierten NO-Produktion in Endothelzellen zugrunde liegt, kann Folgendes umfassen ( 6 ): i) EcH wirkt als funktioneller Ligand von AR, der in den Caveolae in der Zellmembran lokalisiert ist; ii) PI3K bindet an die hydrophobe Domäne von Akt bei Ser473 und erleichtert die Rekrutierung von Akt zur Zellmembran; iii) die Rekrutierung der PI3K/Akt-Kaskaden löst die AR-abhängige eNOS-Phosphorylierung aus; und iv) die Erzeugung von NO wird durch eNOS in Endothelzellen vermittelt. Die Beobachtung, dass EcH die NO-Produktion durch die AR-abhängige Phosphorylierung von eNOS unter Beteiligung des PI3K/Akt-Signalwegs induziert, kann zum weiteren Verständnis der gefäßerweiternden Wirkung von EcH beitragen. Darüber hinaus kann das EcH, das auf die vom Endothel stammenden NO-Wege abzielt, auf nicht-genomische Effekte zurückzuführen sein. Daher kann die vorliegende Studie dazu beitragen, die Mechanismen aufzuklären, durch die EcH seine pharmakologischen Wirkungen zur Vorbeugung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen ausübt.

Danksagungen

Unzutreffend.

Finanzierung

Die vorliegende Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Fördernummer 81503333).

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Die während der vorliegenden Studie generierten und analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim korrespondierenden Autor erhältlich.

Autoren Beiträge

LG und XL konzipierten und gestalteten die Experimente. dL und YZ führten die Experimente durch. WZ und JG analysierten die Daten. LG hat das Manuskript entworfen. XL überprüfte und redigierte das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

1202 GEet Al: ECHINACOSID INDUZIERT DIE STICKOXIDPRODUKTION DURCH AR-ABHÄNGIGEN PI3K/AKT-WEG

Ethik die Genehmigung und Zustimmung zu sich beteiligen

Unzutreffend.

Geduldig Zustimmung zum Veröffentlichung

Unzutreffend.

Konkurrieren Interessen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

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