Kombinatorische Genetikmethoden zur Entdeckung regulatorischer Kombinationen höherer Ordnung und zur Entwicklung genetischer Treiber für die neuronale Differenzierung

Eintauchen in die Suche nach wirksamen Zelldifferenzierungsfaktoren

Forscher sind immer noch auf der Suche nach besseren Therapeutika, um das Fortschreiten neurologischer Erkrankungen wie der Parkinson-Krankheit, der Alzheimer-Krankheit und der Huntington-Krankheit umzukehren oder zu verlangsamen. Diese Störungen sind die Folge des Absterbens neuronaler Zellen in verschiedenen Teilen des Gehirns. Medikamente oder Behandlungen zur Linderung der Symptome bei Patienten sind nicht gut etabliert.

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Sie stellen das geschädigte Nervengewebe nicht wieder her und können zu unerwünschten Nebenwirkungen führen. Daher betrachten immer mehr Studien Stammzellen als vielversprechendes Therapeutikum, da sie sich selbst erneuern und flexibel in gewünschte Zelllinien differenzieren können, um sie dem Patienten einzupflanzen und das verlorene Nervengewebe wiederherzustellen.

Bevor Stammzellen jedoch klinisch zur Behandlung neurologischer Erkrankungen eingesetzt werden können, gibt es noch Bereiche, die eines besseren Verständnisses bedürfen, um ihr volles Potenzial auszuschöpfen. Stammzellen sind regenerativ und formbar und neigen dazu, sich in jeden beliebigen Zelltyp umzuwandeln, sofern die richtigen Faktoren für die Differenzierung gegeben sind. Allerdings weist das große Netzwerk von Faktoren eine große Komplexität auf.

Es ist wichtig, die Kombinationen von Transkriptionsfaktoren (TF), kleinen Molekülen und/oder Wachstumsfaktoren zu bestimmen, um den optimalen Synergismus für die Differenzierung von Stammzellen, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen, mit der schnellsten Geschwindigkeit zu erreichen in der reinsten Population einer neuronalen Linie. Es könnte jedoch eine strategische Möglichkeit geben, diese Faktoren kosteneffizienter und zeiteffizienter zu prüfen.

Dies würde dazu beitragen, die bereits etablierten Protokolle zu optimieren, die noch mühsam sind, oder zur weiteren Charakterisierung neuronaler Subtypen wie mittelgroßer stacheliger Neuronen, sensorischer Neuronen und serotonerger Neuronen. Es bleibt eine Herausforderung, die Treiber des neuronalen Schicksals umfassend zu profilieren und zu definieren, wie diese Elemente im regulatorischen Netzwerk miteinander interagieren.

Einige Gruppen haben neue Hochdurchsatz-Screening-Ansätze verwendet, um das regulatorische Netzwerk des Zellschicksals aufzuklären und informative Einblicke in Faktoren zu liefern, die die neuronale Umwandlung und das Überleben steuern. Liu et al. (2018) nutzten die CRISPR-Aktivierung (CRISPRa), um nach TFs oder DNA-Bindungsfaktoren zu suchen, die das neuronale Schicksal von ESCs fördern. Allerdings beschränkte sich die Arbeit auf die Untersuchung einzelner Faktoren oder paarweiser Kombinationen.

Ein weiteres systematisches Screening wurde von Tsunemoto et al. durchgeführt. (2018), das die Beziehung zwischen TFs untersuchte. Die meisten ihrer ausgewählten einzelnen TF zeigten in der Studie keine Auswirkungen, sie identifizierten jedoch 76 paarweise TF-Kombinationen, um die Differenzierung von Mausfibroblasten zu induzierten Neuronen zu fördern.

Bemerkenswert ist, dass ihre Ergebnisse in gewisser Weise nicht mit früheren Studien übereinstimmten, beispielsweise weil der Dopamin-aktive Transporter Slc6a3 in induzierten Neuronen nicht nachgewiesen wurde, was möglicherweise daran lag, dass zusätzliche Faktoren nicht berücksichtigt wurden. Eine andere Studie bestimmte die wesentlichen Gene, um das Überleben von Neuronen aufrechtzuerhalten oder zu verbessern, indem sie ein auf CRISPR-Interferenz (CRISPRi) basierendes Screening durchführte (Tian et al., 2019). Auch hier beschränkten sie sich auf das Screening einzelner sgRNAs.

Für ein unvoreingenommenes Screening auf andere genetische Faktoren und um die Anzahl der Faktorkombinationen zu erhöhen, sind weitere Studien erforderlich, da gezeigt wurde, dass in verschiedenen Kontexten ein Cocktail aus mehr als zwei Faktoren erforderlich sein kann, um Differenzierung und Neuprogrammierung effizient voranzutreiben.

Ein gutes Beispiel ist die Kombination von Oct4, Sox2, Klf4 und c-Myc, die für die Regulierung des Entwicklungssignalnetzwerks für die Pluripotenz von ESCs notwendig ist (Takahashi und Yamanaka, 2006). In solch komplexen Systemen besteht die Notwendigkeit, die Funktionen von genetischen Kombinationen höherer Ordnung umfassend und mit hohem Durchsatz zu charakterisieren, und die CombiGEM-Methode (Combinatorial Genetics En Masse) ist möglicherweise genau dazu in der Lage.

CombiGEM-Methode für ein Hochdurchsatz-, hochgeordnetes und systematisches Screening von Faktorkombinationen

CombiGEM bietet nicht nur eine systematische Möglichkeit zur Durchführung groß angelegter gepoolter Screens, sondern verfügt auch über die Möglichkeit, kombinatorische Genbibliotheken höherer Ordnung skalierbar zusammenzustellen (Wong et al., 2015, 2016; Zhou et al., 2020). Das Eintopfverfahren ermöglicht es dem Benutzer, nach einer Vielzahl genetischer Kombinationen zu suchen; 1-way, 2-way, 3-way und theoretisch n-way-Bibliotheken.

Dies stellt eine schnelle Alternative zum herkömmlichen Prozess der Erstellung und Prüfung einzelner Interessenkombinationen dar. Während mehrere andere kombinatorische CRISPR-Screening-Strategien auch für die Untersuchung paarweiser genetischer Kombinationen entwickelt wurden (Han et al., 2017; Shen et al., 2017; Najm et al., 2018; Truong et al., 2019; DeWeirdt et al., 2020). ) bietet CombiGEM eine einzigartige Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen drei oder mehr genetischen Kombinationen zu bewerten.

Wenn der Benutzer beispielsweise CRISPRa oder CRISPRi zum Überexprimieren bzw. Unterdrücken einer Liste in Frage kommender TF-Kombinationen verwenden möchte, könnte man mit CombiGEM-CRISPR v2 eine Barcode-Bibliothek von TF-Targeting-sgRNA-Kombinationen durchsuchen.0 ( Wong et al., 2016; Zhou et al., 2020), wie in Abbildung 1 dargestellt.

Mithilfe von Eintopf-Ligationsschritten werden die sgRNA-Bibliothek und ihre jeweiligen Barcodes in einen lentiviralen Zielvektor eingebaut, der die Expression eines fluoreszierenden Proteins bei Aktivierung eines für den Neuronenzelltyp spezifischen Promotors wie Tubulin 1 meldet. Die Bibliothek aus sgRNAs und einem separaten lentiviralen Vektor, der das enzymatisch defiziente Cas9 enthält und entweder mit einem Transkriptionsaktivator oder -repressor fusioniert ist, können in die gewünschten Ausgangszellen transportiert werden.

Mit der Zeit, wenn sich die Zellen zu differenzieren beginnen, exprimieren nur induzierte neuronenähnliche Zellen Fluoreszenz, und diese Zellen können mithilfe der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung isoliert werden, um ihre beherbergenden TF-Kombinationen über Barcode-Sequenzierung abzurufen.

Um ein besseres Verständnis der Kombinationen zu erhalten, die bestimmte Zelllinien bestimmen, können diese Zellen auch auf bekannte Zelllinien-Reporter oder -Marker untersucht werden, basierend auf der Präferenz der Differenzierungsstadien, die der Benutzer zu untersuchen wählt. Die magnetisch aktivierte Zellsortierung könnte verwendet werden, um interessierende Zellen abhängig von der Expression der Zelloberflächenmarker zu trennen.

Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung könnte mit dem kombinatorischen CRISPR-Screening gekoppelt werden, um die Art und das Ausmaß der Hoch- oder Herunterregulierung von Genen zu profilieren, und die Kombination gezielter TFs kann über die Barcode-Lesevorgänge bestimmt werden (Replogle et al., 2020). High-Content-Bildgebung könnte verwendet werden, um die Veränderungen der Zellmorphologie vom frühen bis zum späteren Stadium der Neuronenentwicklung zu überwachen.

Die physiologische Relevanz oder Funktionalität der induzierten neuronenähnlichen Zellen kann durch immunzytochemische Markierung, die für die Neuronenreifung spezifisch ist, wie NeuN, TUJ1 und MAP2, sowie elektrophysiologische Messungen bestimmt werden. Wie bereits erwähnt, haben Studien TF und kleine Moleküle kombiniert, um das Zellschicksal zu manipulieren.

CombiGEM kann auch verwendet werden, um Kombinationen kleiner Moleküle zu identifizieren, die die Selbsterneuerung von Stammzellen aufrechterhalten, die Differenzierung von Zelllinien induzieren oder die Neuprogrammierung erleichtern können, indem sie die Effizienz steigern und möglicherweise genetische Faktoren ersetzen. CombiGEM kann auch angewendet werden, indem zunächst die kleinen Molekülziele von Signalwegen, epigenetischen oder zellulären Prozessfaktoren bestimmt werden.

Anschließend kann man durch den Entwurf einer sgRNA-Bibliothek zur Aktivierung oder Inaktivierung der wirkstoffverfügbaren Ziele die wirksamen Kombinationen kleiner Moleküle identifizieren, um die Differenzierung oder Neuprogrammierung zu verbessern. Dieses Konzept spiegelt sich gut in den Studien wider, die wir zuvor durchgeführt haben, um Wirkstoffkombinationen gegen Krebs und die Parkinson-Krankheit zu entdecken (Zhou et al., 2020).

Die Verwendung von CombiGEM ist nicht nur auf CRISPR-basierte Störungen beschränkt, sondern könnte auch auf andere DNA- oder RNA-Regulationsfaktoren angewendet werden, um Funktionsverlust-Screens mit RNA-Interferenz sowie Funktionsgewinn-Screens mit der Expression zu untersuchen von microRNAs (Wong et al., 2015) und sequenzverifizierten menschlichen offenen Leserahmen, wie sie in der menschlichen TFome-Bibliothek beschrieben werden (Ng et al., 2020).

CombiSEAL-Methode für das Hochdurchsatz-Engineering von Transkriptionsfaktoren

Das Finden der idealen Kombination natürlich vorkommender genetischer Faktoren kann immer noch eine Herausforderung darstellen, z. B. die Beschränkung auf charakterisierte TFs des Genoms mit Vorkenntnissen über deren Expression und Rolle bei der Differenzierung. Studien haben gezeigt, dass die Entwicklung von TFs oder die Erzeugung künstlicher Transkriptionsfaktoren eine neue Möglichkeit eröffnet, die Differenzierungsrate über alternative Wege zu beschleunigen, die Abhängigkeit von der erforderlichen Expression anderer endogener Co-Faktoren innerhalb des Genregulationsnetzwerks zu überwinden oder sie ganz zu ersetzen natürliche TFs mit effizienteren (Jauch, 2018).

Dadurch können Forscher die erforderlichen Faktoren entsprechend ihren experimentellen Anforderungen anpassen. Wir schlagen vor, dass sich CombiSEAL als nützliche Plattform erweisen könnte, wenn man eine Hochdurchsatzmutagenese an mehreren Standorten an einem TF durchführen möchte, der verschiedene Domänen umfasst (Choi et al., 2019). Die CombiSEAL-Methode setzt Aminosäure-kodierende DNA-Fragmente zusammen, die kombinatorisch mit Barcodes versehen werden (Abbildung 1).

Abbildung 1 ｜ CombiGEM- und CombiSEAL-Methoden zum Screening nach wirksamen genetischen Treibern der Differenzierung. Ein Beispiel für die CombiGEM-Methode ist der Zusammenbau mehrerer sgRNAs, die aus demselben Konstrukt exprimiert werden, und die sgRNA-Kombinationen werden durch ihre verketteten Barcodes dargestellt. Die CombiSEAL-Methode umfasst Mutationen, die in verschiedene Teile eines Proteins eingeführt werden, beispielsweise Transkriptionsfaktoren, angegeben als P1, P2, P(n) und P(n plus 1). Und die Mutationskombinationen werden durch die entsprechenden verketteten Barcodes widergespiegelt. Der Benutzer kann die Setups auf andere DNA-Abgabesysteme anwenden. In dieser Darstellung werden lentivirale Vektoren verwendet. Screening-Strategien können in einem gepoolten Format durchgeführt werden. In diesem Beispiel wird die Identifizierung von Zellpopulationen, die sich zu einer bestimmten Neuronenlinie differenzieren, durch Aktivierung des Promotors für die Expression fluoreszierender Proteine ​​nachgewiesen, im Diagramm als X-Fluoreszenz gekennzeichnet. Die Next-Generation-Sequenzierung (NGS) der Barcodes aus dem Zellpool wird die DNA-Ziele oder Transkriptionsvariante(n) entschlüsseln. Für eine strenge Analyse der Faktoren, die die Differenzierung verschiedener Neuronentypen vorantreiben, könnten Array-basierte Methoden wie die Untersuchung von Zellen mit Zelllinienmarkern und anschließende magnetisch aktivierte Zellsortierung (MACS) in Platten mit mehreren Vertiefungen zum Einsatz kommen, die anschließend durchgeführt werden können High-Content-Bildgebung. Alternativ ermöglicht die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) dem Benutzer die Profilierung der Genexpression von Zellen mit den gewünschten Phänotypen und wäre in der Lage, die Barcodes abzurufen, um sgRNA-Kombinationen oder Mutationskombinationen der Schlüsselvariante(n) zu identifizieren. FACS: Fluoreszenzaktivierte Zellsortierung.

CombiSEAL beginnt mit dem ersten Schneiden von Teilen des Proteins, an denen Mutagenese erwünscht ist. Der Benutzer kann für jeden Abschnitt eine beliebige Anzahl von Varianten generieren und diese dann mit Barcodes versehen, um die Position und Kombination der Mutationen zu identifizieren. Jeder Abschnittspool wird dann nacheinander zusammengesetzt, indem er in einen Zielvektor eingefügt wird, der die Wildtyp-Proteinsequenz enthält, die mit flankierenden IIS-Enzymen im Bereich der beabsichtigten Mutagenese modifiziert wurde.

Dieses narbenlose Fusionsschema zur Verknüpfung mehrerer Teile eines Proteins ist wichtig, um die Hinzufügung unerwünschter Aminosäuren zum Protein zu vermeiden. Mit der CombiSEAL-Methode können die Aminosäuresequenzen des ausgewählten Pools von interessierenden Varianten effizienter und kostengünstiger bestimmt werden, wodurch die Notwendigkeit einer langwierigen Sequenzierung des gesamten Proteins zur Identifizierung der Mutationstypen und ihrer Lage im gesamten Protein entfällt Eiweiß.

Dieser methodische Aufbau ermöglicht eine einfachere Analyse, indem eine Hochdurchsatzsequenzierung des Pools kurzer verketteter Barcodes durchgeführt wird, die auf die Kombination von Typen und Positionen von Aminosäuremutationen oder anderen gewünschten Modifikationen wie Domänenaustausch, Insertion und Deletion schließen lässt ursprünglich entworfen und auf dem TF installiert

Abschluss

Im Vergleich zu Trial-and-Error-Methoden wurden Fortschritte bei der Verwendung systematischerer Ansätze zur Bestimmung der wesentlichen Faktoren oder Kombinationen erzielt, die erforderlich sind, um die Umwandlung eines Zelltyps in eine neuronale Linie voranzutreiben. Es fehlte jedoch die Möglichkeit, Kombinationen höherer Ordnung zu identifizieren, und hier schlagen wir vor, dass die CombiGEM-Methode solche Einschränkungen möglicherweise beheben kann.

CombiGEM verwendet ein barcodiertes Eintopf-Ligationssystem, um Kombinationen von DNA-Bindungsfaktoren höherer Ordnung für die Ziel-DNA auf einmal zusammenzusetzen. Dadurch wird der Prozess mehrerer Screening-Runden umgangen, um die Anzahl der Treffer auf eine überschaubare Größe für nachgelagerte Validierungen einzugrenzen . Darüber hinaus können weniger effiziente natürliche TFs durch künstliche oder manipulierte TFs ersetzt werden, um die Genexpression besser zu regulieren. Wir beschreiben eine Protein-Mutagenese-Methode, CombiSEAL, die es Benutzern ermöglicht, große Pools von Transkriptionsfaktor-Varianten zu erstellen, indem sie mehrere Standortmutationen, die mit Barcodes markiert sind, innerhalb des Proteins und seiner verschiedenen Domänen einfach zusammenfügen.

Dies wird die Screening-Verfahren beschleunigen und die Kosten senken, um Informationen über die Mutationstypen der interessierenden Varianten zu erhalten. Wir hoffen, dass die vorgeschlagenen Methoden zum besseren Verständnis und zur Erweiterung der Möglichkeiten zur Förderung der neuronalen Regeneration beitragen und auf andere Forschungsbereiche umfassend anwendbar sein können.

Der Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von Cistanche

Es wurde gezeigt, dass Cistanche über verschiedene Mechanismen eine neuroprotektive Wirkung hat:

1. Entzündungshemmende Wirkung: Cistanche enthält Verbindungen, die nachweislich Entzündungen in verschiedenen Teilen des Gehirns hemmen und so dazu beitragen können, Neuronen vor Schäden zu schützen.

2. Antioxidative Wirkung: Cistanche enthält Verbindungen mit starken antioxidativen Eigenschaften. Antioxidantien tragen dazu bei, Neuronen vor Schäden durch freie Radikale und oxidativen Stress zu schützen.

3. Regulierung von Neurotransmittern: Cistanche reguliert nachweislich bestimmte Neurotransmitter wie Serotonin und Dopamin, was zum Schutz von Neuronen und zur Verbesserung der kognitiven Funktion beitragen kann.

4. Stimulation des neurotrophen Faktors: Cistanche stimuliert nachweislich die Produktion neurotropher Faktoren, wie z. B. des aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktors (BDNF), der das Wachstum und Überleben von Neuronen fördern kann.

Insgesamt wirken diese Mechanismen zusammen, um Neuronen vor Schäden zu schützen, ihr Wachstum und Überleben zu fördern und die kognitiven Funktionen zu verbessern.

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