Nachweis der humoralen und zellulären Immunantwort auf den Anti-SARS-CoV-2-Impfstoff BNT162b2 bei stillenden Frauen sowie naiven und zuvor infizierten Personen

Diese Studie untersuchte humorale und zelluläre Reaktionen auf den Anti-SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoff BNT162b2 bei stillenden Frauen sowie naiven und seropositiven Personen in den ersten sechs Monaten nach der Impfung. In die Studie wurden 61 Freiwillige aufgenommen, die mit zwei Dosen des mRNA-Impfstoffs BNT162b2 geimpft wurden. Der eigens entwickelte ELISA wurde zur Quantifizierung von SARS-CoV-2 RBD-spezifischen Antikörpern verwendet. Die Expression von Zelloberflächenmarkern und die intrazelluläre IFN-Analyse wurden mittels Durchflusszytometrie durchgeführt. Die Konzentrationen von IFN-, IL-6 und TNF wurden durch ELISA bestimmt. Ein signifikanter Anstieg der Anti-RBD-IgG-Antikörperspiegel wurde 14 Tage nach der ersten Impfstoffdosis beobachtet (S< 0.0001) in serum and milk. The expression of CD28 on CD4+ T cells was significantly higher compared to baseline (p< 0.05). There was a significant increase (p≤ 0.05) in the B cell lymphocyte subset after revaccination and an increased percentage of CD80+ B cells. The expression of IFN-γ in peripheral blood lymphocytes, CD3+ T cells, and serum was significantly increased (p< 0.05). No significant difference in immune response was observed between breastfeeding women and other study participants. The anti-SARS CoV-2 BNT162b2 mRNA vaccine induced measurable and durable immune response in breastfeeding women and naïve and previously infected individuals. 

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1. Einleitung 

Die weltweite Verbreitung des SARS-CoV-2-Virus nach der Registrierung des ersten Sonderfalls am 31. Dezember 2019 in Wuhan, China, führte zu einer weltweiten Pandemie der Coronavirus-Krankheit-19 (COVID{{ 5}}), mit rund 648 Millionen Fällen und 6,6 Millionen Todesfällen bis zum 18. Dezember 20221. Die Mortalität bei COVID-19 wurde mit einer übermäßigen Produktion von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-6, TNF- und anderen in Verbindung gebracht IL-1, der sogenannte „Zytokinsturm“, der zu einem akuten Atemnotsyndrom und ausgedehnten Gewebeschäden führen kann, die zum Versagen mehrerer Organe führen können2. Es wurde jedoch erwartet, dass rasche Verbesserungen in der Diagnostik, Behandlung und Einführung von Impfungen zu einem stetigen Rückgang der Zahl infizierter Personen, der Notwendigkeit von Krankenhausaufenthalten und letztendlich zu einer Verringerung der Sterblichkeitsrate beitragen würden. In Serbien trat der erste offiziell registrierte Fall am 6. März 2020 auf und die Impfung wurde am 24. Dezember 2020 eingeleitet. Derzeit stehen der allgemeinen Bevölkerung vier Impfstoffe zur Verfügung: Vero Cell–Inactivated (Sinopharm), Vaxzevria (ChAdOx{{ 22}}S [rekombinant], AstraZeneca), Sputnik V (Gam-COVID-Vac, Gamaleya) und Comirnaty (BNT162b2, BioNTech–Pfizer). Neben der Produktion spezifischer Antikörper erfordert die wirksame Immunantwort gegen SARS-CoV-2 die Aktivierung der zellulären Immunität. Es wird erwartet, dass die Komponenten der zellulären Immunität, darunter Helfer-CD4+- und zytotoxische CD8+-T-Zellen, natürliche Killerzellen (NK) und B-Zellen, innerhalb der ersten Stunden und Tage nach der Exposition gegenüber diesem Virus auftreten Reduzieren Sie Krankheitssymptome und verhindern Sie das Fortschreiten der Krankheit, Krankenhausaufenthalte und den Tod. Aktivierte T-Helferzellen (T) können infizierte Zellen indirekt abtöten und die B-Zell-Funktion und Antikörperantwort unterstützen, indem sie Interferon-(IFN-)3,4 produzieren. Es wurde gezeigt, dass der T1-Phänotyp mit einem geringeren Schweregrad der COVID-19-Erkrankung verbunden ist5, daher sollten Strategien für die Entwicklung von COVID-19-Impfstoffen auch die Möglichkeit der Aktivierung von T-Zellen für die IFN-Produktion berücksichtigen. Berichten zufolge ist die zelluläre Immunität gegen SARS-CoV-2 bis zu 6 Monate nach der Infektion bei über 90 % der Personen nachweisbar6. Daher wurde erwartet, dass die Impfung zu einer messbaren zellulären Immunität führen würde, die zum Kampf gegen die Pandemie beitragen würde. Neue Ergebnisse haben gezeigt, dass Anti-SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe neben der Aktivierung von B-Zellen in Keimzentren7 auch Spike-Protein-spezifische CD4+- und CD{53}}-T-Zell-Reaktionen erzeugen sollten8. Obwohl der Antikörpertiter normalerweise mit der Wirksamkeit des Impfstoffs korreliert, sind B- und T-Zellen für den Schutz bei erneuter Exposition gegenüber Virusantigenen wichtig. Es wird erwartet, dass diese Gedächtnis-B- und -T-Zellen durch SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoffe erzeugt werden und eine Rolle bei der Kontrolle der Replikation des Virus spielen und die Virusverbreitung begrenzen9. Obwohl keine schwerwiegenden unerwünschten Ereignisse gemeldet wurden, wird die spezifische Reaktion auf die Impfung gegen SARS-CoV-2 bei schwangeren und stillenden Frauen und Säuglingen, deren Mütter den Impfstoff während der Stillzeit erhalten haben, noch evaluiert und bleibt ein kontroverses Thema10,11. Ziel dieser Forschung war es, zum ersten Mal die monatlichen humoralen und zellulären Reaktionen auf den Anti-SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoff BNT162b2 bei stillenden Frauen sowie bei naiven und seropositiven Personen in den ersten sechs Monaten nach der Impfung in Serbien zu untersuchen eine zweijährige selbstberichtete Nachbeobachtung der Langzeitsicherheit.

Material und Methoden

Studiendesign sowie Probensammlung und -verarbeitung.

Insgesamt 61 Freiwillige (45 SARS-CoV-2-naiv, 16 SARS-CoV-2 genesen gemäß PCR-bestätigten Berichten) wurden in die Studie aufgenommen und im Zeitraum von Januar bis 2. November überwacht. {11}}21. Die durchschnittliche Zeit zwischen natürlicher Infektion und Impfung betrug bei zuvor infizierten Personen 3,18 ± 0,98 Monate, mit einer Spanne von 2–5 Monaten. Alle Teilnehmer waren zum Zeitpunkt der Impfung älter als 18 Jahre und zeigten keine Anzeichen von Atemwegsinfektionen. Die meisten Teilnehmer waren Gesundheitspersonal des Instituts für Onkologie und Radiologie Serbiens (44; 72 %). Die Teilnehmer wurden mit zwei Dosen des BNT162b2-mRNA-Impfstoffs (im Abstand von 3 Wochen) geimpft. Alle Blutabnahmen wurden in zugelassenen medizinischen Zentren unter strengen Protokollen und unter strenger Beobachtung durchgeführt. Vier Teilnehmer waren stillende Mütter, die freiwillig passende Blut- und Milchproben zur Verfügung stellten. Die Proben wurden zu 6-Zeitpunkten entnommen: Punkt 1 – Vorimpfung (Grundlinie), Punkt 2–14 Tage nach der Grundimmunisierung, Punkt 3–1 Monat nach der Grundimmunisierung, Punkt 4–2 Monate nach der Grundimmunisierung, Punkt 5–3 Monate nach der Grundimmunisierung und Punkt 6–6 Monate nach der Grundimmunisierung. Zu jedem Zeitpunkt wurden 10–20 ml peripheres Blut sowie 1 ml Milch von 4 teilnehmenden stillenden Frauen entnommen. Serum wurde aus peripherem Blut durch Zentrifugation unmittelbar nach der Blutentnahme gewonnen und bei –20 Grad gelagert. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) wurden aus heparinisiertem Blut unter Verwendung eines Lymphoprep-Dichtegradienten (Nypacon, Oslo, Norwegen) isoliert, 40 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert und dreimal in RPMI 1640-Kulturmedium (CM) (Sigma, St. Louis) gewaschen , MO), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS) (Sigma, St. Louis, MO). Nach dem Waschen wurde PBMC sofort für die immunphänotypische Analyse verwendet. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Instituts für Onkologie und Radiologie Serbiens genehmigt (Nr. 899–01 vom 01.04.2021) und alle Teilnehmer unterzeichneten eine Einverständniserklärung. Alle Teilnehmer wurden von erfahrenem medizinischem Personal befragt. Zwei Jahre nach der ersten Impfdosis wurde eine langfristige selbstberichtete Nachbeobachtung der Nebenwirkungen nach der Impfung durchgeführt.

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Nachweis und Quantifizierung von SARS-CoV-2 RBD-spezifischen Antikörpern.

Die Expression von RBD des SARS-CoV-2-Spike-Proteins (NCBI: YP_009724390, AA319-541) wurde in der HEK-293-T-Zelllinie nach einem zuvor veröffentlichten Verfahren12 durchgeführt . Das rekombinante Protein wurde bis zur Homogenität gereinigt und die erhaltene Ausbeute betrug 5{{20}}0 mg pro L Zellkultur. Kurz gesagt, das rekombinante RBD-Protein wurde zum Beschichten von 96-Well-Platten mit Fettboden (Thermo Scientific NUNC-MaxiSorp, USA) in einer Endkonzentration von 10 μg/ml (50 μl/Well) in Beschichtungspuffer (15 mM) verwendet Na2CO3/35 mM NaHCO3, pH 9,5) bei 4 Grad über Nacht. Die Platten wurden mit TBS, das 0,05 % Tween 20 (TBST) enthielt, gewaschen und mit 1 % BSA in TBST für 2 Stunden bei 37 Grad blockiert. Verdünnte Seren wurden 1 Stunde lang bei 37 Grad in TBST mit 0,1 % BSA inkubiert und dann wurden die Platten mit TBST gewaschen. Zur Bestimmung des gesamten spezifischen IgG wurde Ziegen-Anti-Human-IgG-AP-konjugierter Antikörper (Novus Biologicals, USA) 1/1000 in Blockierungslösung verdünnt und in die Vertiefungen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde bei 37 Grad wurden die Platten fünfmal mit TBST gewaschen und mit 4-Nitrophenylphosphat 1 Stunde lang bei 37 Grad entwickelt. Die Absorption wurde bei 450 nm (A450) gemessen.

Durchflusszytometrische Analyse.

Der Zelloberflächenimmunphänotyp von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurde mithilfe der folgenden Kombinationen direkt markierter monoklonaler Antikörper (mAbs) identifiziert: CD3FITC/CD28PE/CD4PerCP, CD80PE/CD19PerCP, CD80PE/CD14PerCP (Becton Dickinson, San Jose, USA). Die Proben wurden wie zuvor beschrieben13 unter Verwendung von 1 × 105 frisch isolierten PBMCs in 100 μl RPMI 1640, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS, Sigma), hergestellt, 30 Minuten lang bei 4 °C mit 20 μl einer geeigneten mAb-Kombination inkubiert und zweimal mit gewaschen eiskalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und vor FACS-Analysen mit 1 % Paraformaldehyd fixiert. Die Expression von Oberflächenmarkern wurde mit dem FACSCalibur-Durchflusszytometer (Becton-Dickinson, San Jose, USA) quantifiziert. Insgesamt 10,000–50,000 Gated-Ereignisse, die anhand ihrer physikalischen Eigenschaften, Vorwärtsstreuungseigenschaften (FSC) und Seitenstreuungseigenschaften (SSC) als periphere Blutlymphozyten (PBLs) und Monozyten verifiziert wurden ), wurden pro Probe gesammelt und mit der CellQUEST-Software analysiert. Die Zelluntergruppen wurden als Prozentsatz im peripheren Blut ausgedrückt.

Intrazelluläre IFN‑Analyse.

Für die intrazelluläre Färbung von IFN 1× wurden 106 PBMCs mit Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) (50 ng/ml) plus Ionomycin (500 ng/ml) 4 Stunden lang bei 37 Grad inkubiert mit Brefeldin A (10 µg/ml) für die letzten 3 Stunden, wie zuvor beschrieben14. Die Zellen wurden zunächst mit CD3-PerCP-Antikörper auf Oberflächenantigen gefärbt, fixiert und nach der Permeabilisierung mit BD FACS Permeabilisierungslösung 2 (BD Biosciences) auf Anti-IFN-PE (Becton Dickinson) gefärbt. Intrazelluläres IFN wird als Prozentsatz in PBLs sowie in CD3-T-Lymphozyten ausgedrückt.

ELISA.

Die Konzentrationen von IFN-, IL-6 und TNF in den Seren der untersuchten Teilnehmer wurden mit kommerziellen unbeschichteten ELISA-Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) bestimmt. Die Konzentrationen der Zytokine wurden an Punkt 1 (vor der Impfung), Punkt 3 (1 Monat nach der Grundimmunisierung) und Punkt 4 (2 Monate nach der Grundimmunisierung) bestimmt. Kurz gesagt, ELISA-Platten wurden mit geeigneten Fängerantikörpern in Beschichtungspuffer beschichtet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Zuerst wurden die Platten gewaschen und mit ELISA/ELISAASPOT Diluent blockiert. Nach einer Stunde Inkubation wurden die Platten gewaschen und Serumproben und Standards in die Vertiefungen gegeben. Nach Inkubation, Waschen und Absaugen wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers die Nachweisantikörperlösung in jede Vertiefung gegeben. Anschließend wurden die Platten gewaschen und abgesaugt; Die Avidin-HRP-Lösung wurde in die Vertiefungen gegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Als nächstes wurden die Platten gewaschen und jeder Vertiefung wurde (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin)-TMB-Lösung zugesetzt. Die Platten wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und die enzymatische Reaktion durch Zugabe einer Stopplösung beendet. Die Absorption wurde bei 450/520 nm mit dem Plattenlesegerät Multiskan EX Termo Labsystems15 gemessen. Statistische Analyse. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Unterschiede zwischen den Werten wurden mit einem ungepaarten t-Test und einem Wilcoxon-Signed-Rank-Test verglichen und die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p<0.05. The analysis was performed using GraphPad Prism 9.0 (GraphPad, La Jolla, CA, USA).

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Ergebnisse

3.1 Studienteilnehmer und Serum-/Milchverarbeitung.

Die Merkmale der Studienteilnehmer sind in Tabelle 1 dargestellt. Von 61 Freiwilligen, die den Anti-SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoff BNT162b2 erhielten, wurden insgesamt 344 Serumproben zu 6 Zeitpunkten gesammelt, beginnend mit dem Ausgangswert vor der Impfung bis 6 Monate nach der ersten Impfung. Die meisten Studienteilnehmer (97 %) berichteten über lokale Nebenwirkungen der Impfung in Form von leichten Arm-/Schulterschmerzen und Müdigkeit, die 1–2 Tage anhielten. Nur drei Teilnehmerinnen erhielten die zweite Impfdosis mit Verzögerung, zwei aufgrund von Nebenwirkungen bei der Erstimpfung (Hautausschlag, Allergie) und eine aufgrund der Feststellung einer Schwangerschaft nach der ersten Dosis. Zwischen den beiden Impfdosen wurde keine Infektion gemeldet. Nach sechsmonatiger Überwachung waren nur 3 (5 %) der Teilnehmer mit dem SARS-CoV-2 infiziert und es wurde keine schwere Erkrankung festgestellt, die einen Krankenhausaufenthalt erforderlich machte. Sieben Teilnehmerinnen wurden nach der Impfung schwanger, eine zwei Wochen nach der ersten Dosis, eine vier Monate nach der ersten Dosis und fünf über 12 Monate nach der ersten Dosis. Langfristige selbstberichtete Nachuntersuchungen ergaben bis zu zwei Jahre nach der ersten Dosis keine impfbedingten Nebenwirkungen bei stillenden Frauen oder anderen Studienteilnehmern.

Quantifizierung von SARS-CoV-2 RBD-spezifischen Antikörpern im Serum und in der Milch von Studienteilnehmern.

Bei der Analyse der Konzentrationen von Anti-RBD-IgG-Antikörpern im Serum nach der Impfung wurde selbst 14 Tage nach der ersten Impfstoffdosis in der gesamten analysierten Gruppe ein signifikanter Anstieg der Anti-RBD-IgG-Konzentrationen im Vergleich zu den IgG-Konzentrationen vor der Impfung beobachtet (17,47 ± 51,49 AU). /ml vs. 7828,28 ± 24.157,29 AU/ml, p<0.0001) (Fig. 1a). Te serum levels of anti-RBD IgG continued to rise to 2 months post-vaccination, when a decrease was detected, which lasted up to 6 months, steadily. The levels of anti-RBD IgG antibodies were compared at each time point between naïve and previously infected individuals (Fig. 1b-c), and it was determined that the difference was statistically significant at baseline (point 1), as previously infected individuals had a higher level of antibodies before vaccination (7.23±0.77 AU/mL vs. 54.47±101.40 AU/mL, p<0.01). The difference was statistically significant also in points 2 (3979.48±3277.27 AU/mL vs. 22,581.99±49,570.63 AU/mL, p<0.05), 5 (2369.16±1934.31 AU/ mL vs. 6366.83±6875.85 AU/mL, p<0.01), and 6 (461.96±375.41 AU/mL vs. 766.04±317.35 AU/mL, p<0.05). The decline in antibody levels had the same dynamics in both groups but remained at higher levels in previously infected individuals for up to 6 months. No other analyzed parameters were correlated with a significantly different level of antibodies in serum (age, gender, smoking status). When comparing levels of anti-RBD IgG antibodies in other participants and breastfeeding women (Fig. 1d-e), no significant differences in serum antibody levels were observed in any of the comparisons. Anti-RBD IgG antibodies were also detected in the milk of 4 breastfeeding women (Fig. 1f). In lower levels, they presented with the same dynamics of rising and decline as detected in the serum. Comparing the levels of anti-RBD IgG antibodies in milk at each time point to baseline, (Fig. 1f), it was determined that the difference was statistically significant at points 2 (6.57±0.77 AU/mL vs. 152.13±35.83 AU/ mL, p<0.01) and 6 (6.57±0.77 AU/mL vs. 117.31±25.64 AU/mL, p<0.01).

Tabelle 1. Merkmale der Studienteilnehmer.

Abbildung 1. Serum-Anti-RBD-IgG-Antikörperspiegel in der (a) gesamten analysierten Gruppe, (b naiven, c) zuvor infizierten Personen, (d) der gesamten Gruppe ohne stillende Frauen, (e) stillenden Frauen und (f) in der Milch stillender Frauen. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) von drei unabhängigen Wiederholungen dargestellt. Unterschiede zwischen Werten wurden mit einem ungepaarten t-Test verglichen und die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p<0.05. * p<0.05; **p<0.01; *** p<0.0001.

Durchflusszytometrische und intrazelluläre IFN-Analysen.

Durch zytometrische Fow-Analyse gewonnene Daten zeigten, dass die Expression von CD28 auf CD4+-T-Zellen im peripheren Blut 2 Monate nach der zweiten Impfstoffdosis im Vergleich zu den Werten vor der Impfung deutlich höher war (42,84 ± 5,37 % vs. 37,75 %). ±5,96 %, p<0.05, Wilcoxon signed-rank test) (Fig. 2a). Tere was a signifcant increase (p≤0.05, Wilcoxon signed rank test) in the prevalence of B cell lymphocyte subset (CD19+) from 6.87±1.17% to 8.73±1.54%, two months afer revaccination, as well as an increased percentage of CD80+ B cells from 1.72±0.28% to 1.99±0.28% (Fig. 2b). Furthermore, fve weeks afer revaccination, a signifcant (p≤0.05, Wilcoxon signed rank test) increase in the percentage of CD14+CD80+ cells from 1.15±0.38% to 5.87±0.95% was detected in the monocyte gate (Fig. 2c). Te expression of IFN-γ in PBLs, as well as in CD3+ T cells was signifcantly (p < 0.05, Wilcoxon signed rank test) increased at 1 week afer the second vaccine dose (1.84 ± 0.13% in PBL and 1.32 ± 0.10% in CD3+ T cells) compared to pre-vaccination baseline values (0.88 ± 0.13% in PBL and 0.72 ± 0.12% in CD3+ T cells) (Fig. 3a). Furthermore, serum levels of IFN-γ were signifcantly increased in all participants from the initial value of 16.69±0.29 pg/mL to 17.72±0.41 pg/mL (p<0.05, Wilcoxon signed rank test) (Fig. 3b), as well as in naive from 16.55±1.77 pg/mL to 17.26±2.53 pg/mL and in a group and previously infected individuals, from 15.93±2.01 pg/mL to 19.90±4.32 pg/mL at 1 week afer revaccination (Fig. 3c). Tere was no signifcant (p>0.05, Wilcoxon-Signed-Rang-Test) Unterschied in den Serumspiegeln von IL-6 und TNF- 1 Woche und fünf Wochen nach der zweiten Impfdosis im Vergleich zu den Werten vor der Impfung insgesamt Gruppe sowie bei naiven oder zuvor infizierten Personen (Ergänzende Abbildung 1a – d).

Diskussion

Der Ausbruch einer SARS-CoV-2-Atemwegsinfektion hatte tiefgreifende negative Auswirkungen auf verschiedene Aspekte des Alltagslebens, einschließlich gesellschaftlicher, bildungsbezogener und gesundheitsbezogener Probleme, die nicht in direktem Zusammenhang mit der COVID-19-Krankheit selbst standen16–18 . Ein globaler Impfansatz war notwendig, um die Distanzierungsmaßnahmen bei der Bekämpfung der Krankheit zu ergänzen, und viele Studien untersuchten die Effizienz und Wirksamkeit verschiedener Impfstofftypen, die im Jahr 2021 weltweit verteilt wurden. In Serbien liegen derzeit nur Zwischenberichte zur humoralen Immunität 2 und 3 Monate nach der Impfung vor19 ,20 und stimmen mit den in dieser Studie berichteten Daten überein. In unserer analysierten Kohorte von bis zu 6 Monaten nach der Impfung wurde nach der ersten Impfdosis eine Serokonversionsrate von 100 % festgestellt. Nur 5 % der Teilnehmer mussten die zweite Impfdosis verspätet erhalten. Es gab keine Berichte über eine SARS-CoV-2-Infektion zwischen zwei Impfdosen. Bis zur sechsmonatigen Überwachung waren nur 5 % der Teilnehmer infiziert, ohne dass ein Krankenhausaufenthalt erforderlich war. Die Titer der Anti-RBD-SARS-CoV-2-IgG-Antikörper waren im Vergleich zum Ausgangswert bereits nach der ersten Impfstoffdosis deutlich höher, was zu der Annahme beiträgt, dass die Verwendung des BNT162b2-mRNA-Impfstoffs ein effizienter Ansatz für schnelle humorale Reaktionen gegen das Original ist Virusstämme. Die IgG-Serumspiegel stiegen bis zu 2 Monate nach der Impfung weiter an, während bis zum analysierten Zeitraum von 6 Monaten ein stetiger Rückgang festgestellt wurde. Es wurde festgestellt, dass zuvor infizierte Personen im Vergleich zu unbehandelten Personen bis zu 6 Monate lang höhere IgG-Titer aufwiesen, was der einzige Faktor war, der zu unterschiedlichen Antikörperspiegeln beitrug. Anti-RBD-IgG-Antikörper wurden in unserer und einigen früheren Studien21 auch in der Milch stillender Frauen nachgewiesen, mit einer ähnlichen Titerdynamik wie im Serum. Ähnliche Berichte wurden für IgA-Antikörper nach natürlicher Infektion veröffentlicht22. Da derzeit nur begrenzte Daten zu den Risiken und Vorteilen der Impfung stillender Frauen vorliegen, sind diese Ergebnisse im Hinblick auf eine mögliche passive Immunisierung von mit Muttermilch ernährten Säuglingen, selbst nach 6 Monaten nach der Impfung der Mütter, vielversprechend. Es wurden keine signifikanten Unterschiede im Serumantikörperspiegel zwischen naiven oder zuvor infizierten Personen und stillenden Frauen beobachtet, was die Beobachtung bestätigt, dass die Reaktion auf Anti-SARS-CoV-2-Impfstoffe nicht durch die Stillzeit beeinflusst wird. Aktuelle Empfehlungen besagen, dass eine Impfung für alle Personen ab 6 Monaten in Betracht gezogen werden sollte, einschließlich derjenigen, die schwanger sind oder jetzt oder in der Zukunft schwanger werden möchten und stillen, unabhängig von ihrem früheren COVID{35}}-Infektionsstatus23. Unsere Studie trägt zur Beweislast bei24, die darauf hindeutet, dass für stillende Frauen, die einen Anti-SARS-CoV-2-Impfstoff erhielten, oder ihre gestillten Säuglinge kein unmittelbarer Schaden entstanden ist. Außerdem wurden sieben Studienteilnehmerinnen nach der Impfung schwanger, eine zwei Wochen nach der ersten Dosis, eine vier Monate nach der ersten Dosis und fünf über 12 Monate nach der ersten Dosis. Kürzlich durchgeführte Langzeit-Follow-up-Interviews mit Studienteilnehmern bestätigten, dass es auch zwei Jahre nach Erhalt des Anti-SARS-CoV-2-Impfstoffs zu keinen unvorhergesehenen Schäden für stillende Frauen, ihre gestillten Säuglinge oder andere Teilnehmer kam.

Abbildung 2. Prozentsatz von (a) CD3+CD28+- und CD4+CD28+-T-Lymphozyten, (b) CD19+ und CD{{6 }}CD80+ B-Lymphozyten, (c) CD14+CD80+-Monozyten im peripheren Blut. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte mit Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Unterschiede zwischen den Werten wurden mit dem Wilcoxon-Signed-Rank-Test verglichen und die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p<0.05. * p<0.05.

Das Auftreten neuer besorgniserregender Varianten sowie die Existenz von Berichten über einen schnellen Rückgang der Anti-SARS-CoV-2-Antikörperspiegel nach natürlicher Infektion und Impfung25 haben zu Unsicherheit über die Rolle der Komponenten der zellulären Immunität geführt. Einige Studien, die die immunologische Reaktion geimpfter Personen in Serbien untersuchten, berichteten nur über humorale Immunität19,20. In dieser Studie wurde 2 Monate nach der Verabreichung der zweiten Impfstoffdosis eine erhöhte Expression der kostimulatorischen Rezeptoren CD28 auf CD4+-T-Zellen und CD80 auf B-Zellen festgestellt. Darüber hinaus nahm die Expression von CD80 auf Monozyten 1-Monate nach vollständiger Impfung zu.

Die Proliferation und Differenzierung von T-Zellen zu Effektor- oder Gedächtniszellen erfordert Antigenpräsentation, Kostimulation und Zytokine. Die am besten verteidigten Co-Stimulatoren von T-Zellen sind die Molekülpaare B7-1 (CD80) und B7-2 (CD86). Sie werden typischerweise auf Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) wie dendritischen Zellen, B-Zellen, Makrophagen, Monozyten und T-Zellen exprimiert. Ihre Expression auf Monozyten ist auch wichtig für die Aktivierung von Lymphozyten und die adaptive Immunität26. Die beiden Hauptrezeptoren auf der Oberfläche von T-Lymphozyten, die CD80 und CD86 binden, sind CD28 und das zytotoxische T-Lymphozyten-assoziierte Protein 4 (CTLA-4). Die Bindung an CD28 aktiviert Lymphozyten und verstärkt folglich die Immunantwort27. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse zeigen, dass CD4+-T-Zellen durch die S-Antigen-abgeleiteten Epitope aktiviert werden, die auf aktivierten B-Zellen und Monozyten 2 Monate nach der zweiten Dosis des Impfstoffs präsentiert werden. Verschiedene Daten deuten darauf hin, dass nach der mRNA-Impfung vorwiegend CD4-T-Zellen aktiviert wurden28,29, während in einigen Studien berichtet wird, dass sowohl CD4- als auch CD8-T-Zellen gleichermaßen präsentiert und aktiviert werden30. Tan et al. haben kürzlich beobachtet, dass 3 Monate nach der Impfung die mittlere Menge an Spike-spezifischen T-Zellen der Menge entsprach, die bei genesenden Patienten zu einem ähnlichen Zeitpunkt nach einer SARS-CoV-2-Infektion nachgewiesen wurde31. Darüber hinaus scheinen die Komponenten der adaptiven Immunität (sowohl bei zuvor Infizierten als auch bei Geimpften) unabhängig voneinander reguliert zu werden6,32,33 und es besteht kein Zusammenhang zwischen der Produktion antiviraler Antikörper und der T-Zell-Häufigkeit. Darüber hinaus lösen aktuelle mRNA-Impfstoffe Immunreaktionen aus, die auf das Spike-Protein beschränkt sind. Allerdings muss auch die potenziell schützende Rolle von T-Zellen, die für andere strukturelle und nichtstrukturelle Proteine ​​spezifisch sind, untersucht werden34. Die Vorstellung, dass polyantigene Impfstoffe eine bessere Kontrolle gegen virale Varianten ausüben könnten als monoantigene, wie z. B. auf Spike-Proteinen basierende Impfstoffe, könnte eine fundierte Begründung haben35,36.

Abbildung 3. (a) Expression von IFN- in allen und CD3+ T-Lymphozyten des peripheren Bluts. Serumspiegel von IFN- in der (b) gesamten analysierten Gruppe, (c) naiven und zuvor infizierten Personen. Die Ergebnisse werden als Einzelwerte mit Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Unterschiede zwischen den Werten wurden mit dem Wilcoxon-Signed-Rank-Test verglichen und die Ergebnisse wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn p<0.05. * p<0.05.

In dieser Studie wurden 7 Tage nach der vollständigen Impfung erhöhte IFN-Spiegel in allen Lymphozyten und in CD3+ T-Zellen festgestellt. Außerdem wurde 7 Tage nach der vollständigen Impfung ein erhöhter IFN--Spiegel im Serum aller geimpften Personen beobachtet, sowohl bei SARS-CoV-2-naiven als auch bei zuvor infizierten Personen. Somit induzierte der mRNA-basierte Impfstoff Spike-spezifische T-Zellen, die reichlich IFN- produzieren. IFN- ist ein wichtiges Zytokin mit antiviralen Eigenschaften und hemmt nachweislich die Replikation von SARS-CoV-28. Die in dieser Studie gezeigte schnelle Auslösung von IFN- durch den BNT162b2-Impfstoff weist auf eine günstige T-Zell-Immunantwort gegen das SARS-CoV-2-Virus hin. Die durch SARS-CoV-2 ausgelöste immunologische Reaktion umfasst auch die Produktion zahlreicher proinflammatorischer Zytokine, vor allem IL-6 und TNF-, und Veränderungen ihrer Spiegel könnten mit der Prognose der Krankheit verbunden sein. Bei Personen mit erhöhten Zytokinspiegeln wurden schwere und tödliche Fälle von COVID-19 gemeldet37. Allerdings wurde in dieser Studie 7 Tage und bis zu 1 Monat nach der vollständigen Impfung kein signifikanter Unterschied in den Serumspiegeln von IL-6 und TNF- festgestellt, was auf spezifische Kohortenmerkmale und den Zeitpunkt der Probenahme zurückzuführen sein könnte.

Diese Daten stellen die ersten veröffentlichten Berichte über dauerhafte Immunität dar, die sowohl die humorale als auch die zelluläre Komponente berücksichtigen und sich auf stillende Frauen konzentrieren. Dies könnte besonders für zukünftige Metaanalysen dieser und anderer sensibler Bevölkerungsuntergruppen nützlich sein, da Daten aus dem Balkanraum zur slawischen Bevölkerung bei größeren multinationalen Bemühungen normalerweise fehlen.

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Schlussfolgerungen

Der Anti-SARS-CoV-2-mRNA-Impfstoff BNT162b2 löste in Serbien in den ersten sechs Monaten nach der Impfung messbare und dauerhafte humorale und zelluläre Reaktionen bei stillenden Frauen sowie sowohl naiven als auch zuvor infizierten Personen aus. Es wurden keine schwerwiegenden Nebenwirkungen der Impfung gemeldet und nur 5 % der Teilnehmer infizierten sich in den ersten sechs Monaten nach der Impfung mit dem SARS-CoV-2, ohne dass ein Krankenhausaufenthalt erforderlich war. Zwei Jahre nach Erhalt des Anti-SARS-CoV-2-Impfstoffs wurden keine unvorhergesehenen Schäden für stillende Frauen oder ihre gestillten Säuglinge gemeldet. Nächste Studien auf diesem Gebiet sollten sich auf Impfstoffforschungs- und -entwicklungsstrategien konzentrieren, die COVID-19 und potenzielle ähnliche Pandemien schneller und dauerhafter unter Kontrolle halten könnten. Es müssen auch Anstrengungen unternommen werden, um wissensbasierte Leitlinien bereitzustellen, Fehlinformationen, insbesondere in Bezug auf sensible Bevölkerungsgruppen wie stillende Frauen, angemessen zu bekämpfen, den Zugang zu Impfstoffen in Zeiten hohen Bedarfs zu erleichtern und das allgemeine Vertrauen in die Wissenschaft zu stärken.

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Verweise

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