Unterschiedliche renale Chronotoxizität von Brombenzol und seinen Zwischenmetaboliten bei Mäusen

Brombenzol (BB) ist dafür bekannt, dass es eine ernsthafte Gefahr für die menschliche Gesundheit darstellt. Wir haben zuvor gezeigt, dass BB Chronotoxizität zeigte, d. h. tägliche Schwankungen in der Schwere der bei Mäusen induzierten Hepatotoxizität. Obwohl BB eine leichte Nephrotoxizität zeigte, wurde bei dieser Toxizität keine tägliche Schwankung beobachtet. Dies könnte der Tatsache zugeschrieben werden, dass BB-induzierte Chronotoxizität nur in der Leber und nicht in der Leber beobachtet wirdNierenund dass der durch BB verursachte Schaden in der Leber auffällig ist und die täglichen Schwankungen der Nephrotoxizität maskiert. Um diese beiden Möglichkeiten zu bestätigen, untersuchten wir die täglichen Schwankungen der Nephrotoxizität aufgrund von BB-Zwischenmetaboliten, die auf das abzielenNieren: 3-Bromphenol, Bromhydrochinon und 4-Bromocatechol. Mäusen wurde zu sechs verschiedenen Zeitpunkten an einem Tag (Zeitgeberzeit (ZT): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 oder ZT22) intraperitoneal 3-Bromphenol, Bromhydrochinon oder 4-Bromocatechol injiziert. Die Sterblichkeit wurde 7 Tage nach der Injektion überwacht. Mäuse reagierten empfindlicher auf die akute Toxizität dieser Metaboliten bei einer ZT14-Exposition (Dunkelphase) als bei einer ZT2-Exposition (Lichtphase). Darüber hinaus zeigten Mäuse, denen eine nicht-tödliche Dosis von 4-Bromocatechol verabreicht wurde, signifikante Erhöhungen der Harnstoff-Stickstoff- und Harnstoffspiegel im PlasmaNieren-Malondialdehyd bei ZT14-Exposition. Darüber hinaus wurde Glutathionperoxidase -4, ein Ferroptose-Indikator, bei ZT14-Exposition abgeschwächt. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Toxizität von BB-Metaboliten während der Dunkelphasen-Exposition höher war, und demonstrieren den Grund, warum die Tagesschwankung der Nephrotoxizität durch BB in unserem vorherigen Bericht nicht beobachtet wurdeNieren-Schadenwurde aufgrund schwerer Leberschäden maskiert.

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Stichwörter Brombenzol; Tagesgang; zirkadianer Rhythmus; Chronotoxizität;Niere

EINLEITUNG

Brombenzol (BB) ist ein allgemeines industrielles Reagenz, das normalerweise als Rohstoff für die Synthese von Pharmazeutika, Farbstoffen und Pestiziden verwendet wird.1,2) BB ist ein organischer Schadstoff, der die natürliche Umwelt schädigt und eine ernsthafte Bedrohung für die menschliche Gesundheit darstellt . Eine Studie besagt, dass BB schwere und milde Hepatotoxizität induziertNieren-Toxizität bei Mäusen.3) Obwohl BB selbst, eine Nicht-Metabolit-Form, eine geringe Toxizität besitzt, haben seine intermediären Metaboliten toxische Wirkungen auf die Leber undNieren. Hepatische CYP450s wie CYP1A2, CYP1B1 und CYP2E1 metabolisieren BB zu vier Metaboliten: 3-Bromphenol (3-BrP), Bromhydrochinon (BrHQ), 4-Bromocatechol (4- BrC) und BB-3,4-Oxid. BB-3,4-oxid weist eine hohe Hepatotoxizität auf und die anderen Metaboliten zeigen Nephrotoxizität,4–6), was darauf hinweist, dass diese Metaboliten unterschiedliche Zielorgane haben.

In dieser Studie zielten wir auf „Chronotoxikologie“, da wir zuvor die Beziehung zwischen dem Zeitpunkt der Verabreichung und der Schwere der Toxizität von Chemikalien vorgeschlagen hatten waren Mäuse während der Dunkelphasen-Exposition (2:00) toleranter gegenüber BB-induzierten Leberschäden als während der Lichtphasen-Exposition (14:00).8) Obwohl BB eine leichte Nephrotoxizität zeigte , Chronotoxizität wurde nicht beobachtetNieren. Daher wurde eine BB-induzierte Chronotoxizität möglicherweise nur in der Leber und nicht in der Leber beobachtetNieren. In unserer vorherigen Studie zeigte Streptomycin, ein Antibiotikum, von dem bekannt ist, dass es eine definierte Nephrotoxizität hervorruft, bei Mäusen deutliche Tagesschwankungen in der induzierten Nephrotoxizität.9) Basierend auf den verfügbaren Daten stellten wir die Hypothese auf, dass die durch BB verursachte Chronotoxizität eher in der Leber als in der Leber ausgeprägt ist dasNieren, wodurch die Chronotoxizität im letzteren Organ maskiert wird. Die Metaboliten von BB, die durch verschiedene Stoffwechselwege erzeugt werden, treten in geringen Konzentrationen auf und können daher zu vernachlässigbaren Nierenschäden beitragen; Aus diesem Grund kann die BB-Metaboliten-induzierte Nephrotoxizität klinisch nicht abgeschätzt werden. In dieser Studie untersuchten wir die täglichen Schwankungen der Nephrotoxizität von BB-Zwischenmetaboliten: 3-BrP, BrHQ und 4-BrC (Abb. 1).

MATERIALEN UND METHODEN

Tierbehandlung

Männliche ICR-Mäuse wurden von Japan SLC Inc. (Shizuoka, Japan) gekauft und unter Standardbedingungen mit kontrollierter Temperatur (24 ± 1 Grad), Feuchtigkeit (55 ± 5 Prozent) und Licht (12: 12- h gehalten Hell/Dunkel-Zyklen, Licht an um 08: 00), mit freiem Zugang zu Wasser und Futter. Experimentelle Behandlungen wurden mit 7- Wochen alten Tieren durchgeführt. Nach Beendigung der Experimente wurden die überlebenden Mäuse unter Verwendung von Pentobarbital getötet. Alle Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Experiment Committee der Kinjo Gakuin University genehmigt.

Versuchsprotokoll

Für den Mortalitätsassay erhielten {{0}} Wochen alte männliche ICR-Mäuse eine einzelne intraperitoneale (ip) Injektion von 500 mg/kg 3-BrP, 180 mg/kg BrHQ oder 220 mg/kg 4-BrC (in einem Volumen von 0,1 ml/10 g Körpergewicht; Tokyo Kasei Corp, Tokio, Japan). Diese Dosis wird gemäß dem LD50-Wert in den Sicherheitsdatenblättern für jede Chemikalie festgelegt. Für die Injektion jedes Metaboliten wurden die Mäuse sechs Gruppen zu je fünf Tieren zugeteilt. BB-Metabolite wurden zu sechs verschiedenen Zeitpunkten verabreicht (Uhrzeit: 10:00, 14:00, 18:00, 22:00, 02:{{21}). }} und 06 : 00), beschrieben als Zeitgeberzeiten (ZTs): ZT2, ZT6, ZT10, ZT14, ZT18 bzw. ZT22. Kontrollmäuse erhielten das gleiche Volumen Kochsalzlösung. Die Sterblichkeit wurde 7 Tage nach der Injektion überwacht.

Zur Analyse circadianer Schwankungen inNieren-Verletzung, 7- Wochen alten männlichen ICR-Mäusen (5–9 Mäuse) wurde eine ip-Injektion von 165 mg/kg 4-BrC bei ZT2 oder ZT14 verabreicht. Kontrollmäuse erhielten das gleiche Volumen Kochsalzlösung wie oben beschrieben. Die Tiere wurden unter Verwendung von Pentobarbital eingeschläfert, und ihre Plasmaproben wurden 24 h nach der Injektion gesammelt. Die erhaltenen Plasmaproben wurden bei –80 Grad gelagert. DasNierenaller Tiere wurden geerntet und bei -80 Grad gelagert.

Plasmaspiegel von Harnstoffstickstoff (BUN), Aspartataminotransferase (AST) und renalem Malondialdehyd (MDA)

Plasma-BUN- und -AST-Spiegel wurden unter Verwendung des BUN-Wako-Tests und des Transaminase-CII-Tests Wako (FUJIFILM Wako Chemicals, Osaka, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt.8) GesamtNieren-Die MDA-Spiegel wurden mit einem kolorimetrischen Mikroplatten-Assay (Oxford Biomedical Research, MI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen.8)

Western-Blot-Analyse

Proteinproben (50 µg) extrahiert aus derNierenwurden durch 10-prozentige Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt.10) Die verwendeten primären Antikörper waren wie folgt (alle 1:1500 verdünnt): Maus-Rezeptor-interagierendes Protein (RIP) 1 monoklonaler Antikörper, Maus-RIP3-monoklonaler Antikörper und Maus-Glutathion Peroxidase 4 (GPX4) monoklonaler Antikörper (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA); Kaninchen gespaltener polyklonaler Caspase-3-Antikörper (Cell Signaling Technology); und monoklonaler Maus-Aktin-Antikörper (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Aichi, Japan).

Statistische Analyse

Mehrfachvergleiche wurden unter Verwendung des Tukey-Kramer-Post-Hoc-Tests durchgeführt. Alle statistischen Analysen wurden mit der Software SPSS 25.0 (Chicago, IL, USA) durchgeführt. Ergebnisse mit p< 0.05="" were="" considered="" statistically="">

RESULTATE UND DISKUSSION

In dieser Studie verglichen wir die Chronotoxizität von drei BB-Zwischenmetaboliten (3-BrP, BrHQ und 4-BrC), die bekanntermaßen induzierenNieren-Toxizität. Wir untersuchten zuerst die Wirkung der Injektionszeit auf die durch BB-Zwischenprodukte induzierte Mortalität. Abbildung 2 zeigt die Anzahl der überlebenden Tiere und die mittlere Überlebenszeit (MST) 7 Tage nach der Injektion. Wenn 3-BrP bei ZT10 und ZT14 verabreicht wurde, starben alle Mäuse (0 Prozent) innerhalb von 4 h (Fig. 2A). Im Gegensatz dazu überlebten drei Mäuse (60 Prozent), wenn 3-BrP bei ZT6 und ZT22 verabreicht wurde; bei Verabreichung an ZT2 und ZT18 betrug die Anzahl der überlebenden Mäuse eins bzw. zwei (20 bzw. 40 Prozent). Nach BrHQ-Verabreichung wurde der Tod von Mäusen nur innerhalb von 4 h nach der Verabreichung in allen ZT-Gruppen beobachtet. 7 Tage nach der Verabreichung überlebten keine Mäuse in den ZT14- und ZT18-Gruppen und drei (60 Prozent) überlebten in den ZT2- und ZT6-Gruppen. In den ZT10- und ZT22-Gruppen betrug die Anzahl der überlebenden Mäuse zwei bzw. eine (40 und 20 Prozent) (Fig. 2B). Nach der 4--BrC-Verabreichung starben alle Mäuse innerhalb von 3 Tagen, wenn sie mit ZT14 oder ZT18 (0 Prozent) dosiert wurden, und nur eine oder zwei (20 oder 40 Prozent) überlebten in anderen ZT-Gruppen (Fig. 2C). MST stimmte fast mit der Anzahl der überlebenden Mäuse in allen Gruppen überein (Abb. 2D–F). Diese Ergebnisse weisen auf die tödliche Chronotoxizität der drei BB-Zwischenmetaboliten hin. Nach Verabreichung bei ZT14 (Dunkelphase) zeigten alle drei Metaboliten eine hohe Toxizität. Interessanterweise unterscheiden sich die Chronotoxizitätsmuster dieser BB-Metaboliten von denen von BB selbst, d. h. Mäuse, die BB in der Dunkelphase ausgesetzt waren, hatten eine geringere Empfindlichkeit gegenüber Toxizität Dunkelphasen-Exposition und weniger toxisch nach Lichtphasen-Exposition.9) Diese Ergebnisse der früheren Studien widersprechen nicht denen der vorliegenden Studie, was darauf hindeutet, dass Unterschiede in der Toxizität von BB und den drei BB-Zwischenmetaboliten auf ihre Zielorgane zurückzuführen sind . BB zielt auf die Leber ab, während seine Zwischenmetaboliten auf die Leber abzielenNieren.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung der Injektionszeit auf die Schwere der Organtoxizität unter Verwendung einer nicht tödlichen Dosis von 4-BrC (165 mg/kg). Da bei 3-BrP- und BrHQ-Injektionen, wie oben beschrieben, ein früher Tod innerhalb von 4 h beobachtet wurde, wählten wir für die nachfolgenden Experimente nur 4-BrC aus. Aus Versuchsgründen wählten wir ZT2 und ZT14 als Injektionszeiten. In der ZT2-Gruppe war der Plasmaspiegel von BUN, einem Indikator für Nephrotoxizität, nach 4-BrC-Exposition nicht erhöht; der BUN-Spiegel war jedoch in der ZT14-Gruppe deutlich erhöht (Abb. 3A). Parallel zu BUN haben wir den AST-Plasmaspiegel gemessen, ein Indikator für Hepatotoxizität. Wir fanden heraus, dass die Verabreichung von 4-BrC die Plasma-AST-Spiegel sowohl in ZT2 als auch in ZT14 nicht beeinflusste (Abb. 3B), was darauf hindeutet, dass 4-BrC nur für die toxisch warNieren. Zusätzlich schätzten wir die MDA-Spiegel als Indikator für oxidativen Stress im KörperNieren. Die Verabreichung von 4-BrC erhöhte den renalen MDA-Spiegel in den ZT14- und ZT2-Gruppen signifikant. Der MDA-Spiegel in der ZT2-Injektionsgruppe war jedoch signifikant niedriger als der in der ZT14-Gruppe (Fig. 3C).

Bis heute wurde über verschiedene Zelltodwege wie Apoptose, Nekroptose und Ferroptose berichtet.11) Außerdem wurde berichtet, dass der durch 4-BrC verursachte Zelltod hauptsächlich über Nekrose vermittelt wird.6) Zur Untersuchung der Art des durch 4-BrC induzierten Zelltods analysierten wir die mit dem Zelltod verbundenen Proteinspiegel: gespaltene Caspase-3 für Apoptose, RIP1/RIP3 für Nekroptose und GPX4 für Ferroptose. Es wurden in keiner Gruppe offensichtliche Veränderungen in den Spiegeln von gespaltener Caspase -3, RIP1 und RIP3 beobachtet, was darauf hindeutet, dass Apoptose und Nekroptose nicht durch 4-BrC induziert werden (Abb. 4). Im Gegensatz dazu wurde eine Abnahme des GPX4-Spiegels nach Verabreichung von 4-BrC bei ZT14 beobachtet (Fig. 4). Wir haben keine 4-BrC-induzierte Nierennekrose durch histopathologische Analyse beobachtet (Daten nicht gezeigt). Dies legte nahe, dass die in dieser Studie verwendete 4-BrC-Konzentration eine leichte Nierenschädigung verursachte und nicht zu Nekrose führte. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schließen, dass 4-BrC Ferroptose verursacht, die tageszeitliche Schwankungen zeigt.

In dieser Studie zeigten wir, dass BB-Zwischenmetaboliten eine Chronotoxizität in derNiere. Im Gegensatz dazu zeigte unser vorheriges Ergebnis eine BB-induzierte Nephrotoxizität. Die renale Chronotoxizität wurde jedoch zwischen der hellen Phase und der dunklen Phase nicht verändert.8) Obwohl der kritische Grund für den Unterschied zwischen früherer und aktueller Forschung noch nicht klar ist, glauben wir, dass es vorgekommen ist, die renale Chronotoxizität zu maskieren, indem eine schwere Lebererkrankung hervorgerufen wird Verletzung. In zukünftigen Experimenten müssen wir die akkumulierten Mengen jedes BB-Zwischenmetaboliten messen, da sich diese Mengen durch CYP und/oder Verletzungsniveaus ändern können.

Viele biologische Faktoren zeigen in ihren Expressionsniveaus einen zirkadianen Rhythmus. Zum Beispiel Xu et al. haben bei Mäusen über tageszeitliche Schwankungen in der Genexpression von Antioxidantien in der Leber berichtet.12) Glutathion (GSH) ist ein Antioxidans, das für die Aufrechterhaltung der Gesundheit und den Schutz vor toxischen Verbindungen entscheidend ist. Es wurde berichtet, dass sowohl 4-BrC als auch 3-BrP den renalen GSH-Spiegel verringern.4,13) Ferroptose wurde 2012 als die Form des Zelltods vorgeschlagen, die durch Elastin induziert wird, das den Import von Cystein hemmt, was zu GSH-Verarmung und GPX4-Inaktivierung führt.14) Unsere Ergebnisse zeigten, dass GPX4 nur bei ZT14 durch 4-BrC reprimiert wurde. Daher können GSH-verwandte Proteine ​​oder Gene mit Chronotoxizität in Verbindung gebracht werden.

Zusammenfassend zeigt unsere vorliegende Studie, dass BB durch seine Metaboliten wie 3-BrP, BrHQ und 4-BrC sowohl Nierenschäden als auch Leberschäden induziert. Der Grund, warum die Tagesschwankung der Nephrotoxizität durch BB in unserem vorherigen Bericht nicht beobachtet wurde, ist, dass die Nierenschädigung durch eine starke Leberschädigung maskiert wurde.

VERWEISE

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Hiroki Yoshioka, a,b,# Sarah Tominaga, a,# Mai Nishikawa, ein Yasuro Shinohara, ein Makoto Nakao, ein Masae Yoshioka, ein Tohru Maeda,*, a und Nobuhiko Miura*,c

ein College of Pharmacy, Kinjo Gakuin University; 2–1723 Omori, Moriyama-Ku, Nagoya 463–8521, Japan: b Center for Craniofacial Research, The University of Texas Health Science Center at Houston, School of Dentistry; 1941 East Road, Houston, TX 77054, USA: und cDepartment of Health Science, Yokohoma University of Pharmacy; 601 Momono-Cho, Totsuka-Ku, Yokohama 245–2006, Japan. Eingegangen am 30. August 2020; angenommen 25. Oktober 2020

für weitere Informationen: Ali.ma@wecistanche.com