Differenzierung, Niere, Nephrogenese, Nephron-Vorläufer,

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ABSTRAKT

Die während der Fetalperiode definierte Nephronausstattung bestimmt die Nieren- und damit verbundene kardiovaskuläre Gesundheit während des gesamten Lebens. Wir zeigen hier, dass trotz seiner negativen Auswirkungen aufNierenwachstumverlängert die genetische Zunahme von GDNF das nephrogene Programm über seine normale Beendigung hinaus. Eine mehrstufige mechanistische Analyse ergab, dass überschüssiges GDNF die Nephron-Vorläufer und die Nephrogenese durch erhöhte Expression seiner sezernierten Ziele und verstärkte WNT-Signalisierung aufrechterhält, was zu einer zweiteiligen Wirkung auf die Aufrechterhaltung der Nephron-Vorläufer führt. Ungewöhnlich hohes GDNF in embryonale Nieren hochreguliertseine bekannten Ziele, aber auch Wnt9b und Axin2, mit der gleichzeitigen Verlangsamung der Nephron-Vorläuferproliferation. Der Rückgang des GDNF-Spiegels in der postnatalen PhaseNieren normalisiertder Ureterknospe und schafft eine zulassende Umgebung für die Fortsetzung des nephrogenen Programms, wie durch morphologisch und molekular normale postnatale Nephron-Vorläufer-Selbsterneuerung und -Differenzierung gezeigt wird. Diese Ergebnisse belegen, dass überschüssiges GDNF eine zweiphasige Wirkung auf Nephron-Vorläufer in Mäusen hat, die zuverlässig auf eine Manipulation der GDNF-Dosierung während der fötalen und postnatalen Periode reagieren können. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Erfassung des Signalaktivitätsniveaus ein wichtiger Mechanismus ist, durch den GDNF und andere Moleküle zur Spezifikation der Lebensdauer von Nephron-Vorläufern beitragen.

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EINLEITUNG

Die Säugerniere ist ein sich nicht regenerierendes Blutfiltrationsorgan mit wesentlichen Entgiftungs- und Elektrolytausgleichsfunktionen.

Die Nephrone, die diese Funktionen ausführen, werden während der Fetalperiode geboren, da die erwachsene Niere nur eine begrenzte Reparaturkapazität oder kompensatorische glomeruläre Vergrößerung (Hypertrophie) aufweist (Chawla und Kimmel, 2012; Rinkevich et al., 2014; Romagnani et al., 2013). Eine angeborene niedrige Nephronmasse ist ein allgemein akzeptierter Risikofaktor für Bluthochdruck, Proteinurie, Glomerulosklerose und Nierenerkrankungen im Endstadium (Bertram et al., 2011; Hoy et al., 2008) und beeinflusst daher die Nierengesundheit während des gesamten Lebens stark. Das nephrogene Programm endet zwischen den Schwangerschaftswochen 35-37 beim Menschen und dem postnatalen Tag (P) 3 bei der Maus (Hartman et al., 2007; Hinchliffe et al., 1991; Ryan et al., 2018), aber die Mechanismen tragen dazu bei bis zur Beendigung sind kaum verstanden. Es wurde postuliert, dass stadienspezifische Veränderungen der Wachstumsmuster (Cebrián et al., 2004) und zelleigene Alterserkennungsmechanismen (Chen et al., 2015a) beteiligt sind. Molekular sind die durch das knochenmorphogenetische Protein (BMP) induzierte SMAD-Signalgebung (Brown et al., 2015), Hamartin (Tsc1) (Volovelsky et al., 2018) und die microRNA-Regulierung (Yermalovich et al., 2019) an der Bestimmung der Nephrogenität beteiligt Programmdauer. Die Plastizität des nephrogenen Programms wurde jedoch noch nicht vollständig erforscht. Nephrone unterscheiden sich von einem Nephron-Vorläufer (NP)-Pool, der auch als Metanephric- oder Cap-Mesenchym bekannt ist. NPs, die ein einzigartiges Repertoire an Markern exprimieren, einschließlich SIX2, Gliazelllinien-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) und CITED1, sind nur in der embryonalen Niere vorhanden, wo sie jede Spitze der Ureterknospe (UB) von ihrer Etablierung umgeben (Boyle et al., 2008; Self et al., 2006). Der Nephrogeneseprozess ist mit der UB-Verzweigung synchronisiert, die gleichzeitig die Selbsterneuerung in der undifferenzierten NP-Population aufrechterhält und eine Untergruppe von NPs dazu veranlasst, über wohldefinierte Vorstufen (prätubuläre Aggregate, PA; Nierenvesikel) einen allmählichen Übergang vom Mesenchym zum Epithel zu durchlaufen , RV; kommaförmige Körper, CSB; S-förmige Körper, SSB), die sich schließlich in funktionelle Nephrone differenzieren (Kobayashi et al., 2008; Lindström et al., 2018). Das Gleichgewicht zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung innerhalb der NP-Population hängt von Signalen ab, die die reziproken induktiven Gewebeinteraktionen vermitteln, die zwischen dem UB und dem benachbarten Mesenchym stattfinden. Metanephrisches Mesenchym und NP-abgeleitete Signale wie GDNF und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) regulieren die UB-Morphogenese, durch die die embryonale Niere an Größe zunimmt, ihre Form annimmt und das Sammelrohrsystem etabliert (Costantini und Kopan, 2010). Die GDNF-aktivierte RET-Signalgebung in den UB-Spitzen reguliert ein Transkriptionsprofil, das für die Kontrolle der Sammelrohr-Vorläufer und der UB-Morphogenese verantwortlich ist (Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019; Lu et al., 2009; Ola et al. , 2011; Riccio et al., 2016). GDNF-regulierte Transkripte umfassen auch sezernierte Proteine ​​wie WNT11 und CRLF1 mit nachgewiesenem Potenzial zur Regulierung des nephrogenen Programms (O'Brien et al., 2018; Schmidt-Ott et al., 2005). Andere UB-abgeleitete Nephrogeneseregulatoren sind WNT9b und FGF-Liganden, die die Erhaltung und Differenzierung von NP beeinflussen (Barak et al., 2012; Carroll et al., 2005; Kiefer et al., 2012). Wir haben zuvor berichtet, dass eine genetische Unterbrechung der Gdnf-3′-untranslatierten Region eine 3-- bis 6--fach erhöhte Expression von endogenem GDNF verursacht und aufgrund des UB-Verzweigungsdefekts zu einer Nierenhypoplasie führt (Kumar et al., 2015). Im Gegensatz zur Neugeborenenletalität bei den Gdnf-Knockouts überleben die Gdnfhyper/Hyper-Mäuse bis zu 3 Wochen und haben die wesentliche Rolle von GDNF bei der Selbsterneuerung der Sammelgang-Vorläuferzellen aufgezeigt (Costantini, 2012; Kumar et al., 2015; Li et al., 2019). Hier zeigen wir, dass überschüssiges GDNF trotz seiner negativen Wirkung auf das Gesamtnierenwachstum die NP-Lebensdauer verlängern kann, wodurch die neu erkannte Plastizität von Säugetiernieren weiter gestärkt wird.

SCHLÜSSELWÖRTER:Differenzierung, Niere, Nephrogenese, Nephron-Vorläufer, Maus

ERGEBNISSE

Das embryonale nephrogene Programm hängt von GDNF ab

Die räumliche Anordnung von SECHS2-positiven NPs in der Embryonal- und frühen PostnatalphaseNierenfolgt einem stereotypen, gut beschriebenen Muster, bei dem das anfänglich vielzellige Gewebe mit der Zeit dünner wird, ohne die Nischenorganisation insgesamt zu beeinträchtigen (Short et al., 2014). NPs in Gdnfhyper/Hyper-Nieren waren um eine ungewöhnlich breite UB als dünnere Schicht verteilt (Abb. 1A-F; Abb. S1A, B). Die Quantifizierung von NPs bei E11,5 ergab einen anfänglichen Anstieg, der sich bei E12,5 vorübergehend normalisierte, aber bei E14,5 in Gdnfhyper/Hypernieren stark zurückging (Abb. 1E-G; Abb. S1C-F). Die Mitoseanalyse zeigte, dass sowohl endogen erhöhtes als auch exogen ergänztes GDNF eine signifikante Verringerung des pHH3 plus NPC verursacht (Abb. 1H; Abb. S1G). Insgesamt zeigen die Daten, dass überschüssiges GDNF, das hauptsächlich in der UB wirkt, wo seine Rezeptoren exprimiert werden (Pachnis et al., 1993), einen schnellen Abfall der NP-Zellproliferation während der frühen Nierenentwicklung induziert.

Es ist bekannt, dass eine vorzeitige oder beschleunigte NP-Differenzierung einen Rückgang der NP-Zellen in ihrer Nische verursachen kann (Kobayashi et al., 2008; O'Brien, 2018). Um dies zu beurteilen, wurde die Nephrogenese durch Färbung mit LEF1 und Cyclin D1 untersucht, die die frühesten differenzierungsbehafteten Zellen bzw. Nephrone markieren, die eine vollständige Epithelisierung durchlaufen (Lindström et al., 2015). Dies zeigte einen allgemeinen Rückgang der frühen Nephron-Vorläuferzahlen und deutete auf eine reduzierte Nephron-Differenzierung bei embryonalem Gdnfhyper/hyper hinNieren(Abb. 2). Die Bewertung der glomerulären Dichte unterstützte dies weiter und zeigte niedrigere Gesamtdichten in hypodysplastischen Gdnfhyper/Hyper-Nieren als in Wildtyp (WT)-Nieren (Abb. S1G). Interessanterweise ergab die Analyse der kortikalen Glomeruli innerhalb des gesamten gemessenen Bereichs und insbesondere der Verhältnisse von kortikalen zu Gesamtglomeruli etwas höhere Verhältnisse als die WT-Verhältnisse bei Gdnfhyper/hyper (Tabelle 1; 17 Prozent bei Gdnfhyper/hyper, 12 Prozent bei WT). Dies weist darauf hin, dass trotz der frühen Verlangsamung der NP-Selbsterneuerung und -Differenzierung die Nieren, die während der Organogenese einem übermäßigen GDNF ausgesetzt sind, eine anhaltende postnatale Nephrogenese mit einer geringfügigen Zunahme der zuletzt geborenen Nephrone aufweisen, die am kortikalsten lokalisiert sind (Rumballe et al., 2011; Short et al., 2014).

Überschüssiges GDNF verlängert die Lebensdauer des postnatalen NP-PoolsViele Mausmodelle mit Mangel anNierenwachstum, entweder aufgrund von UB-Morphogenese und/oder Nephron-Differenzierung, unmittelbar nach der Geburt sterben (Kuure und Sariola, 2020). Trotz der signifikanten Hypoplasie, Anomalien in der UB-Morphologie und der stark gestörten embryonalen Nephrogenese (Abb. 2) überleben Gdnfhyper/Hyper-Mäuse bis zu 3 Wochen nach der Geburt (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019), was eine Möglichkeit bietet um die postnatale Nephrogenese zu untersuchen.

Wie festgestellt wurde (O'Brien, 2018), zeigte unsere Analyse der NP-Populationen bei P1-P10 einen dramatischen Verlust in den WT-Nieren bei P3, bei denen SIX2--Positivität hauptsächlich in der festgestellt wurde

Differenzierung von Nephron-Vorläufern, und nur 10 Prozent der analysierten UB-Spitzen (Nischen) waren mit Nephron-Vorläuferzellen (NPCs) bedeckt (Abb. 3A, n=2-Nieren). Allerdings wurden SECHS2--positive NPs in 59 Prozent der Gdnfhyper/Hyper-Nischen bei P3 nachgewiesen (Abb. 3B, n=2-Nieren). In ähnlicher Weise wurden PAX2--positive NPs in NP-Nischen von Gdnfhyper/Hypernieren bei P3 nachgewiesen, aber die PAX2--positiven Zellen lokalisierten sich ausschließlich in den differenzierenden Nephron-Vorläufern in WTNieren(Abb. 3C,D).

Nephrogenese bei postnataler Gdnfhyper/hyperNierenzeigten eine signifikante Verbesserung gegenüber der in embryonalen Nieren, wie durch ähnliche Nephron-Vorläufermuster in WT- und Gdnfhyper/Hyper-Nieren veranschaulicht wird ( 3E –H; vergleiche mit 2 ). Endlich,

Wir fanden heraus, dass ~18 % der NP-Nischen SIX2--positive NPCs auf P4 aufrechterhielten und engagierte NPCs in Gdnfhyper/hyper vorhanden warenNierenbis P6, während engagierte NPCs in WT entdeckt wurden

Nierennur bis P4 (Abb. 4; Abb. S1H). Dies zeigt, dass die NP-Lebensdauer in vivo nicht festgelegt ist, und legt nahe, dass die Modulation der Wachstumsfaktorspiegel, insbesondere GDNF, zum Timing der endgültigen Nephron-Differenzierungswelle beiträgt.

Wir stellten die Hypothese auf, dass persistente NPCs in postnatalen Gdnfhyper/Hyper-Nieren entweder aus allgemeinen Kompensationsmechanismen resultieren könnten, die durch UB-Verzweigungsdefekte hervorgerufen werden, die zu Nierenhypoplasie führen (Kumar et al., 2015; Li et al., 2019) oder alternativ von GDNF-spezifisch stammen könnten Auswirkungen auf die NP-Population. Um zwischen den Optionen zu unterscheiden, wurden postnatale NPs in anderen Modellen der Nierenhypoplasie analysiert. Fgf9;20-mangelhaftNierenzeigen eine ähnliche Verdünnung embryonaler NP-Zellschichten (Barak et al., 2012), wie sie in Gdnfhyper/hyper nachgewiesen wurdenNieren, aber wir konnten SIX2-- und/oder PAX2--positive Zellen in ihren postnatalen NP-Nischen nicht nachweisen (Abb. S2). Um dies weiter auszuführen, haben wir als nächstes Hoxb7Cre analysiert; Mek1fl/fl; Mek2 plus /− Nieren (Ihermann-Hella et al., 2014), bei denen ähnlich wie bei Gdnfhyper/hyper-Mäusen eine Nierenhypoplasie durch eine gestörte UB-Verzweigung verursacht wird. Diesem Modell fehlten auch Anzeichen einer verlängerten Nephrogenese, wie durch das Vorhandensein von SIX2-- und/oder PAX2--positiven Zellen in ihren postnatalen NP-Nischen festgestellt wurde (Abb. S3), was die Ansicht stützt, dass eine Nierenhypoplasie als dies reicht nicht aus, um die postnatale Nephrogenese aufrechtzuerhalten.

Veröffentlichte Daten zeigen auch, dass eine Nierenhypoplasie allein die postnatale NP-Erhaltung nicht unterstützen kann (Kuure und Sariola, 2020), was weiter auf eine aktive Rolle von GDNF hindeutet. Wir können jedoch die Möglichkeit nicht vollständig ausschließen, dass überschüssige Wachstumsfaktoren außer GDNF die gleiche Wirkung haben würden.

Anhaltende postnatale NPs halten das nephrogene Programm über seine normale Beendigung hinaus aufrecht

Anhaltende postnatale NPs halten das nephrogene Programm über seine normale Beendigung hinaus aufrecht

Als nächstes das Differenzierungspotential anhaltender NPs im postnatalen Gdnfhyper/hyperNierenwurde untersucht. Die Ki67-Analyse ergab vergleichbare postnatale Proliferationsmuster in WT- und Gdnfhyper/Hyper-Nieren bis P4 (Fig. 5A, B). Ab P5 nahmen die Ki67--positiven Zellen in der kortikalen Differenzierungszone der WT-Nieren ab (Abb. 5C, E, G). Ein solcher Rückgang der kortikalen Proliferation wurde in Gdnfhyper/Hyper-Nieren nicht festgestellt, die aktiv zyklische Zellen in Nephron-Vorläufer-ähnlichen Strukturen bei P7 zeigten (Abb. 5D, F,

H), aber nicht mehr bei P12 (Abb. S4A,B).

Postnatale Nephron-Differenzierungsanalyse zeigte eine übermäßige Menge an Nephron-Vorläufern in Gdnfhyper/hyperNierenbis P7, während diese in WT-Nieren nur bis P4 nachgewiesen wurden (Abb. 6; Abb. S4C-F). Eine solche anhaltende postnatale Nephrogenese konnte jedoch die glomeruläre Dichte gegenüber der in späten Embryonalstadien nicht erhöhen (Abb. S5A-C; 6,4 ± 2,1 gegenüber 10,2 ± 1,2; Mittelwert ± Standardabweichung). Der Anteil der kortikalen Glomeruli in Gdnfhyper/Hypernieren bei P7 (59 Prozent) ist 1,5-mal höher

Abb. 1. Nephron-Vorläufer werden in embryonalem Gdnf hyper/hyper erschöpftNieren. (A,B) Nephron-Vorläufer (NP)-Marker SIX2 (rot) lokalisiert auf Mesenchym, das die Spitzen der Ureterknospe (UB) (Calbindin, grün) in WT (A; n=4 Nieren) und Gdnfhyper/hyper (B; n=5 Nieren) Nieren bei E11.5. (C,D) E12.5 WT (C) und Gdnfhyper/hyper (D) Nieren, die 24 h in vitro kultiviert und für SIX2 (rot) gefärbt wurden, um die NP-Population und Calbindin (grün) für UB sichtbar zu machen (n{{9} } Nieren/Behandlung, drei unabhängige Experimente). (E, F) NPs sind reichlich vorhanden in E14.5 WT-Niere (E; 42,6/Spitze), während in Gdnf-Hyper/Hyper-Niere NPs deutlich reduziert sind (F; Pfeile, 29,8/Spitze) (n=207 für WT und 431 für Gdnfhyper/Hypertips, analysiert in neun Nieren/Genotyp).

Weiße Pfeile zeigen auf die NP-Zellen (rot).

(G) Analyse von SIX2-positiver NP-Menge in WT und Gdnfhyper/hyperNierenzeigt vergleichbare anfängliche NP-Pools bei E12,5. Die Daten werden als mittlere Menge von SECHS 2- positiven NPs ± sem im Vergleich zu denen von WT-Wurfgeschwistern dargestellt, die auf 100 Prozent gesetzt sind und die Ergebnisse aus vier unabhängigen Würfen widerspiegeln (WT: 100 ± 15,61 Prozent , n{{ 7}}; Gdnfhyper/hyper: 124,74 ± 33,89 Prozent, n=5; P=0.533, zweiseitiger t-Test in SPSS). (H) Der Anteil proliferierender SIX2--positiver NPs in Gdnfhyper/Hypernieren bei E12,5 zeigt eine signifikante Abnahme im Vergleich zu WT-Nieren. Die Daten werden als mittlerer Anteil proliferierender SIX2--positiver NPs ± sem im Vergleich zu denen von WT-Wurfgeschwistern dargestellt, die auf 100 Prozent gesetzt sind, und spiegeln die Ergebnisse wider, die von drei unabhängigen Würfen erhalten wurden (WT: 100±9,04 Prozent, n{{ 25}}; Gdnfhyper/hyper: 56,94 ± 12,67 Prozent , n=5;

*P=0.024, zweiseitiger t-Test in SPSS). Maßstabsbalken: 100 µm.

als im WTNieren(39 Prozent) (Tabelle 1), was die Ansicht unterstützt, dass der anhaltende postnatale NP-Pool in Gdnfhyper/Hyper-Nieren neue Nephrone nach Beendigung der normalen Nephrogenese induziert.

Gdnfhyper/hyper-Mäuse mit verlängerter Nephrogenese in stark hypodysplastischen Nieren zeigen während ihrer kurzen Lebensdauer keine Anzeichen einer Neoplasie oder Tumorgenese (Kumar et al., 2015; Turconi et al., 2020).

Gdnfwt/hyper-Nieren zeigen einen milderen embryonalen Rückgang von NPCs als Gdnfhyper/hyperNieren. Diese Mäuse haben eine normale Lebensdauer und zeigen keine TumoreNieres und andere Organe (Turconi et al., 2020) (Abb. S6A-D, n=62). Der zweifache GDNF-Anstieg während der Embryogenese hält jedoch die NP-Population in postnatalen Gdnfwt/Hypernieren nicht aufrecht (Abb. S6E, F), was auf eine Enge hindeutet

Abb. 2. Wirkung von überschüssigem GDNF auf die embryonale Nephrogenese. (A) LEF1 (rot), ein Marker für prätubuläre Aggregate, distale Nierenbläschen und S-förmige Körper, in WT E14.5-Niere. (B) E14.5 Gdnfhyper/Hyperniere zeigt sehr wenige LEF1--positiv differenzierende Nephronvorläufer und eine typische Fülle von Ureterknospen (UB)-Epithel, wie durch Calbindin-Färbung (grün) nachgewiesen.

(C) Cyclin D1 (rot) färbt alle Vorläufer von differenzierenden Nephronen (Sternchen markieren prätubuläre Aggregate und kommaförmige Körper, Pfeile zeigen auf S-förmige Körper), die in E14.5 reichlich neben UB-Epithel (grün) beobachtet werden können WTNiere.

(D) Signifikant weniger differenzierende Nephronvorläufer werden in E14.5 Gdnfhyper/hyper nachgewiesenNiere. (E, F) Cyclin D1 (rot) Lokalisierung in E16.5 WT (E) und

Gdnfhyper/hyper (F) Nieren. Calbindin (grün)

Färbung visualisiert UB-Epithel in allen Bildern. Für jede Färbung im gegebenen Stadium n=3 Nieren/Genotyp. Maßstabsleiste: 100 µm.

Tabelle 1. Quantifizierung der glomerulären Dichte in Gdnfhyper/Hypernieren bei E18.5 und P7

Die Daten sind die durchschnittliche Menge an Nephron pro Kubik mm ± sem (n=4 Nieren/Genotyp, durchschnittlich acht Objektträger, die für jede Niere mit Intervallen von 125 µm analysiert wurden, um Wiederholungszählungen derselben Glomeruli zu vermeiden). Der Anteil der kortikalen Glomeruli in WT-Nieren bei E18,5 beträgt 12 Prozent, während er in Gdnfhyper/Hyper-Nieren 17 Prozent beträgt. Bei P7 ist der Anteil der Glomeruli im Kortex bei Gdnfhyper/hyper weiter erhöhtNieren,was darauf hindeutet, dass Nephrone immer noch aktiv differenzieren.

Schwellenwert für die Fähigkeit von GDNF, das nephrogene Programm zu modulieren.

Anhaltende postnatale Nephrogenese hängt von Veränderungen in der GDNF-induzierten Signalgebung ab

Die Gdnf-Expression geht von P2 (www.gudmap.org) aus WT-Nieren verloren, während seine mRNA und sein Protein noch in Gdnfhyper/hyper vorhanden sind

Anhaltende postnatale Nephrogenese hängt von Veränderungen in der GDNF-induzierten Signalgebung ab

Gdnf-Ausdruck geht von WT verlorenNierenvon P2 (www.gudmap.org), während seine mRNA und sein Protein noch in Gdnfhyper/hyper vorhanden sind

Nierenerst bei P7 (Fig. 7A-D). Der konservative GDNF-Rezeptorkomplex wird nur in den epithelialen UB-Spitzen exprimiert (Costantini, 2012;

Goldenet al., 1999). Aufgrund der Rezeptorlokalisierung in dem an die NPC-Population angrenzenden Gewebe vermuteten wir, dass die Wirkungen von erhöhtem endogenem GDNF auf die Nephrogenese vermittelt sein müssen

durch UB-abgeleitete, sekretierte, GDNF-abhängige Moleküle (http://www.signalpeptide.de/index.php) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011; Schmidt-Ott et al., 2005) (Tabelle 2), oder andere Moleküle, deren Expression sich aufgrund des übergroßen UB ändern könnte.

Die Expressionsanalyse von UB-abgeleiteten, sezernierten GDNF-Targets zeigte eine signifikante Hochregulierung von Crlf1, Srgn und Wnt11 in Gdnfhyper/Hyper-Nieren bei E14,5 (Fig. 7E). Auch die Wnt9b-Expression ist signifikant erhöht (Fig. 7E). Weitere Analysen der WNT/-Catenin-Signalisierungsziele (Clevers und Nusse, 2012) in E14.5-Kontroll- und Gdnfhyper/Hyper-Nieren zeigten eine signifikante Hochregulierung des kanonischen Ziels Axin2 (P=0.003371), während NP-exprimiertes WNT Ziele (Karner et al., 2011) zeigten einen Trend zur Herunterregulierung, was wahrscheinlich die reduzierte Gesamtzahl von NPCs widerspiegelt (Abb. S7A). Zusammen weisen diese darauf hin, dass nicht nur eine verstärkte GDNF-induzierte Signalübertragung, sondern auch eine erhöhte Wnt9-- und Wnt{11--induzierte Signalübertragung mit bekannten Funktionen in der NPC-Regulierung an der Vermittlung der reziproken Kommunikation von mutiertem UB zum angrenzenden NP-Pool beteiligt sind E14.5 (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018).

Abb. 3. Nephrondifferenzierung bei Beendigung der Nierenmorphogenese. (A) P3 WT-Niere hat kortikale SIX2--positive Nephron-Vorläufer (NP) verloren, wie durch den Verlust von Zellen im Kappenmesenchym (Pfeil) gezeigt wird. Stattdessen lokalisiert sich SIX2 am lateralen Mesenchym und frühen Nephron-Vorläufern (Pfeilspitzen).

Die Quantifizierung von 48 NP-Nischen (analysierte Spitzenzahlen) ergab nur fünf Nischen mit NPs. (B) Für SIX2 positives Cap-Mesenchym ist immer noch in Gdnfhyper/Hyperniere bei P3 (Pfeile) vorhanden. Die Quantifizierung von 107 NP-Nischen (analysierte Spitzenzahlen) ergab 63 Nischen mit NP-Zellen. (C,D) PAX2 (rot) und Calbindin (grün) Färbung in WT (C) und Gdnfhyper/hyper

(D) Nieren bei P3. Pfeile zeigen auf die Position, wo NP-Zellen in Gdnfhyper/hyper gehalten werdenNieren.

(E,F) Vergleichbare Menge an Cyclin D1--positiven (roten) Nephronvorläufern in P3 WT (E) und Gdnfhyper/hyper

(F) Nieren. (G,H) Die Visualisierung von LEF1--positiven Nephronvorläufern (rot) und Ureterepithel (grün) zeigt eine ähnliche laufende Nephrogenese bei WT

(G) und Gdnfhyper/hyper (H) Nieren. Für jede Färbung

n=3 Nieren/Genotyp. Maßstabsbalken: 100 µm.

Molekulare Charakterisierung von P5 Gdnfhyper/hyperNierenzeigten eine anhaltende Hochregulierung von Crlf1, Etv4, Etv5, Cited1 und Uncx4.1 (auch bekannt als Uncx), zeigten aber auch eine erhöhte Expression des potenziellen Nischenfaktors Lama1 (Rayagiri et al., 2018), des Nephron-Differenzierungsinduktors Wnt4 (Stark et al. , 1994) und WNT-Signal-Agonist R-Spondin 1 (Rspo1) (Fig. 7F; Fig. S7B). Ein solches Transkriptionsprofil deutet auf eine verstärkte, von UB abgeleitete Wirkung auf NPs hin, die anscheinend eine Differenzierungswelle durchlaufen, die auf der verringerten Fgf9- und Fgf20-Expression und der verschobenen Lokalisierung von SIX2 plus-Zellen basiert ( 4C , D und 7F ). Wir haben funktionell getestet, ob die am deutlichsten erhöhten Crfl1-, Wnt11- und Wnt9b-Expressionen möglicherweise das nephrogene Programm in der Maus beeinflussen. CRLF1 induziert im Komplex mit seinem physiologischen Liganden, dem Cardiotropin-ähnlichen Zytokin, die Differenzierung in isolierten Rattennieren-Mesenchymkulturen (Schmidt-Ott et al., 2005). Die Charakterisierung von Crfl1--Knockout-Nieren ergab eine vergleichbare Nierengröße und Nephrogenese mit WT-Nieren (Abb. S6C-F), was auf entbehrliche CRLF1-Funktionen in vivo hindeutet. Als nächstes wurde der Beitrag einer erhöhten kanonischen WNT-Signalgebung zu den durch überschüssiges GDNF verursachten Phänotypen getestet. IWR1 hemmt die Tankyrasen 1 und 2, die für eine normale Nierenentwicklung notwendig sind (Chen et al., 2009; Huang et al., 2009; Karner et al., 2010). Die IWR1-Behandlung verringerte die Anzahl und Morphologie der UB-Spitze in Gegenwart von überschüssigem GDNF (Abb. S8). Schließlich fragten wir, ob eine signifikant erhöhte Wnt11-Expression in Gdnfhyper/Hyper-Nieren zu dem verlängerten nephrogenen Programm in Gdnfhyper/Hyper-Mäusen beiträgt, indem das Wnt11-Knockout-Allel mit dem Gdnfhyper-Hintergrund gekreuzt wird. Dies konnte keine doppelte Homozygote erzeugen

Abb. 4. Nephron-Vorläufer werden in den postnatalen Gdnfhyper/Hyper-Nieren dauerhaft aufrechterhalten. (A,B) Lokalisierung des Nephron-Vorläufermarkers (NP) SIX2 (rot) im WT an P4 (A) und P6 (B) zeigt den Verlust von NPs in WT-Nieren, in denen SIX2 nur in schwach positiven Nierenbläschen (Sternchen) gefunden wird . (C) In Gdnfhyper/hyper-Nieren bei P4 lokalisiert SIX2 auch auf NPs, die die Spitzen der Harnleiterknospe (grün) (Pfeile) bedecken (n=315 Spitzen in WT und 245 in Gdnfhyper/hyper, analysiert in vier Nieren/Genotyp). (D) Die Lokalisierung von SIX2 (rot) und Calbindin (grün) in P6 Gdnfhyper/Hypernieren zeigt die Persistenz festgeschriebener NP-Zellen (13; * zeigt differenzierende Nephrone) in der mutierten Niere (n=3 Nieren/Genotyp) . Die Quantifizierung von NP-Zellnischen zeigte sehr wenige Spitzen, die keine SIX2--positiven NPs in WT-Nieren aufwiesen, während 81 Prozent der Nischen in Gdnfhyper/Hyper-Nieren (n=2, 16 Nischen) begleitet waren mit SIX2-Positivität bei festgelegten und differenzierenden Nephronvorläufern. Maßstabsleiste: 100 µm.

Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/− Nachkommen (Tabelle 3; n=95; P=0.005 Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /− Zucht). Diese Ergebnisse weisen auf eine embryonale Letalität für Gdnfhyper/hyper;Wnt11−/−-Mutanten hin und zwangen uns, die Analyse auf Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /−-Nieren zu konzentrieren. Die Entfernung eines Wnt11-Allels im Gdnfhyper/hyper-Hintergrund verbesserte leicht die UB-Morphologie und reduzierte die Nierengröße weiter als bei Gdnfhyper/hyper-Nieren, was wahrscheinlich die verringerte Bildung von Sammelrohrzysten bei einer Verringerung der Wnt11-Dosierung widerspiegelt (Abb. S9A-C). Die SIX2--positive NP-Population war jedoch erhöht (29,8 NPC/Spitze gegenüber 40,7 NPC/Spitze bei E14,5 und 20,3 NPC/Spitze gegenüber 30,9 bei P0) und die Nephrogenese wurde in der kortikalen Differenzierungszone von Gdnfhyper/Hyper verbessert ;Wnt1 plus /− Nieren (Abb. 8; Abb. S9D-F; vergleiche auch mit Abb. 1F). Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass erhöhte GDNF-Spiegel mehrere aus Knospen stammende GDNF/Ret-Targets verstärken, die nicht allein, sondern in Kombination miteinander und zusammen mit einer erhöhten kanonischen WNT-Signalgebung NPCs in embryonalen Nieren regulieren.

DISKUSSION Die Anzahl der Nephronen wird während des fötalen Lebens definiert und kann von Person zu Person stark variieren. Die NP-Expansion und -Lebensdauer haben einen großen Einfluss auf die endgültige Nephronausstattung, und daher ist die Identifizierung von Regulierungsmechanismen, die die NP-Selbsterneuerung steuern, wichtig. Hier zeigen wir, dass der neurotrope Faktor GDNF, von dem bekannt ist, dass er die Nierenentwicklung initiiert und die UB-Morphogenese reguliert (Costantini, 2010; Kurtzeborn et al., 2018; Li et al., 2019), trotz seiner negativen Auswirkungen auf das Nierenwachstum in der Lage ist Verlängerung des nephrogenen Programms über seine normale Beendigung hinaus. Unsere Ergebnisse zeigen, dass überschüssiges GDNF einen zweiphasigen Effekt auf die NP-Selbsterneuerung und -Erhaltung hat. Basierend auf unserer Analyse schlagen wir ein Modell vor, wie überschüssiges GDNF in Gdnfhyper/Hypernieren funktioniert

durch Mechanismen, die Änderungen in der Zellzyklusprogression und der Fähigkeit beinhalten, Wachstumsfaktorspiegel zu erkennen. Anfänglich in embryonalen Nieren verursachen hohe GDNF-Spiegel einen raschen Rückgang der NP-Zahlen pro Nische, was für viele Mausmodelle mit primärem UB-Mangel typisch ist (Carroll und Das, 2013; Chen et al., 2015b; Costantini und Kopan, 2010; Liu et al., 2018). Der vorzeitige NP-Abfall, der in diesen zuvor veröffentlichten Modellen beobachtet wird, wird typischerweise durch ihre vorzeitige Differenzierung verursacht, was bei Gdnfhyper/Hypernieren nicht der Fall ist. Stattdessen ist überschüssiges GDNF in der Lage, den aktiven Zellzyklus in der postnatalen Nierenrinde signifikant länger aufrechtzuerhalten, als dies bei WT-Nieren der Fall ist. Die Proliferation findet in NP-Zellen statt, die länger aufrechterhalten werden als in WT-Nieren, und sie produzieren ständig neue Nephrone. In der Zukunft wird es interessant sein zu sehen, ob es möglich sein wird, überschüssiges GDNF in einer Weise zu verabreichen, die für eine fortgesetzte postnatale Nephrogenese günstig ist, ohne die UB-Morphogenese stark zu beeinträchtigen, um das gesamte Organwachstum zu verzerren. Unsere Daten zeigen, dass der frühe Rückgang der embryonalen NPs von Gdnfhyper/Hypernieren eher auf eine verringerte Zellproliferation als auf eine erhöhte vorzeitige Differenzierung zurückzuführen ist. Dieser zelluläre Mechanismus wird durch molekulare Veränderungen unterstützt, die in bekannten GDNF-Targets (Crlf1, Wnt11 und Srgn) (Lu et al., 2009; Ola et al., 2011) und in wichtigen Regulatoren der NP-Zellerhaltungssignalisierung (Wnt9b, Wnt11 und ihre Transkriptionsziele) (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; O'Brien et al., 2018). Frühere Untersuchung der Langlebigkeit und Resilienz von NP-Zellen durch Ablation der NP-Population mit Diphtherietoxin A oder durch Störung der MAPK/ERK-Aktivierung, die beide zu einem schnellen Rückgang der NP-Zellen ohne positive Auswirkung auf ihre Lebensdauer führten (Cebrián et al., 2014 ; Ihermann-Hella et al., 2018) legen zusammen mit unseren Ergebnissen nahe, dass die NP-Zellproliferation von Natur aus eine wichtige Rolle bei der Definition ihrer Gesamtlebensdauer spielt. In Übereinstimmung damit zeigen NP-Zellen in späten embryonalen Nieren signifikant reduzierte Proliferationsraten und beschleunigte Differenzierung, während die Transplantation alter NP-Zellen in Nieren im Frühstadium ihre Lebensdauer verlängert (Chen et al., 2015a). Basierend auf unseren Ergebnissen schlagen wir vor, dass GDNF zu dem Mechanismus beiträgt, durch den NP-Zellen ihr Entwicklungsalter und letztendlich ihre Lebensdauer erkennen. In einer normalen Niere ist die GDNF-Expression zu Beginn der Nierenmorphogenese und während der aktiven Wachstumsphase hoch, während in späten embryonalen Nieren ein deutlicher Rückgang der GDNF-Spiegel auftritt, was zu einem Verlust der Expression im frühen postnatalen Stadium führt (Abb. 7 und 9). . Die GDNF-Spiegel in frühen Gdnfhyper/Hyper-Nieren sind ungewöhnlich hoch, was die Proliferation von NP-Zellen zu hemmen scheint, wahrscheinlich aufgrund der nachgewiesenen zellulären und molekularen Veränderungen innerhalb des mutierten UB, wie z. B. einem veränderten WNT-Weg

(Abb. 7E,F; Abb. S7A,B), die bekannte Auswirkungen auf die NPC-Biologie hat (Karner et al., 2011; Kiefer et al., 2012; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Ähnlich wie bei WT-Nieren nehmen die Gdnf-mRNA- und GDNF-Proteinspiegel in postnatalen Gdnfhyper-/Hypernieren ab, in denen Gdnf auf posttranskriptioneller Ebene manipuliert wird, was eine endogene zeitliche Regulation der Expression ermöglicht (Kumar et al., 2015). Wahrscheinlich verringert dies die GDNF-Expression auf das Niveau, das für die Selbsterneuerung und Differenzierung von NP-Zellen zulässig ist, was als anhaltendes nephrogenes Programm in postnatalen Nieren nachgewiesen wird ( 9 ). Eine solche neu erkannte wachstumsfaktorabhängige Plastizität bei der renalen Differenzierung lässt hoffen, dass sie in Zukunft für regenerative Zwecke verwendet wird. Die ersten Anhaltspunkte für die Möglichkeit einer Verlängerung der Nephron-Differenzierungszeit ergaben sich aus Experimenten zur Hemmung von BMP/

Abb. 5. Anhaltende kortikale Proliferation in postnatalen Gdnfhyper/Hypernieren. (A,B) Ki67-Färbung in P4 WT (A) und Gdnfhyper/hyper (B) Nieren zeigt ein ähnliches Muster von proliferativen Zellen in den kortikalen Nieren (rote Pfeile) beider Genotypen. (C,D) In ​​P5-WT-Nieren (C) ist die Ki67--Positivität im Cortex signifikant reduziert (roter Pfeil), während Gdnfhyper/Hyper-Nieren (D) fokal immer noch eine sehr hohe Proliferation aufweisen (rote Pfeile). (E, F) Die Proliferation in der kortikalen WT-Niere (E) wird bei P6 weiter verringert, während sie in Gdnfhyper/Hyper-Nieren (F) hochaktiv bleibt. (G,H) Ki67--positive proliferative Zellen lokalisieren sich in medullären Nierentubuli (schwarzer Pfeil) in P7 WT-Nieren (G), aber aktive Proliferation wird immer noch in kortikalen differenzierenden Nephronstrukturen (rote Pfeile) von Gdnfhyper/Hyper-Nieren nachgewiesen (H). Für jedes postnatale Stadium n=3 Nieren/Genotyp. Maßstabsleiste: 1 mm.

P7 nur bei Gdnfhyper/Hypernieren. (A,B) Nephron-Vorläufermarker LEF1 (rot) in WT- (A) und Gdnfhyper/hyper- (B) Nieren bei P4 zeigt eine anhaltende Nephrogenese in beiden Genotypen (Pfeile) (n=2 Nieren/Genotyp). (C,D) P5-WT-Nieren (C) zeigen sehr wenige LEF1--positive Zellen im Kortex, während in Gdnfhyper/Hyper-Nieren reichlich Nephrogenese nachgewiesen wird (D; Pfeile; n=4 Nieren/Genotyp) . (E, F) LEF1 ist im Kortex von WT-Nieren bei P6 (E) nicht mehr vorhanden, während in Gdnfhyper/Hyper-Nieren (F) (n=3 Nieren/Genotyp) noch reichlich Nephron-Vorläufer nachgewiesen werden. (G) Cyclin D1 (weiß) und JAG1 (rot) lokalisieren sich in differenzierten distalen Nephrontubuli (gelber Pfeil und Pfeilspitze) in der P7-WT-Niere (n=3-Nieren). (H) In P7 Gdnfhyper/Hypernieren lokalisieren sich Cyclin D1 und JAG1 in kommaförmigen (Pfeilspitze) und S-förmigen (Pfeil) Körpern von Nephronvorläufern in der kortikalen Differenzierungszone und zeigen somit eine anhaltende Nephrogenese in diesem späten postnatalen Stadium (n{ {19}} Nieren). Maßstabsbalken: 100 µm.

SMAD1/5-Signalisierung, was zu etwas größeren Nieren mit mehr Nephronen führte als in Vehikel-behandelten Nieren (Brown et al., 2015). Eine verringerte Dosierung von Tsc1, das einen mTOR-Inhibitor codiert, hält NP-Zellen für einen weiteren Tag aufrecht, ohne dass Auswirkungen auf die Anzahl embryonaler NP-Zellen berichtet wurden (Volovelsky et al., 2018). Eine verlängerte Nephrogenese wurde auch bei Mäusen mit Überexpression von Lin28, Lin28b oder inaktiviertem Let-7 (Let-7a1; Let-7d; Let-7f1) beobachtet (Urbach et al ., 2014; Yermalovich et al., 2019), die ebenfalls entweder eine direkte Tumorgenese oder eine Aktivierung der Igf2- oder H19h-Loci zeigen, die mit dem pädiatrischen Nierenkrebs Wilms-Tumor assoziiert sind (Chen et al., 2018; Ogawa et al., 1993). Anzumerken ist, dass bei Gdnfhyper/Hyper-Nieren, die hypodysplastisch und mit dem Leben für drei Wochen kompatibel sind, keine Veränderungen der pSMAD1/5-Lokalisation oder -Spiegel festgestellt wurden.

Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Charakterisierung der GDNF-Funktion in der Nephrogenese, die zuvor durch Verringerung der endogenen Gdnf-Dosierung untersucht wurde und zu einer reduzierten Nephronausstattung führt (Cullen-McEwen et al., 2001, 2003). Der kanonische Rezeptorkomplex für GDNF wird von der RET-Tyrosinkinase und ihrem Korezeptor GFRa1 gebildet, die ausschließlich nur im UB-Epithel koexprimiert werden (Costantini, 2012; Golden et al., 1999; Pachnis et al., 1993) . GDNF ist ein wichtiger Nischenfaktor für UB-Tip-Zellen (Chi et al., 2009; Riccio et al., 2016; Shakya et al., 2005). Wir haben zuvor gezeigt, dass überschüssiges GDNF den Sammelrohr-Vorläuferpool auf Kosten der Harnleiterverlängerung erweitert, was zu einer erweiterten Spitze und einem kurzen Stammphänotyp aufgrund von Defekten in der Vorläufermotilität und einer verkürzten Zellzykluslänge führt (Li et al., 2019). Während der embryonalen Stadien die kombinierte Wirkung von abnorm

Abb. 7. Expressionsanalyse der entscheidenden Regulatoren der Nierenentwicklung. (A) Der In-situ-Hybridisierungsassay von Gdnf bei P4 kann keine Transkripte in der WT-Niere (n=3-Nieren) nachweisen. (B) Die Gdnf-Expression wird in P4 Gdnfhyper/Hyperniere aufrechterhalten und lokalisiert sich in der kortikalen Differenzierungszone, in der Nephron-Vorläufer aufgrund von überschüssigem GDNF (n=3 Nieren) aufrechterhalten werden (rote Pfeile). (C) qRT-PCR-Analyse von Gdnf-Transkripten in Gdnfwt/ko-, WT-, Gdnfwt/hyper- und Gdnfhyper/hyper-Nieren bei P7 (n=3 Nieren/Genotyp). Die Gdnf-Expression in Gdnfhyper/Hypernieren ist signifikant höher als in WT (P=0.036) und Gdnfwt/ko (P=0.038) (Mittelwert ± Standardabweichung, zweiseitiger t-Test in SPSS ). (D) ELISA-Analyse der GDNF-Proteinspiegel in P7-Nieren (n=5 Nieren/Genotyp) (Mittelwert ± Standardabweichung). (E,F) qRT-PCR-basierte Quantifizierung der relativen Expressionsniveaus der ausgewählten Gene bei E14 (E) und bei P5 (F) (n=3 Nieren/Genotyp im gegebenen Stadium). Die von UB stammenden sezernierten GDNF-Targets sind oberhalb der gestrichelten Linie aufgeführt, während andere bekannte Nephrogenese-Regulatoren unterhalb der Linie dargestellt sind. Gdnfhyper/ hyper-Nieren zeigen eine signifikante Hochregulierung von Crlf1 (*P{=3.019), Srgn (*P=0.021), Wnt11 (**P=0.001) und Wnt9b ( **P=0.01) bei E14, während bei P5 signifikant erhöhte Genexpressionen Crlf1 (**P=0.009), Etv4 (**P=0) umfassen.{{ 39}}), Etv5 (*P=0.03), Lama1 (*P=0.014) und Wnt4 (*P=0.026). Im Gegensatz dazu ist die Transkription von Sostdc1 (**P=0.000), Fgf9 (**P=0.001) und Fgf20 (**P=0.001 ) ist bei Gdnfhyper/Hypernieren bei P5 signifikant verringert. Maßstabsleiste: 100 µm.

hohes GDNF, anomale UB-Spitzenmorphologie-induzierte biophysikalische Veränderungen und damit verbundene molekulare Veränderungen in GDNF-Targets und dem WNT-Weg scheinen NP-Zellen gemeinsam in Richtung einer verminderten Proliferation zu treiben. Wir zeigen hier, dass sich die erweiterte UB-Spitzenmorphologie im Laufe der Zeit verbessert, aber bei milden Formen bis zu P4 bei postnatalen Gdnfhyper/Hyper-Nieren bestehen bleibt (Abb. 5). UB-Tip-Zellen sind molekular immer noch in P5 Gdnfhyper/Hypernieren vorhanden, die hohe Konzentrationen der GDNF-regulierten Tip-Marker Crlf1, Etv4, Etv5 und Lama1, NPC-exprimierter kanonischer WNT-Targets Cited1 und Uncx4.1 sowie des WNT-Agonisten R exprimieren -spondin1 (Abb. 7E,F; Abb. S7A,B) (Karner et al., 2011; Lu et al., 2009; Vidal et al., 2020). Solche molekularen Veränderungen im postnatalen UB bieten daher wahrscheinlich ein günstiges Umfeld für eine anhaltende NP-Selbsterneuerung über P2/P3 hinaus. Wir identifizierten UB-abgeleitetes sekretiertes CRLF1 und WNT11 als GDNF-Targets, die zusammen mit erweitertem kanonischem WNT

Signalisierung, die zusätzlich durch eine erhöhte Wnt9b-Expression verstärkt wird, vermitteln ihre Auswirkungen auf die NP-Regulierung. Unsere Daten zeigen auch, dass die Funktion von CRLF1 mit anderen Zytokinen redundant ist, da seine Inaktivierung die renale Differenzierung nicht beeinflusst. Sowohl WNT9b als auch WNT11 regulieren viele Aspekte von NPCs und Nephrogenese (Carroll et al., 2005; Karner et al., 2011; Majumdar et al., 2003; Nagy et al., 2016; O'Brien et al., 2018). Die Hochregulierung von UB-exprimiertem Wnt9b, von dem bekannt ist, dass es viele Aspekte der Nephrogenese reguliert, in Gdnfhyper/Hyper-Nieren kann seine erzwungene Expression in NPs nachahmen, was ihr Gleichgewicht zwischen Aufrechterhaltung und Differenzierung stört (Kiefer et al., 2012) und somit mechanistisch dazu beiträgt zu unausgeglichener NP-Selbsterneuerung bei Gdnfhyper/Hypernephrogenese. Dies wird durch eine verbesserte Spitzenmorphologie nach kanonischer WNT-Hemmung durch IWR1 in ganzen Nieren mit überschüssigem GDNF unterstützt.

Tabelle 2. Ausgeschiedene GDNF-Zielgene mit Potenzial zur Beeinflussung des nephrogenen Programms

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die IWR1-Hemmung selbst einen großen Einfluss auf NPCs hat, die verteilt sind und lose an UB-Spitzen haften. Die kanonische WNT-Hemmung in NPCs selbst trägt wahrscheinlich dazu bei, dass ihr Phänotyp in Gegenwart von überschüssigem GDNF nicht verstärkt wird. Dies wird durch unsere genetischen Experimente unterstützt, in denen die Senkung der UB-exprimierten Wnt11-Expression im Gdnfhyper/Hyper-Hintergrund die NP-Erhaltung und -Differenzierung verbesserte, aber die durch das überschüssige GDNF verursachte Nierenhypoplasie nicht vollständig rettete. Dies kann zumindest teilweise darauf zurückzuführen sein, dass beide Wnt11-Allele im Gdnfhyper/Hyper-Hintergrund aufgrund der embryonalen Letalität von Wnt11–/– nicht inaktiviert wurden (Nagy et al., 2016). Somit kann ein verbleibendes Wnt11-Allel sogar die GDNF-Kaskade verstärken, wie früher vorgeschlagen (Majumdar et al., 2003) und somit teilweise die vollständige Rettung der Nephrogenese verhindern. Unsere aktuelle Studie kann die Möglichkeit nicht ausschließen, dass einige Wirkungen von GDNF auf NPs auf nicht-kanonische GDNF-Signalgebung zurückzuführen sind, da seine potenziellen alternativen Signalrezeptoren von den NPs exprimiert werden (Brodbeck et al., 2004; Enomoto et al., 2004; Keefe Davis et al., 2013; Paratcha et al., 2003). Sowohl die Deletion von NCAM als auch die Expression von Gfra1 nur in UB (indem es unter die Kontrolle des Ret-Promotors gestellt wird) erhalten jedoch den normalen renalen Phänotyp aufrecht (Cremer et al., 1994; Heuckeroth et al., 1999; Keefe Davis et al., 2013; Rossi et al., 1999; Sariola und Saarma, 2003). Dies deutet darauf hin, dass zumindest weder NCAM noch GFRa1 für das nephrogene Programm essentiell sind. Zusammenfassend legen unsere Experimente nahe, dass GDNF, das sich in klinischen Studien für die Parkinson-Krankheit befand und derzeit befindet (Kirkeby und Barker, 2019), das Potenzial haben könnte, als prospektives Mittel zur Verbesserung der Nephronausstattung in der Zukunft zu dienen. Zusätzliche Experimente sind erforderlich, um mögliche Mittel zur übermäßigen Aktivierung der GDNF-Signalgebung ohne schädliche Auswirkungen auf das Nierenwachstum zu identifizieren

MATERIALEN UND METHODEN

Tiere

Tierpflege- und Forschungsprotokolle wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex für Tierversuche sowie den Richtlinien der Europäischen Union (Richtlinie 2010/EU/63) durchgeführt und vom National Animal Experiment Board of Finland genehmigt. Die Mäuse wurden in einzeln belüfteten Käfigen mit Futter und Wasser nach Belieben gehalten. Am zertifizierten Versuchstierzentrum der Universität Helsinki wurde ständig für optimale Befeuchtung und Erwärmung gesorgt. Die Generierung und Genotypisierung der Mausmodelle Gdnfhyper (Kumar et al., 2015) und Fgf9;20 (Barak et al., 2012) wurde bereits beschrieben. Gdnfhyper;Wnt11− Welpen stammen aus Kreuzungen von C57BL6 Wnt11−

Tabelle 3. Zusammenfassung der Nachkommen-Genotypen von Gdnfwt//hyper;Wnt11 plus /–-Kreuzungen

(Nagy et al., 2016) und Gdnfhyper-Linien und wurden wie zuvor beschrieben (Kumar et al., 2015; Nagy et al., 2016) genotypisiert ). Alle in den Studien verwendeten Mauslinien wurden auf einem dreifach gemischten 129Ola/ICR/C57bl6-Hintergrund gehalten. Die Erzeugung von Crlf-Knockout-Mäusen wurde zuvor beschrieben (Alexander et al., 1999). Die PCR-Genotypisierung wurde unter Verwendung eines Neo-spezifischen Primer-Sets (5′-AGAGGCTATTCGGCTATGACTG-3′ und 5′-CCTGATCGACAAGACCGGCTTC-3′) zusammen mit genspezifischen Primer-Sets für Crlf1 (5′-GCCTAATAGGTGCTGGGTGA{{ 18}}′ und 5′-GACCCTATCTGCGTTTTCCA-3′). Gewebeentnahme Embryonen wurden gemäß den Kriterien von Theiler (1989) wie zuvor beschrieben (Kuure et al., 2005) inszeniert und nach zervikaler Dislokation von schwangeren Frauen in tiefer Anästhesie mit CO2 gesammelt. Spätembryonale und postnatale Welpen wurden durch Enthauptung getötet. Das Gewebe wurde in Dulbecco-Medium, ergänzt mit 0,2 Prozent Rinderserumalbumin (BSA), präpariert, gefolgt von einer Fixierung mit 4 Prozent Paraformaldehyd (PFA) oder einer Organkultur. Organkultur Aus E11.5- und E12.5-Mausembryos isolierte Nieren wurden an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche, unterstützt durch ein Transwell®-Polyestermembransystem (Costar), platziert und bei 37 Grad in einer befeuchteten 5-prozentigen CO2-Atmosphäre mit Nierenkulturmedium [F12 :DMEM (1:1) plus Glutamax (Gibco)] ergänzt mit 10 Prozent fötalem Rinderserum und Penicillin-Streptomycin (Ihermann-Hella und Kuure, 2019). Für die In-vitro-Kultur mit 100 ng/ml exogenem GDNF (ProSpec Ltd) (Sainio et al., 1997), die auf die NPC-Quantifizierung abzielte, wurde jeder Urogenitalblock, der Metanephros, das definitive Nierenrudiment, enthielt, entlang der Linea mediana ventralis halbiert. Eine Hälfte jeder Probe wurde mit exogenem GDNF kultiviert, während die andere Hälfte als Kontrolle diente. WNT-Hemmexperimente wurden zuerst mit 50-100 ng/ml GDNF und 50-100 µM IWR1 (I0131-25, Sigma-Aldrich) getestet. Basierend auf diesen Dosisabhängigkeitsexperimenten waren die optimalen Konzentrationen 50 ng/ml GDNF und 75 &mgr;M IWR1. Histologie und Immunfärbung Für Studien zur Untersuchung des interessierenden Markers auf Paraffinschnitten wurden die Nieren aus den Embryonen oder Jungtieren der angegebenen Stadien präpariert, gefolgt von Gewebeverarbeitung und Schnitt wie zuvor beschrieben (Li et al., 2019). Bei jeder Analyse wurden mindestens fünf Schnitte von jeder Niere und drei bis fünf verschiedene Nieren pro Genotyp verwendet. Die genauen Probennummern sind den Abbildungslegenden zu entnehmen. Hämatoxylin und Eosin (H&E) und an Paraffinschnitten durchgeführte Immunhistochemie wurden wie zuvor beschrieben abgeschlossen (Li et al., 2019). Kurz gesagt wurde das sezierte Gewebe über Nacht mit 4 Prozent PFA (pH 7,4) fixiert, gefolgt von Dehydratisierung und Paraffinisierung mit einem automatischen Gewebeprozessor (Leica ASP 200). Schnitte mit einer Dicke von 5 &mgr;m wurden präpariert und in Xylol entparaffiniert, gefolgt von einer Rehydrierung, bevor sie mit Harris H&E gefärbt oder einer hitzeinduzierten Antigen-Wiedergewinnung in Antigen-Wiedergewinnungspuffer (10 mM Citrat; pH 6,0) unterzogen wurden. Für die Immunfärbung wurden 3 % BSA zum Blockieren verwendet (1 h bei Raumtemperatur), gefolgt von einer 30-minütigen Behandlung mit 0,5 % Wasserstoffperoxid für die chromogene Färbung. Die Schnitte wurden dann mit primären Antikörpern über Nacht bei plus 4 Grad inkubiert, gefolgt von einer speziesspezifischen sekundären Antikörperinkubation für 2 h bei Raumtemperatur. Der chromogene Nachweis wurde mit dem EnVision Detection System-HRP (DAB)-Kit (Dako) implementiert.

Abb. 8. Die genetische Abnahme des Wnt11-Spiegels rettet teilweise den Nephron-Vorläuferverlust in Gdnfhyper/Hyper-Nieren. (A) SECHS 2- positive Nephron-Vorläufer (NP, rot) sind in E14.5 Gdnfhyper/Hyper-Nieren spärlich (durchschnittlich 29,8 NPs/Spitze in 552 Spitzen, die in neun Nieren analysiert wurden). (B) Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /– Nieren zeigen eine Zunahme der allgemeinen Häufigkeit von NPs pro Nische in Abwesenheit eines Wnt11-Allels (durchschnittlich 40,7 NPs/Spitze in 107 Spitzen, analysiert in vier Nieren). ). (C,D) PAX2--positive Zellen in Gdnfhyper/hyper (C)- und Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /– (D)-Nieren zeigen ähnliche Muster und Mengen bei E14,5. (EH) Bei P0 zeigt die SIX2-Färbung eine Verbesserung der NP-Zahlen durch die Entfernung eines Wnt11-Allels (durchschnittlich 20,3 NPs/Spitze in 610 Gdnfhyper/Hyper-Spitzen gegenüber durchschnittlich 30,9 NPs/Spitze in Gdnfhyper/hyper;Wnt11 plus /− Spitzen analysiert in sechs Nieren/Genotyp), was durch PAX2-Färbung unterstützt wird. Verteilung von SIX2--positiven NPs (A′,B′,E′,F′) und PAX2--positiven Zellen (C′,D′,G′,H′) ohne Calbindin ( grün) Signal, das das UB-Epithel in allen Nieren darstellt. Maßstabsbalken: 200 µm.

E11.5- und E12.5-Nieren, die einer Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung unterzogen wurden, wurden fixiert und mit 100 % eiskaltem Methanol für 10 Minuten permeabilisiert, bevor sie über Nacht mit primären Antikörpern inkubiert wurden. Die Inkubation mit den entsprechenden speziesspezifischen Sekundärantikörpern erfolgte am zweiten Tag nach einer kräftigen Waschung mit PBST (0,1 Prozent Tween 20 in PBS). Einzelheiten zu den in der vorliegenden Studie verwendeten primären und sekundären Antikörpern sind in Tabelle S1 aufgeführt. In-situ-Hybridisierung Die In-situ-Hybridisierung wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt (Ihermann Hella et al., 2014). Kurz gesagt, eine Antisense-RNA-Sonde gegen Gdnf-Exons wurde transkribiert und auf dicken Schnitten hybridisiert, die von P4-Nieren stammten (10-15-Schnitte/Niere, n=3-Nieren/Genotyp), eingebettet in 4 % niedrig schmelzender Agarose (NuSieve GTG, Lonza). BM Purple wurde für die kolorimetrische Reaktion verwendet

ELISA GDNF-Proteinspiegel in P7.5-Nieren wurden mittels ELISA gemessen, wie zuvor berichtet (Kumar et al., 2015). Bei der Durchführung des ELISA wurde GDNF Emax® Immunoassay (Promega) mit Säurebehandlung verwendet. Im Einzelnen wurden für jeden Genotyp drei Nieren unmittelbar nach dem Sezieren lysiert. Nach Messen der Proteinkonzentration mit dem DC-Protein-Assay (Bio-Rad) wurden 25 &mgr;g Gesamtprotein in die Vertiefung der ELISA-Platte geladen. Jede Probe wurde doppelt analysiert.

Bildgebung Immunfärbung und In-situ-Hybridisierung auf Schnitten wurden entweder mit einem Zeiss AxioImager, der mit der HXP 120V-Fluoreszenzlichtquelle ausgestattet war, einer Hamamatsu Orca Flash 4.0 LT-Schwarzweißkamera und einer Zeiss AxioCam 105-Farbkamera abgebildet , oder mit einem Leica DM5000B, das mit einer Leica EL 6000 Metallhalogenid-Lichtquelle und einer Hamamatsu Orca-Flash4.0 V2 sCMOS-Kamera ausgestattet ist. Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung wurde unter Verwendung eines Zeiss AxioImager mit der Zeiss ApoTome-Anwendung abgebildet. Whole-Mount-Bildgebung für intakte Nierengrößenmessungen wurde unter Verwendung eines Leica MZFLIII, ausgestattet mit einer Leica DFC7000T-Kamera, durchgeführt. Quantitative Analysen basierend auf Immunfärbung und Bildgebung Die Quantifizierung der glomerulären Dichte wurde aus den aufeinanderfolgenden Schnitten von E18.5- und P7-Nieren berechnet. Die Nieren wurden durchschnitten, und Schnitte für die glomeruläre Quantifizierung wurden alle 125 &mgr;m entnommen, um Wiederholungszählungen von Glomeruli zu vermeiden. Die Anzahl der Glomeruli in jedem Abschnitt wurde manuell gezählt, und die Fläche jeder Niere wurde mit der Fiji ImageJ-Software (V1.51) durch manuelles Umreißen der Kontur gemessen. Zur Berechnung der Glomerulumendichte die Gesamtzahl der Glomeruli

Abb. 9. Schematische Darstellung der Auswirkungen von überschüssigem GDNF auf sich entwickelnde Mäusenieren. (A) In embryonalen Nieren, die aktives Wachstum durchlaufen, erhalten die Nephron-Vorläuferzellen (NPC, rot) sezernierte Leitsignale (z. B. Wnt11 und Wnt9b) von Harnleiterknospenspitzen (UBT, dunkelblau), um das Gleichgewicht von NP-Proliferation und Selbsterneuerung zu steuern und deren Differenzierung zu peritubulären Aggregaten (PA, pink cell cluster). (B) In postnatalen Nieren geht die Spitzenidentität des UB (UB, hellblau) verloren, wie molekular belegt durch den Rückgang der Expression von z. B. Wnt9b, Wnt11, Crlf1 und Etv4/5, angezeigt durch dünne rote Buchstaben. Der allmähliche Verlust der von UB abgeleiteten sekretierten Faktoren (Wnt9b, Wnt11 und Crlf1) trägt zum Nachlassen der NP-Proliferation und Selbsterneuerung bei. Gleichzeitig nehmen die GDNF- und FGF-Spiegel ab, was mit einer beschleunigten NP-Differenzierung zusammenfällt. Diese erschöpfen zusammen schnell den NP-Pool, was zu einer Beendigung der Nephrogenese führt. (C) Überschüssiges GDNF in embryonalen Nieren induziert eine abnorme UBT-Morphologie und erhöht die Expression der aus Knospen stammenden, sekretierten regulatorischen Moleküle (Crlf1, Sign, Wnt11 und Wnt9b). Eine übermäßige Expression von aus Knospen stammenden sekretierten Molekülen hat eine hemmende Wirkung auf den NP-Zellzyklus, was zu einer verringerten Proliferation und Selbsterneuerung führt. Drop-in-Gesamt-NP-Zahlen verlangsamen die PA-Differenzierung, wie durch eine verminderte Wnt4-Expression nachgewiesen wird. (D) In ​​den postnatalen Nieren normalisiert sich die UBT-Morphologie und damit die Nische, die sie für den NPS bereitstellt, trotz der höheren als WT-Expression von Knospen-abgeleiteten sekretierten Zielen (Crlf1, Etv4/5 und Lama1). Zusammen mit normalisiertem Wnt9b und Wnt11 (nicht gezeigt) subventionieren diese molekularen Veränderungen die normale NP-Proliferation, Selbsterneuerung und Differenzierung, wie durch die Aufrechterhaltung einer großen NP-Population, eine höhere Wnt4-Expression und eine ähnliche Menge an Nephron-Vorläufern (rosa Cluster von Zellen) wie in embryonalen WT-Nieren. Durch solche Mechanismen ermöglicht ein konstitutiver GDNF-Überschuss unter seinem eigenen Promotor, dass das nephrogene Programm bis P7 fortgesetzt wird. Dunkelgrauer Text, unveränderter Ausdruck; roter Text, verminderter Ausdruck; grüner Text, gesteigerter Ausdruck.

und die Anzahl der Glomeruli im Kortex wurden separat gezählt. Die durchschnittliche Gesamtnierenfläche und die Gesamtzahl der kortikalen Glomeruli wurden dann für jede Probe berechnet. Die durchschnittliche glomeruläre Dichte wurde berechnet, indem die durchschnittliche glomeruläre Anzahl durch die durchschnittlich gemessene Fläche dividiert wurde. Der Durchschnitt der kortikalen Glomeruli innerhalb der gesamten durchschnittlichen Fläche wurde berechnet, indem die durchschnittliche kortikale Glomeruluszahl durch die durchschnittlich gemessene Gesamtfläche dividiert wurde. Nur Glomeruli mit intakter Form wurden aufgezeichnet. Quantifizierung des gesamten SIX2--positiven NPS bei E11,5 (n=4 für WT, n=5 für Gdnfhyper/hyper) und E12,5 (n=10 Nieren/ Behandlung, drei unabhängige Experimente) basierten auf der Whole-Mount-Immunfluoreszenzfärbung. Die Bilder wurden mit der Anwendung von Zeiss ApoTome aufgenommen und dann mit Imaris Software (Bitplane) unter Verwendung von Spot-Tracking verarbeitet. Alle Bilder wurden mit identischen Analyseprotokollen verarbeitet. Um die Variation zwischen den Würfen zu normalisieren, wurde die mittlere Menge an SIX2--positiven NPs in den WT-Nieren innerhalb jedes Wurfs auf 100 Prozent gesetzt und die Menge an SIX2--positiven NPs in den Gdnfhyper /Hypernieren wurde mit der mittleren Menge in den WT-Nieren im Wurf verglichen. Der Mitoseindex von SIX2--positiven NPS in E12.5-Nieren (n=10 Nieren/Behandlung, drei unabhängige Experimente), die mit exogenem GDNF kultiviert wurden, wurden auf ähnliche Weise berechnet, um die Variation zwischen Würfen zu normalisieren.

Der mittlere Anteil an proliferierenden SIX{0}}-positiven NPs in den WT-Nieren und Nieren, die ohne exogenen GNDF kultiviert wurden, innerhalb jedes Wurfs wurde auf 100 Prozent und der Anteil an proliferierenden SIX{{2 }}Positive NPs in Anwesenheit von überschüssigem GDNF (Gdnfhyper/Hypernieren und exogene Applikation) aus demselben Wurf wurden in der Abbildung nach dem Vergleich mit den WT-Wurfgeschwistern aufgetragen. Der mitotische Index von SIX2--positiven NPS in E11.5-Nieren, die mit exogenem GDNF kultiviert wurden, wurde als ursprüngliche Daten/Wert aufgetragen. Die Berechnung der durchschnittlichen SIX2--positiven NPS pro nephrogener Nische (E14.5 und P0) und nephrogener Nischen mit Vorläufern (P3-P6) erfolgte durch Immunfluoreszenzfärbung in Paraffinschnitten. Die Anzahl von SECHS 2- positiven NPS wurde mit der Fiji ImageJ-Software (V1.51) auf jedem Abschnitt gezählt, der für die Analyse unter Verwendung von Partikelanalyse ausgewählt wurde, und die Anzahl der Spitzen wurde manuell auf den entsprechenden Abschnitten gezählt. Die Anzahl der analysierten Proben bei E14,5 betrug drei Nieren für WT- und Gdnfhyper/hyper-Nieren und zwei Nieren für Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /−. Die Anzahl der bei E14.5 analysierten Spitzen betrug 207 bei WT, 431 bei Gdnfhyper/hyper und 107 bei Gdnfhyper/hyper; Wnt11 plus /− Nieren. Die Anzahl der analysierten Proben bei P0 betrug drei Nieren pro Genotyp, und die Anzahl der analysierten Spitzen, die in den entsprechenden Abbildungen dargestellt ist, variiert von 10 bis 315, wobei sie bei WT-P6-Nieren am niedrigsten ist, bei denen die Spitzen selten vorhanden sind. UB-Spitzenmessungen wurden unter Verwendung des LAS X-Programms des Leica-Mikroskopbetriebssystems nach 48-stündiger Kultur in Gegenwart bestimmter Chemikalien und Visualisierung der Spitzen mit E-Cadherin-Antikörper durchgeführt (Tabelle S1). Die Spitzen wurden von sechs Nieren in jedem Zustand von zwei unabhängigen Versuchsreihen gemessen, in denen die Anzahl der gemessenen Spitzen war: 101 für GDNF, 131 für IWR1 und 115 für 75 &mgr;M IWR1 plus 50 ng/ml GDNF. Die Nierengrößenmessungen in Experimenten zur Bewertung der Wirkung der Wnt11-Deletion im Gdnfhyper/Hyper-Hintergrund wurden mit der Fiji ImageJ-Software (V1.51) an Ganzaufnahmebildern durch manuelles Nachzeichnen der Nierenkontur durchgeführt. Statistische Analyse Alle Werte sind als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt, mit Ausnahme der Analyse der Haupteffekte von Gdnf und Wnt11 auf die Nierengröße, die als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt ist. Die statistische Signifikanz wurde auf P gesetzt<0.05 for="" all="" the="" analyses.="" independentsamples="" two-tailed="" t-test="" was="" used="" for="" pairwise="" comparisons="" with="" spss="" statistics="" software="" (ibm;="" version="" 25)="" in="" the="" study="" unless="" otherwise="" noted.="" the="" data="" obtained="" via="" in="" vitro="" tissue="" culture="" with="" exogenous="" gdnf="" was="" analyzed="" with="" the="" paired-sample="" t-test="" using="" spss="" statistics="" software.="" the="" impact="" of="" genetically="" modified="" gdnf="" and="" wnt11="" expression="" on="" kidney="" size="" was="" analyzed="" via="" two-way="" anova="" followed="" by="" main="" effects="" test="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" statistical="" significance="" for="" the="" deviation="" of="" gene="" distribution="" from="" mendelian="" ratio="" was="" performed="" using="" the="" χ2="" test="" also="" with="" spss="" statistics="" software.="" the="" data="" obtained="" from="" elisa,="" qrtpcr,="" and="" wnt="" inhibition="" experiments="" were="" analyzed="" with="" one-way="" anova="" followed="" by="" bonferroni="" posthoc="" test="" using="" spss="" statistics="" software.="" reverse="" transcription="" and="" quantitative="" rt-pcr="" (qrt-pcr)="" experiments="" were="" conducted="" as="" previously="" reported="" (kumar="" et="" al.,="" 2015).="" in="" more="" detail,="" 150-500="" ng="" of="" total="" rna="" from="" each="" sample="" (n="3" kidneys/genotype="" at="" the="" given="" stage)="" was="" treated="" with="" rnase-free="" dnase="" i="" (thermo="" fisher="" scientific).="" the="" reverse="" transcription="" reaction="" was="" performed="" with="" random="" hexamer="" primers="" and="" revertaid="" reverse="" transcriptase="" (thermo="" fisher="" scientific)="" immediately="" after="" inactivation="" of="" dnase="" i="" with="" 5="" mm="" edta="" at="" 65°c.="" complementary="" dna="" (cdna)="" was="" diluted="" 10×="" and="" stored="" at="" −20°c="" until="" qrt-pcr.="" for="" qrt-pcr,="" lightcycler="" 480="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" or="" bio-rad="" c1000="" touch="" thermal="" cycler="" upgraded="" to="" cfx384="" system="" (bio-rad),="" supplied="" with="" sybr="" green="" i="" master="" (roche)="" and="" 250="" pmol="" primers="" were="" loaded="" into="" the="" well="" of="" 384-well="" plates="" with="" a="" total="" volume="" of="" 10="" µl.="" negative="" control="" was="" always="" included="" in="" every="" reaction="" via="" setting="" conditions="" with="" minus-reverse="" transcription="" or="" water.="" a="" combination="" of="" pgk1,="" hprt,="" and="" gapdh="" was="" used="" as="" the="" reference="" genes="" in="" all="" the="" qrt-pcr="" experiments,="" except="" the="" one="" with="" p7.5="" kidneys,="" in="" which="" mouse="" actb="" as="" the="" reference="" gene.="" primer="" sequences="" can="" be="" found="" in="" table="">

Danksagungen Wir danken den Mitarbeitern der Biomedicum Imaging and Light Microscopy Units am Helsinki Institute of Life Sciences (HiLIFE) für ihre wertvolle Hilfe bei der Bildanalyse und quantifizierungsbezogenen Techniken. Die Wnt11-Mäuse wurden freundlicherweise von Professor Seppo Vainio (Universität Oulu, Finnland) zur Verfügung gestellt und an das Labortierzentrum von HiLIFE, Universität Helsinki geschickt