Wirksamkeit und Mechanismen einer Angelica Sinensis Cistanche-Faserverbindung zur Linderung von Verstopfung

Abstrakt:Verstopfungist eine weit verbreitete Krankheit, die die Lebensqualität der Menschen erheblich beeinträchtigen und einige damit verbundene Krankheitsrisiken erhöhen kann. In dieser Studie wurde ein Mausmodell mit achronischer Verstopfung unter Verwendung von Loperamidhydrochlorid etabliert. Den Mäusen wurde eine Angelica sinensis Cistanche-Faserverbindung, bestehend aus Dang Gui [Angelica sinensis (Oliv.) Diels], per Magensonde verabreicht.Rou Cong Rong (Cistanche deserticolaY.C.Ma), Weizenfaser und Xylan mit niedrigem Molekulargewicht in hoher Dosierung (3,6 g·kg-1, 30fache der empfohlenen menschlichen Dosis) und niedriger Dosierung (0,6 g·kg{{8}) }, das Fünffache der empfohlenen menschlichen Dosis) für 14 Tage. Die Studie bewertete die therapeutische Wirksamkeit der Verbindung durch Beobachtung der Stuhlmorphologie, Messung des Wassergehalts und Durchführung von Experimenten zur Dünndarmmotilität. Darüber hinaus wurden Enzymimmunoassays (ELISA) durchgeführt, um die Serumspiegel gastrointestinaler Hormone einschließlich Motilin (MTL), Gastrin (GAS), der Entzündungsfaktoren Interleukin-1 (IL-1) und Tumornekrosefaktor zu bewerten - (TNF- ). Eine histopathologische Untersuchung mit H&E-Färbung wurde eingesetzt, um die Schädigung des Dickdarmgewebes zu beurteilen. Darüber hinaus wurden Western-Blot- und immunhistochemische Experimente durchgeführt, um die Expressionsniveaus von Aquaporin-3 (AQP3) und c-Kit im Dickdarm zu untersuchen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Cistanche-Faserverbindung von Angelica sinensis die Kotmorphologie verbessern, den Kotwassergehalt erhöhen und die Dünndarmtransitraten bei Mäusen steigern kann. Darüber hinaus kam es zu einem deutlichen Anstieg der Serumspiegel der Magen-Darm-Hormone und zu einer deutlichen Verringerung der Entzündungsfaktoren. Die Verbesserung der histopathologischen Schädigung des Dickdarms ging mit einer deutlichen Abnahme der Expression des Dickdarmwasserkanalproteins AQP3 und einem signifikanten Anstieg der c-Kit-Expression einher. Diese Ergebnisse legen insgesamt das Vorliegen einer Dosis-Wirkungs-Beziehung nahe. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Angelicasinensis Cistanche-Faserverbindung Verstopfung bei Mäusen wirksam lindert. Seine Wirkung ist mit der Regulierung der Expression des Kolonwasserkanalproteins AQP3 und c-Kit sowie mit der Modulation von Entzündungsfaktoren im Serum und Magen-Darm-Hormonen verbunden. Dieses Experiment wurde von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Jinan genehmigt.

Schlüsselwörter:Verstopfung; Darmbefeuchtung und Linderung von Verstopfung; Functional Food; Doppelpunkt; Traditionelle Chinesische Medizin

WIE LANGE DAUERT ES, BIS CISTANCHE WIRKT?

Verstopfungist einhäufige Magen-Darm-Erkrankung. The global prevalence of constipation in the elderly (>60 Jahre alt) liegt bei 18,9 %[1], wobei die Prävalenz bei Frauen oft höher ist[2]. Es ist durch Schwierigkeiten beim Stuhlgang und häufige Verstopfung gekennzeichnet. Reduzierung und Verhärtung von Kot usw., was zu körperlichen Beschwerden und Magen-Darm-Funktionsstörungen führt und sogar Magen-Darm-Erkrankungen, Herz-Kreislauf-Erkrankungen [3] usw. hervorruft oder verschlimmert, was die Lebensqualität ernsthaft beeinträchtigt. Rezepte der traditionellen chinesischen Medizin werden häufig zur Linderung von Verstopfung eingesetzt und haben gute und eindeutige klinische Wirkungen [4,5]. Die in dieser Studie verwendete Faserverbindung aus Angelica und Cistanche deserticola wird aus Cistanche deserticola, Angelica sinensis, Weizenfasern und Xylooligosacchariden hergestellt. Cistanche deserticola und Angelica sinensis sind zwei häufig verwendete traditionelle chinesische Arzneimittel in Abführmitteln, die die Darmfunktion regulieren und Verstopfung lindern. [6-9], zwei traditionelle chinesische Arzneimittel haben in meinem Land denselben Ursprung wie Medizin und Lebensmittel. Ihre kombinierte Anwendung kann den Effekt der Wiederauffüllung von Qi und Blut sowie der Harmonisierung von Yin und Yang erzielen. Weizenfasern sind reich an unlöslichen und löslichen Ballaststoffen, die die Darmperistaltik und den Stuhlgang fördern können und häufig als Hilfsmittel zur Behandlung von Verstopfung eingesetzt werden. Xylo-Oligosaccharid ist ein funktionelles Oligosaccharid, das die Darmflora regulieren und dadurch die Darmmotilität stimulieren kann. , erhöhen Sie die Feuchtigkeit des Kots [10], kombinieren Sie die vier Geschmacksrichtungen und behandeln Sie die Grundursache der Krankheit. Ziel dieser Studie war es, die Wirksamkeit dieser Angelika- und Cistanche-Deserticola-Faserverbindung bei verstopften Mäusen zu bewerten und ihren möglichen Wirkmechanismus zu untersuchen.

Materialen und Methoden

Versuchstiere: 40 männliche Kunming-Mäuse der spezifisch pathogenfreien (SPF) Qualität, 4 bis 5 Wochen alt, wurden von Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd., Lizenznummer SCXK (Guangdong) 2021-0011, gekauft Die Umgebungstemperatur beträgt 22 ± 2 Grad, die Luftfeuchtigkeit 50 % ± 10 % und der Tag- und Nachtzyklus beträgt 12 h/12 ​​h. Die Versuchsprotokolle und -verfahren entsprachen den ethischen Grundsätzen der Tiernutzung und -pflege und wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Jinan genehmigt.

Die Testsubstanz: Angelica sinensis und Cistanche deserticola Faserverbundpräparat wird aus Angelica Sinensis und Cistanche deserticola hergestellt, die mit Wasser extrahiert, konzentriert, getrocknet und zerkleinert werden, um ein trockenes Pastenpulver zu erhalten (die Pastenausbeute beträgt 52,95 %). Das trockene Pastenpulver wird zur späteren Verwendung mit Weizenfasern und Xylo-Oligosaccharid vermischt. Angelica sinensis (Chargennummer 230404CP108) und Cistanche deserticola (Chargennummer 230303CP109) wurden von Hebei Wanxiu Pharmaceutical Co., Ltd. gekauft und auf Konformität mit der Ausgabe 2020 des Chinesischen Arzneibuchs getestet. Xylo-Oligosaccharide wurden von Shandong Bailong Chuangyuan Biotechnology Co., Ltd. gekauft. Die Chargennummer lautet 20210829026 und die Inspektion entspricht GB/T35545; Die Weizenfaser stammt von J. Rettenmaier & Söhne GmbH + Co KG und die Chargennummer ist 07501230126. Basierend auf einem 60 kg schweren Erwachsenen beträgt die empfohlene Dosierung der Angelika- und Cistanche-Faserverbindung für den Menschen 7,118 g·d-1 , davon beträgt die Dosierung an Weizenfaser 3,5g·d-1. Die Verträglichkeit dieser Verbindung ist Angelika: Cistanche: Weizenfaser: Xylooligosaccharide=2:2:3:2 (die Dosierung der Abkochstücke richtet sich nach der Rohdroge). Nehmen Sie als Gruppe mit hoher Dosis das 30-fache der empfohlenen Dosierung für den Menschen und als Gruppe mit der niedrigen Dosis das Fünffache der empfohlenen Dosierung für den Menschen ein, also 3,6 bzw. 0,6 g·kg-1·d-1. Bereiten Sie eine Suspension mit reinem Wasser vor, mischen Sie sie gut und stellen Sie sie beiseite.

Medikamente und Reagenzien Loperamidhydrochlorid (Loperamid, LOP), Spezifikationen: Jede Tablette enthält Loperamidhydrochlorid

Amin 2 mg, 12 Kapseln/Karton, Produktchargennummer: MIJ3102, gekauft von Xi'an Janssen Pharmaceutical Co., Ltd.; Mosapridcitrat-Tabletten (Quali), Spezifikationen: Jede Tablette enthält 5 mg Mosapridcitrat, 24 Tabletten/Karton, Produktchargennummer: 25220603, gekauft von Lunan Beite Pharmaceutical Co., Ltd.; Aktivkohlepulver, Spezifikation: 200 Mesh braunes Pulver, Chargennummer A805337, gekauft von Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.; Gummi arabicum, Spezifikation: Pulver, Chargennummer A108975, gekauft von Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.

Absolutes Ethanol (Tianjin Damao Chemical Reagent Factory, 64-17-5); Ammoniumpersulfat (Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd., A6295-500g); Tris-Base (FD2010), 5× Ladepuffer (FD002), -Actin-Antikörper (FD0060), Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (FDR007), Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (FDM007) und ECL-Farbentwicklungskit (FD8020) wurden alle von Hangzhou Fude Biotechnology Co., Ltd. gekauft; RIPA-Lysepuffer (Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd., P0013B); 4 % Paraformaldehyd (Biosharp Company, BL539A); Immunhistochemie-Kit (Jiangsu KGI Biotechnology Co., Ltd., KGOS60); Bicinchoninsäure (BCA) Proteinquantifizierungskit (Thermo Fisher Scientific, SLZ60212); Motilin (MTL), Gastrin (GAS) und Entzündungsfaktoren Interleukin-1 (IL-1), Tumornekrosefaktor (Tumornekrosefaktor-, TNF-) ELISA-Kit (Shanghai Enzyme Biotechnology Co., Ltd ., YJ201829, YJ037432, YJ002095, YJ301814); Aquaporin 3 (Aquaporin 3, AQP3)-Antikörper (Affinity Company, AF5222); c-Kit-Antikörper (Cell Signaling Technology, 3074S).

Instrument: Reinstwassermessgerät (Millipore Company, USA, Milli Q); Elektronische Waage (Sartorius, Deutschland)

Das Unternehmen, BS224S); Elektronische Analysenwaage (Shanghai Benpu Instrument Technology Co., Ltd., FA2204N); Hochgeschwindigkeits-Kühlzentrifuge (Sigma Company, Deutschland, 3K15); Mikroplattenlesegerät (Thermo Company, USA, Multiskan Mk 3); Paraffin-Mikrotom (Leica, Deutschland) Company, RM2255); Metallbad mit konstanter Temperatur (Shanghai Yiheng Technology Co., Ltd., TU-100C); Vollautomatischer Proben-Schnellzerkleinerer (Shanghai Jingxin Technology Co., Ltd., JXFSTPRP-24); Elektrophoresegerät (Beijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd., DYY-6C); Rastermikroskop (Precipoint Company, Precipoint M8); Chemilumineszenz-Bildgebungssystem (Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd., Tanon 5200).

Gruppierung und Modellbildung: 40 Mäuse wurden 5 Tage lang adaptiv aufgezogen und dann zufällig in negative Kontrollgruppen aufgeteilt.

(Kontrolle), Modellgruppe (LOP), zusammengesetzte Hoch- und Niedrigdosisgruppen (LOP+PF-H, OP+PF-L), Positivkontrollgruppe (Mosapridcitrat, LOP+MOS). Jeden Tag zwischen 9 und 10 Uhr morgens erhielten alle Gruppen mit Ausnahme der Negativkontrollgruppe 10 mg·kg-1 Loperamidhydrochlorid per Sonde, um ein Maus-Verstopfungsmodell zu etablieren, und die Negativkontrollgruppe erhielt eine gleiche Menge reines Wasser durch Sondenernährung. Nach 14 bis 15 Stunden erhielten die Gruppen mit hoher und niedriger Dosis der Verbindung 3,6 bzw. 0,6 g·kg-1, und die positive Kontrollgruppe erhielt 5 mg·kg{{ 19}}.

, der Negativkontrollgruppe und der Modellkontrollgruppe wurden 14 aufeinanderfolgende Tage lang gleiche Mengen reines Wasser per Magensonde verabreicht.

Der Status und die Koteigenschaften von Mäusen wurden während der Arzneimittelinterventionsperiode beobachtet und aufgezeichnet. Der Grundzustand und der Kot der Mäuse in jeder Gruppe wurden aufgezeichnet.

Charaktere dreimal pro Woche wiegen und Dosierung anpassen. An den Tagen 3, 7, 10 und 14 nach der Verabreichung wurden von jeder Maus 3 bis 4 Pellets frischen Kots gesammelt, sofort gewogen und als Nassgewicht aufgezeichnet, in einem Ofen getrocknet und als Trockengewicht sowie die Kotfeuchtigkeit aufgezeichnet Der Inhalt wurde berechnet. Berechnen Sie den Feuchtigkeitsgehalt des Stuhls (%)=(Nassgewicht − Trockengewicht)/Nassgewicht × 100 %.

Die Bestimmung der Dünndarm-Antriebsfunktion erfolgte nach den experimentellen Methoden, die in der Referenzliteratur [11] und in „Methods for Testing and Evaluation of Functional Functions of Health Foods (2023 Edition)“ gefordert werden. Nach der letzten Dosis wurden die Mäuse jeder Gruppe 16 Stunden lang nüchtern und ohne Wasser behandelt. Modellgruppe, Verbindungsformel Den Hoch- und Niedrigdosisgruppen sowie der Positivkontrollgruppe wurde Loperamidhydrochlorid-Suspension (10 mg·kg-1) per Magensonde verabreicht, und die Negativkontrollgruppe erhielt eine gleiche Menge reines Wasser durch Sondenernährung. 0.5 Stunden später erhielten die Gruppen mit hoher und niedriger Dosis der Verbindung und die positive Kontrollgruppe Tinte (enthaltend 5 %), die die entsprechenden Testprobendosen enthielt (3,6 g·kg-1, 0,6 g·kg-1 bzw. 5 mg·kg-1). (Aktivkohlepulver, 10 % Gummi arabicum) und gleiche Mengen Tinte wurden der Negativ- und der Modellgruppe verabreicht. Die Tiere wurden unmittelbar nach 0,5 Stunden durch Genickbruch getötet und die „Gesamtlänge des Dünndarms“ und die „Tintenvorschublänge“ gemessen. Berechnen Sie die Tintenvorschubgeschwindigkeit=Tintenvorschublänge (cm)/Gesamtlänge des Dünndarms (cm) × 100 %.

Um die Konzentrationen von MTL, GAS, TNF- und IL-1 im Serum zu ermitteln, wurde Blut aus den Augäpfeln der Mäuse entnommen und bei 4 Grad zentrifugiert, 3 500 r·min-1 für Nach ca. 10 Minuten wurde das Oberserum entnommen und MTL und GAS im Mäuseserum gemäß ELISA-Kit bestimmt. und TNF-, IL-1-Spiegel.

H&E erkennt pathologische Veränderungen im Dickdarmgewebe. Der Dickdarm von Mäusen wird mit normaler Kochsalzlösung gewaschen und in 4 % Paraformaldehyd inkubiert.

Sie wurden in Aldehyd fixiert, routinemäßig nach 24 Stunden eingebettet, geschnitten, gebacken und H&E-gefärbt, und die pathologischen Veränderungen des Dickdarmgewebes wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet.

Die immunhistochemische Methode wurde verwendet, um die Expression von AQP3 und c-Kit im Dickdarmgewebe nachzuweisen. Es wurden Dickdarmgewebe von Mäusen jeder Gruppe gesammelt.

Paraffinschnitte, Entparaffinierung, Hydratation, Antigengewinnung, Blockierung der endogenen Katalase, Blockierung mit 2 % Ziegenserum, Zugabe von AQP3- bzw. c-Kit-Antikörpern und Inkubation über Nacht bei 4 Grad (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS) für 5 Minuten, Hämatoxylin-Gegenfärbung, Gradient Ethanol-Dehydrierung, Xylol-Transparenz, neutrale Gummiversiegelung, Scannen unter einem Rastermikroskop und Verwendung der Image J-Software zur Analyse der Ergebnisse.

Die Western-Blot-Methode wurde verwendet, um die Expression von AQP3 und c-Kit im Dickdarmgewebe nachzuweisen. Nehmen Sie 10 mg gefrorenes Dickdarmgewebe der Maus und legen Sie es in ein Zentrifugenröhrchen mit 150 l RIPA-Lysepuffer, der 1 % Proteaseinhibitor enthält. Verwenden Sie einen Schnellzerkleinerer, um das Gewebe zu homogenisieren. , Zentrifugieren Sie das Homogenat mit einer Niedertemperaturzentrifuge bei 10 000 r·min-1 für 10 Minuten, nehmen Sie den Überstand, bestimmen Sie die Proteinkonzentration durch die BCA-Proteinquantifizierungsmethode, mischen Sie es mit dem Ladepuffer, denaturieren das Protein und analysieren Sie die Ergebnisse für jede Probe. 30 ug Protein wurden geladen, einer SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, nass auf die Membran übertragen und dann 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur mit 5 % Magermilchpulver blockiert, dreimal mit TBST gewaschen, der primäre Antikörper auf einen Schüttler gegeben und über Nacht inkubiert 4 Grad, dann entfernt und mit TBST-Puffer gewaschen. Dreimal mit Lösung waschen, mit sekundärem Antikörper 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren und dann dreimal mit TBST waschen. Für die Farbentwicklung wird eine ECL-Chemilumineszenz-Arbeitslösung und für die Entwicklung ein vollautomatisches Chemilumineszenz-Bildgebungssystem verwendet. Zur Analyse der Ergebnisse wird die Software Image J verwendet.

Statistische Methoden Alle an diesem Experiment beteiligten Daten werden in Form eines Mittelwerts ± Standardabweichung ausgedrückt. GraphPad Prism wurde verwendet, um experimentelle Daten darzustellen, und der Vergleich zwischen Gruppen wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA oder einer zweifaktoriellen ANOVA durchgeführt; Wenn die Unterschiede zwischen den Gruppen statistisch signifikant waren, wurde die Methode des geringsten signifikanten Unterschieds (LSD) verwendet. ) Führen Sie paarweise Vergleiche zwischen Gruppen durch, und P < 0.05 wird als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.