Verbesserung der Top-Down-Proteomik von Hirngewebe mit FAIMS Teil 4

Wir haben auch zahlreiche Fragmente identifiziert, die von nicht-kanonischen Spleiß-Isoformen des Tauproteins stammen, von denen bekannt ist, dass sie im menschlichen Gehirn exprimiert werden.83 Kurz gesagt, Tau-Isoformen werden durch die Anzahl der N-terminalen Insertionen aufgrund des alternativen Spleißens von Exon 2 und/oder 3 definiert (siehe zu 0N, 1N und 2N) und die Anzahl der Mikrotubuli-bindenden Wiederholungen aufgrund des alternativen Spleißens von Exon 10 (bezeichnet als 3R ​​oder 4R).84

Tau-Protein ist ein wichtiges Protein in neuronalen Zellen, das eine sehr wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der normalen Struktur und Funktion neuronaler Zellen spielt. Studien haben gezeigt, dass Tau-Protein eng mit dem Gedächtnis zusammenhängt und seine abnormale Expression zu einem kognitiven Rückgang und sogar zu einer kognitiven Beeinträchtigung führen kann.

Wissenschaftler haben viel über den Zusammenhang zwischen Tau-Protein und Gedächtnis geforscht. Untersuchungen zufolge kann Tau-Protein dabei helfen, die Stabilität von Nervenfasern zu regulieren und dadurch die Informationsübertragung und Gedächtnisbildung zwischen neuronalen Zellen zu fördern. Sobald jedoch das Tau-Protein abnormal ist, beispielsweise eine Proteinansammlung, führt dies zum Bruch von Nervenfasern und zum Absterben einer großen Anzahl neuronaler Zellen, was die Bildung und Aufrechterhaltung des Gedächtnisses beeinträchtigt und sogar zu Gedächtnisstörungen führt. Daher ist die Aufrechterhaltung der normalen Expression und Funktion des Tau-Proteins für die Erhaltung der Gesundheit des Gedächtnisses sehr wichtig.

Aktuelle Studien haben außerdem ergeben, dass die in einigen Lebensmitteln und Getränken enthaltenen Nährstoffe auch für die Aufrechterhaltung der normalen Funktion des Tau-Proteins von Vorteil sind. Beispielsweise können Antioxidantien, Omega-3-Fettsäuren sowie koffeinreiches Gemüse und Obst dazu beitragen, die Expression und Funktion des Tau-Proteins zu regulieren, was zur Verbesserung des Gedächtnisses und der kognitiven Funktion beiträgt.

Daher sollten wir darauf achten, gute Lebensgewohnheiten beizubehalten, die Ernährung zu kontrollieren, Stress zu reduzieren usw., um die normale Expression und Funktion des Tau-Proteins aufrechtzuerhalten. Gleichzeitig können die Aufrechterhaltung guter Lerngewohnheiten und moderate körperliche Betätigung auch dazu beitragen, die Informationsübertragung und die Gedächtnisbildung zwischen neuronalen Zellen zu fördern. Ich glaube, solange wir auf einen gesunden Lebensstil achten, können wir ein gesundes Gedächtnis haben und das Leben besser genießen. Dies zeigt, dass wir unser Gedächtnis verbessern müssen. Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen ist, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Cistanche beruht auf den verschiedenen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf verschiedene Weise fördern.

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Es ist auch erwähnenswert, dass endogene Tau-Fragmente im menschlichen Gehirngewebe und in der Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit häufig vorkommen und dass eine unterschiedliche Fragmentierung von Tau beim Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit eine Rolle spielen könnte.85,86

Wir beobachteten mehrere Fragmente, die {{0}}N und 1N Tau eindeutig unterscheiden konnten (Abbildungen 10A, S7 und S8). Die Tatsache, dass wir hohe Spektralzahlen für 0N (86 PrSMs) und 1N (91 PrSMs), aber keine PrSMs für 2N beobachten, steht im Einklang mit früheren quantitativen Immunoblots, bei denen festgestellt wurde, dass 0N und 1N die dominanten Formen sind und ∼ ergeben 91 % des gesamten Tau, während 2N nur etwa 9 % ausmachte.87

Bezüglich der eindeutigen Zuordnung der Mikrotubuli-bindenden Wiederholungen beobachteten wir Spektren, die sowohl 3R- (Abbildungen 10A und S9) als auch 4R-Tau (Abbildungen 10A und S10) zugeordnet werden konnten.

Sparsame Schlussfolgerungen erlaubten uns den Schluss, dass Braintau hauptsächlich durch die Mischung von 1N3R (Tau-B) gefolgt von 0N4R (Tau-D)-Spleißvarianten repräsentiert wird, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt.87,88

Während andere Spleißisoformen ebenfalls einzigartige Fragmente hatten, ist die geringe Anzahl spektraler Übereinstimmungen (<4) did not allow us to confidently conclude about their existence.

Überraschenderweise sind die N-Termini der vorherrschenden R-Domänen enthaltenden Fragmente eine Fortsetzung der C-Termini der vorherrschenden N-Domänen enthaltenden Fragmente, oder mit anderen Worten, sie scheinen verknüpfte Fragmente zu sein, die aus einem möglichen proteolytischen Spaltungsereignis (bezeichnet als) entstanden sind Seite Nr. 1 in Abbildung 10A). Darüber hinaus teilen sich die C-Termini der 3R- und 4R-Domänen enthaltenden Proteoformen dieselbe Spaltungsstelle (in Abbildung 10A als Stelle Nr. 2 bezeichnet), obwohl die Sequenzen selbst aufgrund der Spleißvariation von Exon 10 unterschiedlich sind.

Noch überraschender ist, dass alle diese Spaltungsstellen innerhalb von drei gut beschriebenen Hexapeptidmotiven liegen.89–95 Abbildung 10B zeigt alle einzigartigen Fragmente, die wir aus unseren Datensätzen identifiziert haben und die der 1N3R-Tau-Isoform zugeordnet werden konnten, sowie den Ort der Spaltung Websites.

Spaltstelle Nr. 1 liegt innerhalb der zweiten prolinreichen Region von Tau, die die KVAVVR-Hexapeptidsequenz teilt und eine der stärksten Bindungsstellen für Mikrotubuli bereitstellt (Abbildung 10B).89–91 Spaltstelle Nr. 2 liegt innerhalb der 3R- und 4R-Hexapeptidmotive VQIVYK und VQIINK, die nachweislich die Tau-Aggregation vorantreiben (Abbildung 10B).92–95

Interessanterweise beginnen oder enden viele der Fragmente, wie in Abbildung 10B gezeigt, in der Nähe dieser beiden Spaltungsstellen. Es ist bekannt, dass jedes dieser Hexapeptidmotive eine -Struktur bildet, oft in Form von -Haarnadeln, die der Aggregation bei verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen zugrunde liegen.89,93,96 Interessanterweise verdeutlichen diese Beobachtungen die Möglichkeit eines gemeinsamen proteolytischen Abbauwegs zwischen Tau-Isoformen in der Lage, ihre Aggregations-Seeding-Regionen zu stören.25,85,86

Schließlich fanden wir zahlreiche spektrale Übereinstimmungen für A, die ausschließlich mit FAIMS beobachtet werden konnten.

Diese A-Proteoformen, die aufgrund ihrer hydrophoben und zur Aggregation neigenden Eigenschaften typischerweise spezielle Fraktionierungs- oder Handhabungstechniken erfordern, um die Gewinnung zu verbessern,9,16,97,98 wurden mit FAIMS im Bereich von –40 bis –50 CV intakt beobachtet.

Dazu gehören die kanonischen Formen A 1–42 und A 1–40 (Abbildung 11A bzw. B) sowie mehrere N-terminal verkürzte Formen (insbesondere A 2–42 und A 4–42, Abbildung 11C, D).

Es ist erwähnenswert, dass A-Proteoformen mit verschiedenen N- und C-terminalen Spaltungen aufgrund der extremen Hydrophobizität der tryptischen Produkte in Bottom-up-Analysen bekanntermaßen schwer zu identifizieren sind, was einen Vorteil der Analyse intakter Proteine ​​hervorhebt.

Wir glauben, dass die FAIMS-TDP-Methodik eine robuste Möglichkeit zur vollständigen Identifizierung dieser A-Proteoformen bietet und eine einfache Bestimmung der verschiedenen vorhandenen Kombinationen von N- und C-terminalen Spaltprodukten ermöglicht.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

Wir haben beschrieben, wie die Nano-LC-Umkehrphasentrennung einer hochkomplexen Probe, die Proteine ​​über einen weiten Massenbereich enthält, von der Implementierung der Gasphasenfraktionierung durch FAIMS im Kontext der Top-Down-Massenspektrometrie profitieren kann.

Es wurde gezeigt, dass FAIMS die Übertragung von Proteoformen nach Größe und/oder Ladung beeinflusst, wodurch die MS1-Komplexität verringert und eine größere Abdeckungstiefe des Proteoms ermöglicht wird.

FAIMS bei einem einzigen CV (−50) ermöglichte die Identifizierung von durchschnittlich 1833 ± 17 einzigartigen Proteoformen, mehr als doppelt so viel im Vergleich zu ohne FAIMS (754 ± 35). Die Zugabe von FAIMS führte nicht zu einer Verschlechterung der Reproduzierbarkeit der Quantifizierung und blieb bei nahezu 20 % RSD, was mit markierungsfreien Bottom-up-Ansätzen vergleichbar ist.

Es wurde festgestellt, dass eine Verringerung des CV von FAIMS die Molekülmasse der an das Instrument übertragenen Ionenspezies erhöht (mittleres MW von ∼5 kDa bei –50 CV gegenüber ∼15 kDa bei –20 CV), und es wurde auch beobachtet, dass eine Modulation des CV die Übertragung von beeinflusst die Ladungszustandshüllkurve einer Proteoform unterschiedlich.

Wir haben auch optimale Kombinationen von CVs definiert, die das größte theoretische Maximum an Proteoformen/Genen oder Proteomsequenzabdeckung erzeugen könnten. Im Vergleich zu den drei „No FAIMS“-Datensätzen könnte ein externer CV-Schritt bei –50, –40 und –30 V die Anzahl einzigartiger Proteoformen, einzigartiger Gene und die Abdeckung der Proteomsequenzen mehr als verdoppeln.

Es ist auch erwähnenswert, dass unsere Arbeit nur einen relativ kleinen CV-Bereich untersuchte, was unserer Meinung nach für unseren TDP-Ansatz unter Verwendung einer komplexen Stichprobe am besten geeignet war. Da FAIMS leicht an andere Methoden angepasst werden kann, können MS1-Analysen mit niedriger Auflösung mit Orbitrap-Analysegeräten möglicherweise die Identifizierung größerer Proteoformen innerhalb des von uns getesteten CV-Bereichs sowie über –20 V verbessern, wo wahrscheinlich größere Proteoformen beobachtet würden.

Man kann sich auch vorstellen, dass zukünftige Massenanalysatorinstrumente, die die Erfassung größerer Proteoformen verbessern und mit FAIMS kompatibel sind, von der Untersuchung von CVs unter –20 bis in den positiven Spannungsbereich profitieren könnten.

Unser TDP-Workflow ermöglichte es uns, einzigartige Proteoformen zu identifizieren und zu charakterisieren, die von Genen mit bekannter Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen abgeleitet sind.

Dazu gehörte die Bestimmung der Zusammensetzung einer unbekannten Massenverschiebung in der Nähe der Eisenbindungsdomäne von -Synuclein, die dazu diente, die Positionen potenzieller Eisenbindungsdomänen in - und Synuclein zu bestimmen. Es wurde auch festgestellt, dass PARK7 an seinem Cys-Rest im aktiven Zentrum mit einer Succinylgruppe modifiziert ist.

Wir waren in der Lage, Tau-Fragmente, die 0N-, 1N-, 3R- und 4R-Spleißvarianten-Isoformen entsprechen, eindeutig einzeln zu unterscheiden und neue proteolytische Spaltstellen zu beschreiben, die sich innerhalb oder in der Nähe mehrerer aggregationsbildender Hexapeptidwiederholungen befinden.

Schließlich ermöglichte FAIMS die Identifizierung mehrerer intakter A-Proteoformen, einschließlich der zur Aggregation neigenden A 1–42, ohne dass komplexe Fraktionierungs- oder Reinigungstechniken erforderlich waren.

Zusammenfassend glauben wir, dass die Hinzufügung von FAIMS zur Entdeckung von TDP eine robuste und reproduzierbare Methode zur Vergrößerung des für den Nachweis und die Charakterisierung verfügbaren Proteoms bereitstellen wird.

Ergänzendes Material

Ergänzendes Material finden Sie in der Webversion auf PubMed Central.

DANKSAGUNGEN

Die Autoren danken Tao Liu und Richard Smith für ihre Ratschläge und hilfreichen Diskussionen.

Diese Arbeit wurde von U01 AG061356 (PLDJ) und R01 AG015819 (DAB) unterstützt. Ein Teil der Forschung wurde mit EMSL (grid.436923.9) durchgeführt, einer Benutzereinrichtung des DOE Office of Science, die vom Biological and Environmental Research-Programm gesponsert wird. Grafische Zusammenfassungen und Bildelemente in Abbildung 1 wurden mit Biorender.com erstellt.

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