Neuroprotektive Vorteile von Bewegung und MitoQ auf Gedächtnisfunktion, mitochondriale Dynamik, oxidativen Stress und Neuroinflammation bei D-Galactose-induzierten alternden Ratten Teil 2
Sep 02, 2024
2.6. Gewebevorbereitung
Nach Abschluss von 8 Wochen TE- und Gedächtnisverhaltenstests wurden alle Ratten durch CO2-Inhalation eingeschläfert und Gehirngewebe wurde von 7 Tieren in jeder Behandlungsgruppe entnommen.
Der Gedächtnisverhaltenstest ist ein wirksames Instrument zur Bewertung des Gedächtnisses. Mit zunehmendem sozialen und beruflichen Druck wird das Gedächtnis der Menschen immer wichtiger. Daher kann uns die Durchführung eines Gedächtnistests helfen, unser Gedächtnisniveau zu verstehen und anhand der Testergebnisse wirksame Maßnahmen zur Verbesserung und Aufrechterhaltung unseres Gedächtnisses zu ergreifen.
Insbesondere können Gedächtnisverhaltenstests die Fähigkeit von Menschen bewerten, Informationen zu empfangen, zu verarbeiten, zu speichern und abzurufen. Durch das Testen verschiedener Arten von Informationen wie Sprache, Zahlen, Bilder usw. kann das Gedächtnis von Menschen vollständig getestet werden. Die Testergebnisse liefern verschiedene Ergebnisse, die uns helfen, unsere Schwächen und Stärken zu verstehen und unser Gedächtnis zu stärken.
In der Praxis liefern viele Gedächtnisverhaltenstests auch professionelle Tipps und Anregungen. Beispielsweise tragen guter Schlaf, eine ausgewogene Ernährung, ausreichend Bewegung und regelmäßige Gehirnübungen zur Verbesserung des Gedächtnisses bei. Durch diese Methoden können wir unsere Erinnerungszeit, unsere Gedächtnisreproduktionsfähigkeit und andere Aspekte verbessern, um uns besser an das tägliche Leben oder die Arbeitsanforderungen anzupassen.
Kurz gesagt, ein Gedächtnistest ist sehr nützlich, um das eigene Gedächtnis zu verstehen, zu bewerten und zu verbessern. Wir sollten auch geeignete Methoden anwenden, um unser Gedächtnis entsprechend unserer tatsächlichen Situation zu stärken und eine solide Grundlage für ein erfüllteres und reicheres Leben zu legen. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche ein traditionelles chinesisches Arzneimittel mit vielen einzigartigen Wirkungen ist, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirkung von Cistanche beruht auf den verschiedenen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf verschiedene Weise fördern.
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Nach der Trennung der Großhirnrinde und des Hippocampus wurde das Hirngewebe in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Analyse bei –80 °C gelagert. Die restlichen 5 Tiere wurden für die immunhistochemische (IHC) Analyse verwendet.
Nach dem Öffnen der Brusthöhle wurde 10 Minuten lang 50 mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch den linken Ventrikel geleitet und anschließend wurde das Tier mit 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 100 mM PBS perfundiert.
Nach der Perfusionsfixierung wurde das Gehirn entnommen, in 4 % PFA gegeben und 4 Stunden lang bei 4 °C fixiert. Das fixierte Gehirngewebe wurde 2 Tage lang in 30 % Saccharoselösung getaucht und dann mit einem Kryostat in 40 µm dicke Scheiben geschnitten ( Leica Microsystems, Nußloch, Deutschland).
2.7. Mitochondrien-Isolierung
Zur Isolierung der Mitochondrien verwendeten wir ein Mitochondria Extraction Kit (IMGENEX Corporation, San Diego, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Pro 100 mg Hippocampusgewebe wurde 1 ml Homogenisierungspuffer hinzugefügt.
Nach der Homogenisierung wurde das Gewebe 10 Minuten lang bei 4 °C und 900 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und erneut 30 Minuten lang bei 4 °C und 15,{4} × g zentrifugiert.
Aus der zentrifugierten Zytosolfraktion wurde das Zytosol abgetrennt und das verbleibende Pellet gründlich in 1 ml Suspensionspuffer gemischt, bevor es 10 Minuten lang bei 4 °C und 15,{2}× g zentrifugiert wurde.
Der Überstand wurde entfernt und noch einmal 1 ml Suspensionspuffer hinzugefügt, bevor gründlich gemischt und erneut bei 15,000× g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugiert wurde.
Der Überstand wurde entfernt und das verbleibende Pellet wurde 30 Minuten lang bei 4 °C in 1 ml Puffer für die vollständige mitochondriale Lyse gelöst. Der Mitochondrienextrakt wurde dann 5 Minuten lang bei 15,000× g bei 4◦C zentrifugiert und der Überstand (Mitochondrienfraktion) gesammelt.
2.8. Western Blot
Das durch mitochondriale Isolierung erhaltene Gesamtprotein wurde mit der Bradford-Methode quantifiziert. Eine gleiche Menge mitochondrialer Proteine (30 µg pro Spur) wurde auf eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) geladen (8 % oder 12 %).
Nach der Elektrophorese wurden die Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran (Millipore, Boston, MA, USA) übertragen.
Die Blockierung wurde 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1×Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBS-T)-Lösung mit 5 % BSA durchgeführt, und dann wurde die Membran über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern zur Reaktion gebracht.
Die folgenden Primärantikörper wurden verwendet: Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p22 phox, p47 phox, gp91phox, SOD-2, Katalase und -actin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA, Verdünnung: 1). :1000); und TNF- (Abcam, Cambridge, UK, Verdünnung: 1:1000).
Anschließend wurden die Membranen mit einem Waschpuffer (PBS mit 0,1 % Tween 20) gewaschen und anschließend mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörpern für p22 phox, gp91 phox und TNF inkubiert - (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA, Verdünnung: 1:5000).
HRP-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper wurden für Mfn1, Mfn2, Opa1, Drp1, Fis1, p47 phox, SOD-2, Katalase und -Actin (Santa Cruz Biotechnology, Verdünnung: 1:5000) verwendet.
Die Proteinexpressionsniveaus wurden mit dem ECL-Western-Blot-Nachweissystem (Santa Cruz Biotechnology) nachgewiesen. Die Dichten der entwickelten Proteinbanden wurden mit dem Gelbildgebungssystem ChemiDoc XRS (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) analysiert.
2.9. Immunhistochemie (IHC)
Für die IHC-Analyse wurde die Free-Floating-Methode für das ausgewählte Gewebe in jeder Behandlungsgruppe verwendet. Nach dreimaligem Waschen des Gewebes für jeweils 1 0 Minuten in 0,01 M PBS wurde das Gewebe 60 Minuten lang bei 80 °C in einem Becherglas mit 0,01 M Natriumcitrat inkubiert und anschließend in 10 %iger Lösung blockiert. normales Eselserum (Millipore Sigma, Burlington, MA, USA).
Die Gewebeprobe wurde dann mit Primärantikörpern Anti-p22 phox (Santa Cruz Biotechnology, Verdünnung: 1:500) und Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) (Abcam, Verdünnung: 1:500) für 12 Minuten umgesetzt h bei 4 ◦C. Am folgenden Tag wurde das Gewebe dreimal jeweils 5 Minuten lang in 0,01 M PBS gewaschen und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit HRP-konjugiertem Ziegen-Anti-Maus-Sekundärantikörper (Santa Cruz Biotechnology, Verdünnung: 1:5000) umgesetzt.
Schließlich wurde das Gewebe bei Raumtemperatur unter Verwendung einer Lösung des Vectastain-Elite ABC-Kits (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) inkubiert und die Ergebnisse wurden unter Verwendung des DABPeroxidase Substrate Kit (Vector Laboratories) sichtbar gemacht.
Jeder Gewebeschnitt wurde mit einem Eindeckmedium (Vector Laboratories) auf einen Objektträger montiert und mit einem Lichtmikroskop (Leica Microsystems) untersucht.
2.10. Statistische Analysen
Die Daten wurden mit SPSS für Windows Version 18 analysiert.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle Werte werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA bestimmt. Bonferroni-Post-hoc-Tests wurden für mehrere Vergleiche verwendet. Unterschiede wurden bei p < 0.05 als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. Auswirkungen von Laufbandübungen und MitoQ auf die Expression mitochondrialer Dynamik-bezogener Proteine im Hippocampus von D-Gal-induzierten alternden Ratten
Wir haben bestätigt, dass TE und MitoQ die mitochondrialen Fusionsfaktoren (Mfn1, Mfn2, Opa1) und Spaltungsfaktoren (Drp1, Fis1) im Hippocampus alternder Ratten beeinflussen (Abbildung 1).
Die Expressionsniveaus der mitochondrialen Fusionsfaktoren unterschieden sich signifikant zwischen den Behandlungsgruppen (Mfn1, F4, 34=134.750, p < 0.001; Mfn2, F4, 34=80. 816, p < 0,001;Opa1, F4,34=51.456, p=0.001).
Die Expressionsniveaus der mitochondrialen Spaltungsfaktoren unterschieden sich ebenfalls signifikant zwischen den Behandlungsgruppen (Drp1, F4,34=53.448, p < 0.001; Fis1,F4,34=116 .313, p < 0,001). Die Post-hoc-Testergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt.
Im Vergleich zur Y-CON-Gruppe nahm die Expression mitochondrialer Fusionsfaktoren in der D-CON-Gruppe ab und zeigte steigende Tendenzen in den D-TE-, D-MI- und D-COMBI-Gruppen.
Andererseits erhöhte sich die Expression des mitochondrialen Spaltungsfaktors Drp1 in der D-CON-Gruppe im Vergleich zur Y-CON-Gruppe. Während die mitochondrialen Spaltungssignale durch die Kombinationsbehandlung mit TE verringert wurden, führte die Behandlung mit MitoQ allein nicht zu einer signifikanten Veränderung.
Der andere mitochondriale Spaltungsfaktor, Fis1, zeigte die gleichen abnehmenden Trends wie Drp1, wurde aber auch durch die MitoQ-Behandlung allein verringert.
Abbildung 1. Wirkung von Laufbandübungen und Mitoquinon (MitoQ) auf die Expression mitochondrialer Dynamik-bezogener Proteine im Hippocampus von durch D-Galactose (D-Gal) induzierten alternden Ratten. (A) Repräsentative Western Blots von mitochondrialen Fusions- und Spaltungsproteinen. (B–F) Densitometrische Analyse der auf -Actin normalisierten Western-Blot-Banden. Die im Western Blot gezeigten Daten sind Mittelwerte aus sieben Rattengehirnen.
-Actin wurde als interne Kontrolle untersucht. Nach der ANOVA wurde der Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.
a Bezeichnet den statistischen Unterschied zur Gruppe der jungen Kontrollgruppe (Y-CON). b Bezeichnet den statistischen Unterschied zur D-Galactose-Gruppe (D-CON). c Bezeichnet den statistischen Unterschied zur Gruppe D-Galaktose plus Laufbandtraining (D-TE).
d Bezeichnet den statistischen Unterschied zur D-Galactose plus MitoQ (D-MI)-Gruppe (p < 0.05). D-KOMBI; D-Galactose plus TE- und MitoQ-Gruppe.
3.2. Auswirkungen von Laufbandtraining und MitoQ auf die Expression von NADPH-Oxidase-Untereinheiten in der Großhirnrinde und im Hippocampus von D-Gal-induzierten alternden Ratten
Wir beobachteten signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen in der Immunreaktivität von p22 phox in der Großhirnrinde und im Hippocampus alternder Ratten (Abbildung 2) (CA3,F4,24=18.786, p < 0.{{11 }}01; Kortex, F4,24=12.662, p < 0.001).
Im Kortex zeigte die D-CON-Gruppe im Vergleich zur Y-CON-Gruppe eine erhöhte Immunreaktivität von p22 phox, die in den D-TE-, D-MI- und D-COMBI-Gruppen deutlich abnahm.
In CA3 war die erhöhte Immunreaktivität von p22 phox in den D-TE- und D-COMBI-Gruppen im Vergleich zu D-CON verringert. Die Proteinexpressionsniveaus der NOX-Untereinheiten p22 phox, gp91 phox und p47phox unterschieden sich signifikant zwischen den Gruppen (p22 phox, F4,{{10}}.513, p < 0.{{24} }01; gp91 phox,F4,34=57.282, p < 0,001; p47 phox, F4,34=69.249, p < 0,001).
Die Ergebnisse des Post-Hoc-Tests zeigten einen signifikanten Anstieg der NOX-Untereinheitswerte im D-CON im Vergleich zum Y-CON. Allerdings waren die Werte der NOX-Untereinheiten in allen Interventionsgruppen niedriger als in der D-CON-Gruppe.
Insbesondere die Expression von p22 phox und gq91 phox war in der D-TE-Gruppe im Vergleich zur D-MI-Gruppe signifikant verringert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Bewegung und MitoQ einzeln altersbedingten oxidativen Stress im Gehirn verhindern, ihre Kombination jedoch zu keinen zusätzlichen Effekten führt.
Abbildung 2. Auswirkungen von Laufbandübungen und MitoQ auf die Expression von NADPH-Oxidase-Untereinheiten in der Großhirnrinde und im Hippocampus von D-Gal-induzierten alternden Ratten. (A1) Mikrofotografien, die die Immunreaktivität von NAPDH p22 phox in der Großhirnrinde und im Hippocampus von D-Gal-induzierten Alterungsratten in jeder Gruppe zeigen. Schwarze Rechtecke in A1 zeigen den Teil der Bilder an, wie in f–i und p–t gezeigt. (A2, A3) Quantifizierung der optischen Dichte der NADPH p22-Phox-Färbung in der Großhirnrinde und im Hippocampus.
Bonferroni-Post-hoc-Test nach ANOVA. Die Werte werden als Mittelwerte ± Standardabweichung (n=5 Tiere) dargestellt. (a–e und k–o) Maßstabsbalken=100 µm, (f–j und p–t) Maßstabsbalken=50 µm. (B) Repräsentative Western-Blot-Bilder für NADPH-Oxidase-Untereinheiten im Hippocampus.
(C–E) Quantifizierung der NADPH-Oxidase-Untereinheiten im Hippocampus. Die im Western Blot gezeigten Daten waren Mittelwerte aus sieben Rattengehirnen. -Actin wurde als interne Kontrolle untersucht. Nach der ANOVA wurde der Bonferroni-Post-hoc-Test verwendet. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM.
a Bezeichnet den statistischen Unterschied zur Y-CON-Gruppe. b Bezeichnet den statistischen Unterschied zur D-CON-Gruppe. c Bezeichnet den statistischen Unterschied zur D-TE-Gruppe. (p < 0.05).
3.3. Wirkung von Laufbandübungen und MitoQ auf die GFAP-Expression in der Großhirnrinde und im Gyrus dentatus des Hippocampus von D-Gal-induzierten alternden Ratten
Wir beobachteten signifikante Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen in der GFAP-Immunreaktivität in der Großhirnrinde und im Hippocampus-Gyrus dentatus (DG) alternder Ratten (Abbildung 3)(Cortex, F4,24=13.524, p < 0.001 ; DG, F4,24=30.364).
Die Ergebnisse des Post-hoc-Tests zeigten, dass die D-Gal-Behandlung die GFAP-Immunreaktivität sowohl im Kortex als auch im DG signifikant steigerte.
Im Vergleich zur D-CON-Gruppe waren die GFAP-Spiegel im Kortex in allen Interventionsgruppen verringert, und die GFAP-Spiegel in DG waren in den D-TE- und D-COMBI-Gruppen verringert, während die D-MI-Gruppe nur Unterschiede in der GFAP-Immunreaktivität aufwies in der Kortexregion.
Obwohl die TE- oder MitoQ-Behandlung die D-Gal-induzierte Neuroinflammation im Kortex reduzierte, führte nur die TE-Intervention zu positiven Effekten bei DG.
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