Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behebt AD-Defizite durch Modulation der Mikroglia-Aktivierung, jedoch nicht durch oxidativen Stress

Abstrakt: Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) wurde aus dem taiwanesischen Heilpilz Antrodia camphorate isoliert, der für seine gesundheitsfördernde und entzündungshemmende Wirkung bekannt ist. Alterungseffekte in der Volksmedizin. Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine der häufigsten altersbedingten Erkrankungen. Wir untersuchten die Wirksamkeit und den möglichen Mechanismus von Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol bei AD-Symptomen. Als AD-Modell wurde Drosophila mit der panneuronalen Überexpression von menschlichem Amyloid-(A) verwendet. Wir verglichen die Lebensdauer, motorische Funktion, Lernen, Gedächtnis, oxidativen Stress und Biomarker der Mikroglia-Aktivierung und Entzündung des Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol- der behandelten Gruppe im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe. Ergosta-7,9(11), die 22-Trien-3 -ol-Behandlung verbesserte wirksam die Lebensdauer, motorische Funktion, das Lernen und das Gedächtnis des AD-Modells im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Biomarker der Mikroglia-Aktivierung und -Entzündung wurden reduziert, während die allgegenwärtige Lipidperoxidation, Katalaseaktivität und Superoxiddismutaseaktivität unverändert blieben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol AD-Defizite behebt, indem es die Mikroglia-Aktivierung moduliert, nicht jedoch den oxidativen Stress.

Glykosid von Cistanche kann auch die SOD-Aktivität im Herz- und Lebergewebe erhöhen und den Gehalt an Lipofuscin und MDA in jedem Gewebe erheblich reduzieren, wodurch verschiedene reaktive Sauerstoffradikale (OH-, H₂O₂ usw.) effektiv abgefangen und vor verursachten DNA-Schäden geschützt werden durch OH-Radikale. Cistanche-Phenylethanoidglykoside haben eine starke Fähigkeit, freie Radikale abzufangen, eine höhere Reduktionsfähigkeit als Vitamin C, verbessern die Aktivität von SOD in der Spermiensuspension, reduzieren den MDA-Gehalt und haben eine gewisse schützende Wirkung auf die Funktion der Spermienmembran. Cistanche-Polysaccharide können die durch D-Galaktose verursachte Aktivität von SOD und GSH-Px in Erythrozyten und Lungengewebe experimentell seneszierender Mäuse steigern, außerdem den Gehalt an MDA und Kollagen in Lunge und Plasma verringern und den Gehalt an Elastin erhöhen eine gute Abfangwirkung auf DPPH, verlängert die Zeit der Hypoxie bei seneszenten Mäusen, verbessert die Aktivität von SOD im Serum und verzögert die physiologische Degeneration der Lunge bei experimentell seneszenten Mäusen. Bei der zellulären morphologischen Degeneration haben Experimente gezeigt, dass Cistanche über eine gute antioxidative Fähigkeit verfügt und hat das Potenzial, ein Medikament zur Vorbeugung und Behandlung von Hautalterungskrankheiten zu sein. Gleichzeitig hat Echinacosid in Cistanche eine erhebliche Fähigkeit, freie DPPH-Radikale abzufangen, reaktive Sauerstoffspezies abzufangen und den durch freie Radikale verursachten Kollagenabbau zu verhindern, und hat auch eine gute Reparaturwirkung auf Schäden durch Thymin-Radikalanionen.

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Schlüsselwörter: Alzheimer-Erkrankung; Drosophila; EK100; ergosta-7,9(11),22-versucht-3 -ol

1. Einleitung

Antrodia camphorata ist ein in Taiwan einzigartiger Heilpilz und war im 19. Jahrhundert eine wichtige Wirtschaftspflanze für Taiwans Außenhandel [1]. In Taiwans erstem Geschichtsbuch, Tâi-uân Thong-sú (wörtlich „Allgemeine Geschichte Taiwans“), wurden die indigenen medizinischen Verwendungen von Antrodia-Kampferat aufgezeichnet, darunter die Beseitigung von Krankheitserregern, „Verbesserung der Gesundheit“, „Stärkung des Blutes“, „Alkoholentgiftung“, „ „Schutz der Leber“ und „Anti-Aging“ [2–4]. Da wir aufgrund des Alterns vor einer globalen Herausforderung für die Gesundheit der Bevölkerung stehen [5], ist die wissenschaftliche Untersuchung der einheimischen Medizin zur Nutzung von Anti-Aging-Wissen von entscheidender Bedeutung.

Unter den wichtigsten altersbedingten Krankheiten wie Makuladegeneration, Arteriosklerose, Krebs und Schlaganfall ist die Alzheimer-Krankheit (AD) aufgrund ihres schwer fassbaren pathologischen Mechanismus eine harte Nuss. Eine wirksame krankheitsmodifizierende Behandlung von AD ist immer noch nicht verfügbar [6]. Aktuelle pathologische Hypothesen von AD umfassen unter anderem eine Verringerung der Cholinacetyltransferase, der Glutamat-Exzitotoxizität, der Amyloid-Beta(A)-Aggregation, der Tau-Phosphorylierung, der Insulinresistenz des Gehirns [7] und Veränderungen des Darmmikrobioms [8]. Unabhängig von der Art der AD-auslösenden Ursachen sind jedoch oxidativer Stress und entzündliche Mikroglia-Aktivierung die häufigsten Anzeichen, die die Neurodegeneration von AD begleiten [9,10]. Interessanterweise sind Neuroinflammation und oxidativer Stress miteinander verbundene Ereignisse, die sowohl bei AD beobachtet als auch in der AD-Pathologie vermutet werden. Einerseits lösen senile Plaques der A-Ablagerung entzündliche Reaktionen, Mikroglia-Aktivierung, Zytokinfreisetzung und Astrozytose aus, was zu unerwünschten Folgen wie fortschreitender neuronaler Schädigung und schließlich kognitiven Dysfunktionen führt. Die Aktivierung von Immunantworten kann zunächst eindringende Krankheitserreger mit A bekämpfen oder übermäßige A-Ablagerungen beseitigen; Allerdings entstehen bei diesem Prozess zwangsläufig reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die neuronale Schäden in der Mikroumgebung verursachen können. Andererseits könnte A ROS auf entzündungsunabhängige Weise verursachen. Beispielsweise wurde A postmortal in den Mitochondrienmembranen von AD gefunden und konnte in die Mitochondrien eindringen, was zur Unterbrechung der Elektronentransportkette (ETC) und zur Bildung von ROS führte. Erhöhte ROS können wiederum die Freisetzung von Zytokinen auslösen und eine Entzündung auslösen [7,9,10]. Daher könnten antioxidative und entzündungshemmende Moleküle potenzielle Therapeutika für AD sein.

Antrodia-Kampferat, insbesondere eine seiner in Vollbrühe isolierten Verbindungen Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (auch bekannt als EK100), zeigte eine ausgeprägte antioxidative und antioxidative Wirkung -entzündliche Aktivitäten [11–13]. Darüber hinaus haben Chang et al. [14] haben gezeigt, dass Antroquinonol, eine weitere Verbindung, die aus dem fermentierten Myzel von Antrodia camphorate isoliert wurde, das Lernen und das Gedächtnis in einem AD-Mausmodell mit verringerter Astrogliose und oxidativem Stress verbessert. Allerdings konnten die kausalen Zusammenhänge zwischen der verminderten Astrogliose und dem oxidativen Stress unter Antrochinonol-Behandlung nicht bestätigt werden, und die Senkung des oxidativen Stresses wurde als vermittelnder Faktor postuliert [14]. Die Sicherheit von EK100 wurde zuvor gemäß der Richtlinie 407 der Organisation für wirtschaftliche Zusammenarbeit und Entwicklung (OECD) in einem Mäusemodell mit 10 und 20 mg/kg-Tag getestet [15]. Daher haben wir in dieser Studie ungefähr äquivalente Konzentrationen der freien Nahrungsaufnahme für Fruchtfliegen angenommen.

Das Fruchtfliegenmodell (Drosophila melanogaster) der A 42-Überexpression ist ein gut etabliertes AD-Tiermodell [16] mit charakteristischen AD-Symptomen, einschließlich verkürzter Lebenserwartung, Lern- und motorischen Defiziten [17], oxidativem Stress [18] und Mikroglia-Aktivierung [19]. Zu den Herausforderungen bei der Modellierung von AD bei Drosophila melanogaster gehören die fehlende BACE-Aktivität bei Drosophila und Geschlechtsunterschiede, die bei männlichen Patienten zu schwerwiegenderen Symptomen führen. Diese werden bei menschlicher AD nicht beobachtet [20]. Daher haben wir menschliche A 42-Peptide exprimierende Fliegen als Modell für AD übernommen, wo die A 42-Produktion keine BACE-Aktivität erfordert. In dieser Studie haben wir getestet, ob EK100 die AD-Symptome verbessert und, was noch wichtiger ist, ob sowohl Modulationen von oxidativem Stress als auch Astrogliose für die Linderung von AD unerlässlich sind.

2. Ergebnisse

2.1. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol rettete das Überleben und Klettern von AD Drosophila

Die AD-Diagnose ist mit einer Verkürzung der mittleren Lebenserwartung verbunden [21] und fast die Hälfte der AD-Patienten leidet unter Aktivitätsstörungen [22]. Daher haben wir getestet, ob der Antrodia camphorata-Extrakt ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) die Überlebens- und Kletterfähigkeit von Antrodia camphorata verbessert AD Drosophila-Modell. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit 125 oder 250 µg/ml Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol das Überleben von AD Drosophila signifikant verbesserte (p < 0,01) (Abbildung 1A und Ergänzungstabelle S1), aber nur eine hohe Dosis (250 µg/ml) verbesserte das Klettern von AD Drosophila (Abbildung 1B). Da Überlebens- und Mobilitätsdefizite klinische Symptome von AD sind, wurde in den folgenden Untersuchungen die Konzentration von 250 µg/ml verwendet, die beide Symptome verbesserte.

2.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol Gerettetes Lernen und einstündiges Gedächtnis von AD Drosophila

Als nächstes testeten wir, ob die Behandlung mit Ergosta{{0},9(11),22-trien-3 -ol Lern- und Gedächtnisstörungen, ein typisches Symptom von AD, verbessert. AD-Fliegen wurden 14 Tage lang mit Ergosta- 7,9(11),22-trien-3 -ol bei 250 ug/ml behandelt und Lern- und Gedächtnistests unterzogen T-Labyrinth. Wie in Abbildung 2A gezeigt, nahm die Lernfähigkeit der AD-Kontrolle (AD( plus )/EK(-)) im Vergleich zur Wildtyp-Kontrolle (AD(-)/EK(-)) signifikant ab (p < 0,01), während Die Behandlung mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol verbesserte die Lernfähigkeit von AD deutlich (p < 0,05). Darüber hinaus verbesserte die Behandlung mit Ergosta-7,9(11) mit 22-Trien-3 -ol auch das nachlassende Ein-Stunden-Gedächtnis bei AD (Abbildung 2B).

2.3. Ergosta-7,9(11),22-versuchte-3 -ol-modulierte Mikroglia-Aktivierung bei AD Drosophila

Als nächstes testeten wir, ob die Behandlung mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol die Mikroglia-Aktivierung bei AD verringert. Bei AD gehen aktivierte Mikroglia mit Phagozytose und Neurodegeneration einher [23]. In Drosophila ist der Mikroglia-Zell-Verschlingungsmarker und damit der Mikroglia-Aktivierungsmarker der Ausdruck von Draper (Drpr) und dem nachgeschalteten CED (24). Nach der Behandlung mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol wurden AD-Fliegen getötet und RNA aus den Köpfen der Fliegen für RT-qPCR extrahiert. Wie in Abbildung 3A gezeigt, waren beide Drpr bei mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandelter AD Drosophila im Vergleich zur unbehandelten AD signifikant herunterreguliert. Dies impliziert, dass Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol die Mikroglia-Aktivierung bei AD Drosophila verringerte. Darüber hinaus senkte Ergosta-7,9(11), die Behandlung mit 22-Trien-3 -ol, auch die ZNS-Entzündung, was sich in der Herunterregulierung entzündungsrelevanter Gene zeigte (Abbildung 3B). .

2.4. Ergosta-7,9(11),22-versuchte-3 -ol modulierte den allgegenwärtigen oxidativen Stress bei AD Drosophila nicht

Als nächstes testeten wir, ob die Modulation von ubiquitärem, also im gesamten Körper vorkommendem, oxidativem Stress notwendig ist, damit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol AD ​​retten kann. Die von Ergosta-7,9(11),22-versuchte- 3 -ol-Behandlung veränderte die Lipidperoxidation (Abbildung 4A), die Katalaseaktivität (Abbildung 4B) und die Superoxiddismutaseaktivität (Abbildung 4C) nicht. oder die Expression von Genen, die mit oxidativem Stress in Zusammenhang stehen (Abbildung

3. Diskussion

Diese Studie berichtet über die Wirksamkeit und den möglichen zugrunde liegenden Mechanismus von Ergosta-7,9(11),22- trys-3 -ol, einem Extrakt aus Antrodia camphorate, zur Symptommodifikation von AD unter Verwendung von Drosophila Modell mit Human-A-Überexpression. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol verbesserte effektiv das Lernen und das Gedächtnis und verlängerte die Lebensspanne von Patienten mit AD. Darüber hinaus wurden Biomarker für die Aktivierung und Entzündung von Mikroglia reduziert, während der allgegenwärtige oxidative Stress unverändert blieb.

Es gibt viele Quellen für oxidativen Stress bei AD, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Aktivierung der angeborenen Immunität – beispielsweise sind A-Akkumulation, die Störung der Mitochondrien durch A, hyperphosphoryliertes Tau und Metall-Malmetabolismus ebenfalls Quellen [25]. Obwohl Entzündungen und oxidativer Stress sich gegenseitig induzieren können, können wir davon ausgehen, dass ihre synchronen Veränderungen nur unter Umständen auftreten, unter denen andere Quellen von oxidativem Stress konstant bleiben. Dies ist in dieser Studie jedoch nicht der Fall. Eine Abnahme der angeborenen Immunität, insbesondere der Mikroglia-Aktivierung, schwächt gleichzeitig deren Beitrag zur A-Clearance, was zu einer A-Akkumulation führen kann. Interessanterweise löst die A-Ansammlung selbst die Entstehung von oxidativem Stress auf verschiedene Weise aus. Somit kann die Verringerung der Mikroglia-Aktivierung und der Entzündungsreaktionen durch EK1000 die Neuronen teilweise vor Angriffen des Immunsystems außerhalb des Ziels schützen, wird jedoch den Preis der Abschwächung der A-Clearance zahlen. Daher spiegelt das Ergebnis dieser Studie möglicherweise die Einschränkung der Mikroglia-Targeting-Strategie wider, zumindest im AD Drosophila-Modell.

Das Mikroglia-vermittelte angeborene Immunsystem wird als zweischneidiges Schwert bei neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere AD, beschrieben [26,27]. Aktivierte Mikroglia versuchen, toxische Krankheitserreger wie A zu entfernen, verursachen jedoch unweigerlich neuronale Schäden in der Mikroumgebung. Die Überlegenheit von 250 µg/ml EK100 innerhalb von 35 Tagen kann darauf hindeuten, dass die Strategie zur Verringerung der Mikroglia-Aktivierung zumindest im Fall des Fruchtfliegen-AD-Modells pathologisch begrenzt ist. Darüber hinaus hat die signifikante Senkung der Biomarker für die Mikroglia-Aktivierung und die Entzündungsreaktion nicht zu einer ähnlich signifikanten Verbesserung der Überlebensrate geführt, und die ZNS-Funktion könnte teilweise durch die zweischneidige Eigenschaft der Mikroglia erklärt werden. Dies impliziert, dass die Mikroglia-Aktivierung weder der einzige noch der dominierende Faktor für das Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit ist. Eine verringerte Mikroglia-Aktivierung deutet auch darauf hin, dass der Abbau des überexprimierten A im Fruchtfliegenmodell teilweise ausgeschaltet wurde, was möglicherweise auch die höhere Mortalität für die höhere EK100-Konzentration im Alter zwischen 35 und 52 Tagen erklärt.

Antroquinonol, ein weiterer Extrakt aus Antrodia campherate, wurde für seine Wirksamkeit bei der Behandlung von AD-Mäusen beschrieben, wobei die Senkung des oxidativen Stresses als vermittelnder Faktor postuliert wurde [14]. Daher kann dies bedeuten, dass Antrochinonol und Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol die AD-Symptome über unabhängige Wege verbessern, indem sie oxidativen Stress vermitteln oder nicht. Daher wäre es interessant zu testen, ob eine gleichzeitige Behandlung mit Antrochinonol und Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol einen synergetischen Effekt auf die AD-Verbesserung haben würde.

Im Frühstadium der Alzheimer-Krankheit liegt das Hauptaugenmerk der Medikamentenentwicklung auf der Eliminierung der A-Ablagerung (wie z. B. beim kürzlich zugelassenen monoklonalen Antikörper Aducanumab [28], obwohl in einer der beiden klinischen Phase-III-Studien kontrovers über minimale klinische Vorteile und Unwirksamkeit gestritten wurde). [29]) oder Versuche, die mikrogliale Aufnahme von A zu erhöhen [30–32]. In mittelschweren oder fortgeschrittenen Stadien der Alzheimer-Krankheit verschlimmert die Überaktivierung der Mikroglia jedoch umgekehrt die Neurodegeneration [33], weshalb alternative Therapiestrategien erforderlich sind.

4. Materialien und Methoden

4.1. Wartung und Lebensdauermessung von Fliegenfischen

Der A-transgene Drosophila-Stamm H29.3/CyO wurde von [16] erhalten und sechs Generationen lang mit w(CS10) ausgekreuzt. Die panneurale Treiberlinie elav-GAL4c155 wurde sechs Generationen lang mit w(CS10) gekreuzt. Als Standardstamm wurde die White-Eye-Linie w1118 (Bloomington Drosophila Stock Centre Nr. 3605) verwendet, die zehnmal mit der Canton S-Linie (Bloomington Drosophila Stock Centre Nr. 64349) ausgekreuzt wurde (w (CS10)). Die panneurale Treiberlinie elav-GAL4c155 wurde vom Bloomington Drosophila Stock Center (Nr. 458) bezogen. Der Genotyp der Versuchsfliegen – also des AD-Modells – war [elav; H29.3/ plus ], der aus den F1-Nachkommen ohne den CyO-Marker selektiert wurde. Die Fliegen wurden in Maismehl-Standardmedien bei 25 °C in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Für T-Labyrinth ist das auftauchende [elav; H29.3/plus]-Fliegen wurden gesammelt (beide Geschlechter gemischt und nicht jungfräulich) und mit oder ohne EK100-Behandlung bis Tag 14 nach dem Auflaufen kultiviert. Für Überleben, Klettern und RT-qPCR wurden nur die männlichen Fliegen verwendet. RNA-Proben wurden am Tag 30 nach dem Auflaufen gesammelt, als sowohl die Lebensspanne als auch die Anstiegskurve im Vergleich zum unbehandelten AD-Modell eine signifikante Trennung zeigten.

In einer Lebensdaueranalyse wurden zwanzig bis dreißig Fliegen in einem Lebensmittelfläschchen mit oder ohne CS aufgezogen; Für jede Behandlung wurden mindestens vier Fläschchen vorbereitet. Die Futterfläschchen wurden alle 2 bis 3 Tage ausgetauscht und die toten Fliegen wurden zu diesem Zeitpunkt gezählt. Pro Versuch wurden mindestens drei Wiederholungen durchgeführt. Der Überlebensprozentsatz ist definiert als die Anzahl der lebenden Fliegen geteilt durch die Gesamtzahl der Fliegen zu Beginn des Tests.

4.2. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (Ek100)

Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol wurde aus dem freundlichen Geschenk von Antrodia camphorata gewonnen, wie zuvor beschrieben [34]. Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol bildet bei Raumtemperatur ein Pulver von hellgelber Farbe. Die Stammlösung wurde direkt vor der Verwendung mit einer Konzentration von 6,25 mg/ml in EtOH hergestellt. Für Lebensdauer- und Anti-Geotaxis-Tests betrugen die Endkonzentrationen 125 und 250 µg/ml. Für Lerngedächtnis- und Genexpressionstests betrug die Endkonzentration 250 µg/ml. Das Molekulargewicht von EK100 beträgt 396,65. Die entsprechenden molaren Konzentrationen betragen also 315 bzw. 630 µM. Fliegen wurden mit zwei Dosen EK100 mit Endkonzentrationen von 125 und 250 µg/ml behandelt, die durch Ad-libitum-Fütterung in das Futter gemischt wurden. Das Kontrollfutter enthielt die gleiche Menge Lösungsmittel EtOH wie die Versuchsgruppen mit einer endgültigen EtOH-Konzentration von 3 Prozent v/v. Die Behandlung begann vom Auftauchen bis zum Zeitpunkt der Datenerfassung jedes Tests. Für den Überlebens- und Klettertest wurde die Behandlung über die gesamte Lebensspanne durchgeführt. Die Anzahl der Fliegen für jede Replikation wurde im Methodenabschnitt jedes Tests beschrieben. Wir haben auch Lebensdauertests mit behandelten/unbehandelten Wildtypfliegen getestet, um die Sicherheit des Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ols in Fliegenmodellen sicherzustellen (Ergänzende Abbildung S1). ).

4.3. Antigeotaxis-Tests

Das vorliegende Protokoll basiert mit einigen Modifikationen auf einer zuvor veröffentlichten Methode [35]. Kurz gesagt wurde als Geotaxis-Gerät ein transparentes zylindrisches Kunststofffläschchen mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Höhe von 9,5 cm (länger reicht aus, ist aber schwieriger zu handhaben) verwendet. Der Boden des Fläschchens war mit einer einzelnen Schicht Fliegenfutter als Polsterung beschichtet. An der Außenfläche des Fläschchens wurde eine 5-cm-Markierung über dem Kissen angebracht. Das andere Ende des Fläschchens war offen und von dort wurden Fliegen geladen. Da der Test gleichzeitig mit dem Überlebenstest durchgeführt wurde, war die Anzahl der beladenen Fliegen identisch mit der Anzahl der zu diesem Zeitpunkt überlebenden. Die Fliegen wurden in das Fläschchen geladen; Der Deckel wurde mit einem Deckel verschlossen und der Boden des Fläschchens wurde wiederholt (zwei Sekunden lang) gegen die harte Oberfläche geschlagen, auf der es stand (in diesem Fall Labortisch). Das Klopfen war stark genug, um die Fliegen aufzuschrecken und sie dazu zu bringen, an den Fläschchenwänden entlangzuklettern, aber nicht so stark, dass sie körperlich verletzt wurden. Der gesamte Vorgang wurde 18 Sekunden lang auf Video aufgezeichnet, wobei die Anzahl der Fliegen, die über die 5-cm-Marke kletterten, notiert und für jede Gruppe in Prozent ausgedrückt wurde. Gezählt wurde die Anzahl der Fliegen, die über die 5-cm-Marke kletterten. Für jede Gruppe wurden vier Wiederholungen durchgeführt. Der Prozentsatz der Kletterfähigkeit ist definiert als die Anzahl der kletternden Fliegen dividiert durch die Gesamtzahl der Fliegen zu Beginn des Tests. Die Kletterfähigkeit wurde auch an behandelten/unbehandelten Wildtypfliegen getestet, um die Sicherheit von Ergosta-7, 9 (11), 22-trien-3 -ol in Fliegenmodellen sicherzustellen (Ergänzende Abbildung S2). .

4.4. Drosophila-Lern- und Gedächtnisplattform (T-Maze)

Um das Lernen und Gedächtnis von Drosophila zu beobachten, wurden zunächst etwa 100 Fliegen in die obere Kupferkammer gesetzt, die mit elektrischer Spannung versorgt werden kann und den Fliegen einen Elektroschock versetzen kann. Fliegen wurden zunächst in Geruch 1 (MCH) zusammen mit Elektroschockwellen abgegeben. Anschließend wurde den Fliegen Geruch 2 (OCT) ohne Elektroschockwellen verabreicht. Nach dem Training wurden die Fliegen in den Raum darunter gebracht, in dem zwei offene Seiten entweder mit Geruch 1 bzw. Geruch 2 versorgt wurden. Durch Beobachtung der Bewegungsrichtung der Fliegen kann die Tendenz von Geruch 2 gegenüber Geruch 1 mit dem Performance Index (PI) abgeschätzt werden, der als Differenz in der Anzahl der Fliegen zwischen zwei Gerüchen geteilt durch die Gesamtzahl der Fliegen definiert ist. Der Leistungsindex repräsentiert die Lern- und Gedächtnisfähigkeit von Drosophila [36]. Eine andere Fliegengruppe wurde mit den umgekehrten Geruchspaarungen konditioniert, sodass jeder Geruch einmal als Elektroschock plus und einmal als Elektroschock − diente. Die PIs dieser beiden Tests wurden als endgültige PI einer Wiederholung gemittelt. „1 h-Gedächtnis“ wurde nach 1 h Abstand zum Training getestet, „Lernen“ dagegen nach 1,5 min Abstand zum Training. Wir haben auch die Vermeidung von MCH und OCT der AD-Fliegen mit oder ohne EK100-Behandlung getestet, um sicherzustellen, dass die Behandlung tatsächlich zu einer Verzerrung der aversiven Gerüche führt (ergänzende Abbildung S3).

4.5. Quantitative PCR

Köpfe und Körper wurden vor der RNA-Extraktion getrennt. Für eine Wiederholung wurden die Fliegen mit CO2 betäubt; jeweils 100 Stück in Eppendorf-Röhrchen gesammelt; und dann 1 Minute lang in flüssigen Stickstoff getaucht, um die Körper spröde zu machen. Die resultierenden gefrorenen Kadaver wurden dann auf Stapel von Siebmaschinen (Bunsekifurui, Nr. 40 und Nr. 25) geladen und geschüttelt. Die Körper zerfielen und wurden entsprechend der Größe der Siebmaschen in zwei getrennte Fraktionen sortiert: „Köpfe“ und „Körper“. Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNeasy Mini-Kit (Qiagen, Düsseldorf, Deutschland) extrahiert und dann zur Synthese von cDNA mit dem VersoTM cDNA-Synthese-Kit (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) verwendet. Die RNA-Expressionsniveaus der untersuchten Gene wurden durch Echtzeit-PCR (Applied Biosystems 7700, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) mit dem Maxima SYBR Green qPCR Master Mix (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) quantifiziert. Die Ergebnisse wurden auf die relative Menge an Gapdh oder Rpl32 normalisiert. Die verwendeten Primer sind unten aufgeführt. Gapdh: 50 -GAAAAAGCGGCAGTCGTAAT-30 und 50 -AATTCCGATCTTCGACATGG-30 ; Drpr: 50 -TGTGATCATGGTTACGGAGGAC-30 und 50 -CAGCCGGGTGGGCAA-30 ; CED: 50 - CGTTTACAAGGAGCGACT-30 und 50 -TTCCCAGATTGAAGAGCAGG-30 ; Katze: 50 -TGACT ACAAAAACTCCCAAACG-30 und 50 -TTGATTCCAATGGGTGCTC-30 ; PHGPx: 50 -TGACA TCGGCGAGGTGT-30 und 50 -CGGTCTGCTTGGCCTTTA-30 ; Cnc: 50 -GCCAACTATGGTGG TGGAGT-30 und 50 -ACGCTGCGATTCAGACG-30 ; SOD1: 50 -GTCGACGAGAATCGTCAC CT-30 und 50 -GGAGTCGGTGATGTTGACCT-30 ; SOD2: 50 -AAATTTCGCAAACTGCAAGG- 3 0 und 50 -GGTCGCCATTTGTTGCTATT-30 ; SOD3: 50 -TCAGCATGGGTGCTCACTAT-30 und 50 -TAATGCCCGTGGAGTTGG-30 ; mkk3: 50 -CCGCTACCCATACGACAAT-30 und 5 0 -GAATTCCGGCGAAAATGT-30 ; mekk1: 50 -TTTAACGGCAGTGGAACTGT-30 und 50 - TGCATCTGCAACTGCTCAC-30 ; imd: 50 -AGATCGACCAGGCCATAATC-30 und 50 -AATCC ACTGGAGCAACAGC-30 ; rac1: 50 -CCGTGTTCGACAACTACTCG-30 und 50 -AGTCGGTCG TAGTCCTCCTG-30 ; relish: 50 -GCCATACTCCCTTGGAATTG-30 und 50 -TCTCCCTTCTCCG GATACAC-30 ; Rpl32: 50 -CGGATCGATATGCTAAGCTGT-30 und 50 -CGACGCACTCTGTTG TCG-3.

4.6. Tests auf oxidativen Stress

Drei Replikate der Lipidperoxidation, Katalaseaktivität und Superoxiddismutaseaktivität wurden mit BIOXYTECH LPO-586 (OxisResearch, OXIS International, Beverly Hills, CA, USA), dem Catalase Assay Kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) gemessen , USA) bzw. das Superoxide Dismutase Assay Kit (Cayman) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, die SOD-Aktivität wurde durch Messung der Dismutation von Superoxidradikalen bewertet, die durch die im Kit enthaltene Xanthinoxidase erzeugt wurden, und wurde durch Umwandlung von Tetrazoliumsalz in Formazanfarbstoff nachgewiesen und anschließend durch Absorption bei 440–460 nm quantifiziert. Die CAT-Aktivität wurde durch Messung der durch CAT katalysierten Formaldehydbildung aus Methanol in Gegenwart von H2O2 bewertet, die mit dem im Kit enthaltenen chromogenen 4-Amino-3--Hydrazino-5-mercapto-1 nachgewiesen wurde. ,2,4-Triazol, dann quantifiziert durch die Absorption bei 540 nm. Die Lipidperoxidationsaktivität wurde durch Messung der Zersetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäureperoxiden in Malonaldehyd (MDA) und 4-Hydroxyalkenale beurteilt, die mit dem im Kit enthaltenen chromogenen N-Methyl-2-phenylindol nachgewiesen und anschließend durch Absorption bei 586 quantifiziert wurden nm. Für die SOD-, Cat- und LPO-Assays betrug die Anzahl der ganzen homogenisierten Fliegen jedes Replikats 50, 50 bzw. 100.

4.7. Statistische Analyse

Die Signifikanz des Unterschieds zwischen den Überlebenskurven und Steigungskurven der mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandelten Gruppen und der Kontrollgruppen wurde anhand des Log-Rank-Verfahrens (Mantel– Cox) und Gehan-Breslow-Wilcoxon-Tests. Die Signifikanz des Unterschieds zwischen dem Leistungsindex des Lerngedächtnisses der mit Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol behandelten Gruppen und der Kontrollgruppen wurde durch den Student-T-Test beurteilt.

5. Schlussfolgerungen

Wir haben bestätigt, dass Ergosta-7,9(11),22-trien-3 -ol (EK100) aus Antrodia campherate das Überleben, das Lernen und das Gedächtnis in einem Drosophila-Modell für AD mit reduzierten Biomarkern verbessert der Aktivierung und Entzündung von Mikroglia. Darüber hinaus erfolgte die Symptomveränderung nicht durch eine allgegenwärtige Reduzierung des oxidativen Stresses, was bedeutet, dass Ergosta-7,9(11) und 22-trien-3 -ol die AD-Symptome auf unterschiedlichen Wegen verbessern Antrodia-Kampherat-Extrakt, Antrochinonol. EK100 verringerte wirksam die Mikroglia-Aktivierung und -Entzündung, was dazu beitragen kann, typische AD-assoziierte kognitive Defizite wie Lern- und Gedächtnisdefizite umzukehren.

Zusatzmaterialien:Folgendes ist online verfügbar. Abbildung S1: Überleben von mit EK100 behandelten Wildtypfliegen; Abbildung S2: Klettern von mit EK100 behandelten Wildtypfliegen; Abbildung S3: Vermeidung aversiver Gerüche bei mit EK100 behandelten AD-Fliegen; Tabelle S1: Statistik der Überlebenskurven.

Autorenbeiträge:H.-PL, Y.-HK und W.-YL haben die Experimente entworfen. Y.-HK hat zur Vorbereitung von EK100 beigetragen. JC, L.-ZC, M.-SC, L.-WS und T.-NC führten die Experimente durch. Alle Autoren waren an der Erstellung des Manuskripts beteiligt. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie in Taiwan unterstützt (MOST 108-2320-B-039-031-MY3, MOST 109-2314-B-039-030, MOST 110-2314- B-039-009), China Medical University & Hospital (CMU109-MF-85, CMU108-MF-68, CMU108-MF{{12 }}, CMU109- AWARD-02 und DMR-109-150) und aus dem Featured Areas Research Center Program im Rahmen des Higher Education Sprout Project des Bildungsministeriums (MOE) in Taiwan (CMRC-CHM-2-1).

Erklärung des Institutional Review Board:Unzutreffend.

Einverständniserklärung:Unzutreffend.

Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Die zur Untermauerung der Ergebnisse dieser Studie verwendeten Daten sind im Artikel enthalten.

Interessenskonflikte:Y.-HK ist einer der Erfinder, aber nicht Rechtsnachfolger des Patents US-9757393-B2 mit dem Titel „Derivatives of ergostatrien-3- -ol from aniridia camphorate and anti glycemic, antihyperlipidemic andcreasing hepatic fat use davon“. Andere Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben. Die Geldgeber spielten keine Rolle bei der Gestaltung der Studie; bei der Sammlung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Verfassen des Manuskripts oder bei der Entscheidung, die Ergebnisse zu veröffentlichen.

Probenverfügbarkeit:Proben der Verbindungen sind bei den Autoren erhältlich.

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