Bewertung der Fettsäurezusammensetzung, antioxidativen und pharmakologischen Aktivitäten von Kürbiskernöl (Cucurbita moschata) aus wässriger enzymatischer Extraktion, Teil 1

May 08, 2023

Abstrakt:Kürbiskernöl ist ein Nebenprodukt, das reich an Nährstoffen und bioaktiven Bestandteilen ist, die mehrere gesundheitliche Vorteile bieten. Ziel dieser Studie war es, die chemische Zusammensetzung, die antioxidativen und pharmakologischen Aktivitäten von Kürbiskernölen zu vergleichen, die aus Cucurbita moschata Duch gewonnen wurden. Ex Poir. (PSO1) und Cucurbita moschata (japanischer Kürbis) (PSO2) durch wässrige enzymatische Extraktion. Im enzymatischen Extraktionsprozess wurde eine Enzymmischung bestehend aus Pektinase, Cellulase und Protease (1:1:1) verwendet. Die Fettsäurezusammensetzung der Öle wurde mittels Fettsäuremethylester/Gaschromatographie-Massenspektrometrie bestimmt. Antioxidative Aktivitätstests wurden unter Verwendung von stabilem freiem Radikal Diphenylpicrylhydrazyl, Radikalkation 2, 20 -Azinobis-(3- ethylbenzothiazolin-6-sulfonat, reduzierender/antioxidativer Wirkung von Eisen und Eisenthiocyanat gemessen. Hemmung von Enzyme, die an der Hautalterung und dem Aufhellungsprozess beteiligt sind, wurden untersucht. Linolsäure war ein Hauptbestandteil aller Kürbiskernöle. Darüber hinaus wurden auch erhebliche Mengen an Ölsäure, Palmitinsäure und Stearinsäure nachgewiesen. PSO2 besaß im Vergleich zu den höchsten antioxidativen Aktivitäten PSO1 und kommerzielle Kürbiskernöle (COM1 und COM2). Sowohl PSO1 als auch PSO2 zeigten eine stärkere Hemmwirkung auf Hyaluronidase, Kollagenase und Tyrosinase als die kommerziellen. Daher könnte eine wässrige enzymatische Extraktion Kürbiskernöle mit höherer Antioxidans-, Anti-Aging- und Anti-Aging-Wirkung ergeben Bleaching-Aktivitäten. Dies ist für weitere pharmakologische Studien von Vorteil und kann als funktionelles Lebensmittel für die Haut verwendet werden.

Den einschlägigen Studien zufolgeCistancheist ein weit verbreitetes Kraut, das als „Wunderkraut, das das Leben verlängert“ bekannt ist. Sein Hauptbestandteil istCistanosid, was verschiedene Auswirkungen hat, wie zAntioxidans, Antiphlogistikum, UndFörderung der Immunfunktion. Der Mechanismus zwischen Cistanche undHaut Aufhellungliegt in der antioxidativen Wirkung von CistancheGlykoside. Melanin in der menschlichen Haut entsteht durch die katalysierte Oxidation von TyrosinTyrosinaseDa die Oxidationsreaktion die Beteiligung von Sauerstoff erfordert, werden die sauerstofffreien Radikale im Körper zu einem wichtigen Faktor, der die Melaninproduktion beeinflusst. Cistanche enthält Cistanosid, ein Antioxidans, das die Bildung freier Radikale im Körper reduzieren kannHemmung der Melaninproduktion.

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Schlüsselwörter:Cucurbita moschata; Japanischer Kürbis; Kürbiskernöl; wässrige enzymatische Extraktion; Fettsäuren; Antioxidans; Antialterung

1. Einleitung

Kürbis gehört zur Gattung Cucurbita und zur Familie der Cucurbitaceae, einer weit verbreiteten und berühmten Pflanze, die im Norden Mexikos angebaut wurde und sich in Europa, Westamerika und Asien verbreitet hat [1]. Kürbis gilt als funktionelles Lebensmittel, das reichlich Nährstoffe wie Proteine, Kohlenhydrate, Lipide, Ballaststoffe usw. sowie phytochemische Verbindungen wie Tocopherole, Carotinoide und -Sitosterin enthält [2]. Es wurde festgestellt, dass die Phytonährstoffe aus verschiedenen Teilen des Kürbisses pharmakologische Aktivitäten haben [2]. Kürbisschalenextrakt zeigte in Tiermodellen positive Auswirkungen auf Verbrennungswunden [3]. Kürbismark zeigte bei Mäusen eine antioxidative, entzündungshemmende und antiangiogenetische Aktivität [2] sowie eine Anti-Müdigkeitsaktivität [4]. Darüber hinaus sind Kürbiskerne eine gute natürliche Quelle für essentielle Fettsäuren und Phytosterine, die das Risiko einer kardiovaskulären Mortalität senken [5,6]. Kürbiskernöl ist ein Nebenprodukt der Verarbeitung von Kürbiskernen, die reich an verschiedenen Fettsäuren und bioaktiven Verbindungen wie -Carotinen, -Tocopherol, Vitamin B, Lutein, Phytosterinen und anderen Mineralien sind [7,8]. Das Öl hat eine antioxidative, entzündungshemmende, antibakterielle und wundheilende Wirkung [1,9]. Darüber hinaus hat es mehrere gesundheitliche Vorteile gegen Krankheiten wie Bluthochdruck, Diabetes und Krebs [8,10].

Es wurden verschiedene Methoden zur Gewinnung von Samenöl entwickelt, darunter mechanische Methoden wie Kaltpressen [11] und Hochdruckextraktion [12]. Die Lösungsmittelextraktion von Samenöl mit organischen Lösungsmitteln wie Hexan, Ethylacetat, Aceton und Methanol wurde ebenfalls dokumentiert [13,14]. Die enzymunterstützte Extraktion ist eine alternative Methode für die Pflanzenölindustrie, da es sich um eine umweltfreundliche und sichere Technologie handelt. Der Hauptmechanismus der wässrigen enzymatischen Extraktion besteht darin, die Zellwände von Pflanzenmaterial zu hydrolysieren und aufzubrechen, was zu mehr Permeabilität und der Freisetzung bioaktiver Komponenten, einschließlich der Ölphase, führt [15]. Verschiedene bei dieser Extraktion verwendete Enzymmischungen bestehen aus Pektinasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Arabinose, -Glucanase und Xylanase [16,17]. Die optimierten Bedingungen einer Enzymmischung, zum Beispiel Temperatur, pH-Wert, Reaktionszeit, Partikelgröße und Enzymkonzentration, steigerten ebenfalls die Enzymaktivität [16]. Heutzutage wird diese Methode häufig zur Gewinnung von Öl aus vielen Früchten und Pflanzensamen eingesetzt [18,19]. Einige frühere Studien zeigten den optimierten Zustand von Kürbiskernöl, um einen hohen Ertrag und wirksame pharmakologische Aktivitäten zu erzielen [20,21].

Derzeit wird Kürbiskernöl in Desserts oder Salatdressings konsumiert, außerdem ist es eine beliebte Zutat in Kosmetika. Hautalterung ist ein komplexer biologischer Prozess, der durch Faltenbildung, Elastizitätsverlust, Feuchtigkeitsverlust und eine raue Textur gekennzeichnet ist, die durch oxidativen Stress, DNA-Schäden und eine fortgeschrittene Ansammlung von Glykationsendprodukten verursacht werden [22]. Hyaluronsäure, Kollagen und Elastin, die wichtige Bestandteile der Haut sind, können durch die Enzyme Hyaluronidase, Kollagenase bzw. Elastase abgebaut werden, was zur Hautalterung führt. Mehrere Pflanzenöle wie Olivenöl, Sonnenblumenkernöl, Traubenkernöl und Jojobaöl wurden für hautkosmetische Eigenschaften verwendet, um Feuchtigkeit zu speichern, die Hautbarrierefunktion zu verbessern und Hautalterung vorzubeugen [23]. Darüber hinaus ist die Hautpigmentierung ein variabler und auffälliger Phänotyp beim Menschen, der Melanogenese beinhaltet und durch das Tyrosinase-Enzym reguliert wird [24]. Derzeit wurden verschiedene Pflanzenextrakte für Kosmetika und Pharmazeutika getestet, um die Melaninproduktion zu verringern und als Aufheller zu wirken [25,26].

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Kürzlich wurde C. moschata Duch. Ex Poir ist eine Kürbissorte, die in Thailand häufig angebaut und beliebt ist, aber es gibt nur wenige Studien zu ihren funktionellen Werten und pharmakologischen Eigenschaften. Darüber hinaus ist die wässrige enzymatische Extraktion eine interessante Methode zur Gewinnung von Öl aus Kürbiskernen, um eine hohe Ausbeute und Effizienz zu erzielen. Daher konzentrierte sich diese Studie auf die Bestimmung der Hauptbestandteile, antioxidativen und pharmakologischen Aktivitäten von Kürbiskernöl aus C. moschata Duch. Ex Poir. (thailändische Sorte) und C. moschata (japanischer Kürbis) mithilfe der wässrigen enzymatischen Extraktionsmethode.

2. Materialien und Methoden

2.1. Pflanzenmaterialien

Die frischen Früchte von C. moschata Duch. Ex Poir und C. moschata (japanischer Kürbis) wurden im Dezember 2020 auf einem lokalen Markt in Chiang Mai, Thailand, gekauft. Die Samen wurden gesammelt und alle Faserstränge entfernt. Nach der Entfernung der Samenschale wurden die geschälten Kürbiskerne gewaschen und bei Umgebungstemperatur getrocknet. Die Samen wurden bis zum weiteren Experimentieren in einer versiegelten Plastiktüte aufbewahrt. Zusätzlich wurden zwei kommerzielle Kürbiskernölproben (COM1 und COM2) in einem Supermarkt in Chiang Mai, Thailand, gekauft. Alle Experimente wurden innerhalb des Datums durchgeführt, an dem die kommerziellen Öle zum Verzehr geeignet waren.

2.2. Chemikalien und Reagenzien 

Kollagenase aus Clostridium histolyticum (ChC-EC.3.4.23.3), Elastase aus Schweinepankreas (PE-EC 3.4.21.36), N-Succinyl-Ala-Ala-p-nitroanilid, Eisensulfat (FeSO4), Hyaluronsäure-Natriumsalz aus Streptococcus equi, Hyaluronidase aus Rindertests, Pektinase aus Aspergillus niger (EC 3.2.1.15, größer oder gleich 5 Einheiten/mg Protein, optimaler pH-Wert=4.{{20}}, optimale Temperatur=61 ◦C), Cellulase aus Aspergillus niger (EC 3.2.1.4, größer oder gleich 0,3 Einheiten/mg Feststoff, optimaler pH-Wert=6,5, optimale Temperatur {{ 30}}–55 ◦C), Protease aus Aspergillus Saito (EC 3.4.21.112, größer oder gleich 0,6 Einheiten/mg Feststoff, optimaler pH-Wert=5,1, optimale Temperatur=57,2 ◦ C), 2,20 -Azinobis 3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat (ABTS), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazylhydrat (DPPH), 2,4,6 Tripyridyl-s-triazin (TPTZ), 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carbonsäure (Trolox), Rinderserumalbumin, Kojisäure, L -Tyrosin, L-DOPA, Linolsäure, einbasisches Natriumphosphat (NaH2PO4·2H2O), zweibasisches Natriumphosphat und Tyrosinase aus Pilzen wurden von Sigma-Aldrrich (St. Louis, MO, USA). Zusätzlich wurden 37 Prozent Salzsäure, 95 Prozent Ethanol, destilliertes (DI) Wasser, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Methanol von RCI Labscan Co., Ltd. (Bangkok, Thailand) bezogen. Ammoniumthiocyanat (NH4SCN) und Eisenchlorid (FeCl2) wurden von Loba Chemie Pvt. bezogen. Ltd. (Mumbai, Indien). Tris(hydroxymethyl)aminomethan wurde von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen.

2.3. Wässrige enzymatische Extraktion

Kürbiskernöle von C. moschata Duch. Ex Poir und C. moschata (japanischer Kürbis) wurden durch eine wässrige enzymatische Extraktionsmethode unter Verwendung der enzymatischen Hydrolyseparameter aus einer früheren Studie von Kanopka et al. extrahiert. (2016), einschließlich Enzymkonzentration, Enzym-zu-Substrat-Verhältnis, Reaktionstemperatur, pH-Wert und Reaktionszeit [21]. Drei verschiedene Arten von Enzymen, darunter Pektinase, Cellulase und Protease, wurden in einem Gewichtsverhältnis von 1:1:1 kombiniert, um einen konzentrierten Enzymcocktail zu erzeugen. Anschließend wurde der resultierende Konzentratcocktail in entionisiertem Wasser verdünnt, um eine 2 % w/w wässrige Enzymmischung zu erzeugen. Die schalenlosen Kürbiskerne wurden dann in einem Gewichtsverhältnis von 1:1 zu der resultierenden wässrigen Enzymmischung gegeben. Anschließend wurde die Mischung mit einem Moulinex DB81-Mixer bei Raumtemperatur fein gemahlen, bis sie homogen war. Der pH-Wert der resultierenden Aufschlämmung wurde dann mit 0,1 M HCl auf 4,7 eingestellt und 15 Stunden lang bei 54 °C inkubiert. Nachdem die Aufschlämmung auf Raumtemperatur abgekühlt war, wurde sie 10 Minuten lang bei 11.500 x g zentrifugiert. Die obere Schicht der Überstände, die Ölphase, wurde gesammelt. Der beim Extraktionsprozess entstandene Rahm wurde nicht emulgiert, sondern durch Absaugen mit einer Mikropipette entfernt. Der Kürbiskernrückstand wurde durch Filtration durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 unter Vakuum entfernt [21]. Kürbiskernöl von C. moschata Duch. Ex Poir (PSO1) und C. moschata (Japanischer Kürbis) (PSO2) wurden bis zum weiteren Experimentieren in gut verschlossenen, lichtbeständigen Behältern bei Raumtemperatur aufbewahrt.

2.4. Bestimmung der chemischen Zusammensetzung von Kürbiskernöl mithilfe der Fettsäuremethylester/gaschromatographisch-massenspektrometrischen Methode (FAME/GC/MS).

Die Fettsäurezusammensetzung von Kürbiskernöl wurde mithilfe der Fettsäuremethylester/Gaschromatographie-Massenspektrometrie-Methode (FAME/GC/MS) bestimmt. FAME ist eine Art Fettsäureester, der durch säurekatalysierte Umesterung von Fetten mit Methanol gewonnen wird. In dieser Studie wurden Kürbiskernöle (PSO1, PSO2, COM1 und COM2) durch Zugabe von 0,5 M NaOH-Lösung in Methanol bei 100 ◦C für 15 Minuten verseift . Nach dem Abkühlen wurden die Ölproben 1 Minute lang mit Bortrifluorid (BF3) in Methanollösung bei 100 ◦C derivatisiert, um FAME-Produkte zu bilden. Nach dem Abkühlen und der Zugabe von gesättigter NaCl und Hexan wurden die FAME in die Hexanphase aufgeteilt und zur Injektion in Fläschchen gesammelt. Die FAME-Extrakte wurden mithilfe der GC/MS-Technik unter den folgenden Bedingungen analysiert: Kapillarsäulendimension (TR-FAME, Größe 60 m × 0,25 mm, 0,25-µm Partikelgröße), laufendes Temperaturprogramm von 50 °C ; 2 Minuten halten mit Rampe 1-Rate von 10 ◦C/min bis zu 180 ◦C, 15 Minuten halten; Rampe 2 Rate von 4 ◦C/min, Endtemperatur 230 ◦C, Halten 22,50 min. Als Trägergas wurde Helium mit einer Flussrate von 1,0 ml/min verwendet. Die Ölproben wurden im Splitless-Modus (Split-Verhältnis 1:20 und Split-Fellow 20 ml/min) bei 235 °C mit einem Autosampler injiziert. Ein MS-Detektor, der mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (ESI) ausgestattet war und bei 70 eV betrieben wurde, wobei die Temperaturen der Ionenquelle und der Übertragungsleitung auf 200 °C bzw. 220 °C eingestellt waren, zeichnete Massenspektren im m/z-Bereich auf 38–600. Die Zuordnung der analysierten Verbindungen erfolgte durch Vergleich ihrer Massenspektren mit veröffentlichten Daten (National Institute of Standards and Technology, 2008). Die prozentuale Zusammensetzung wurde durch Integration der Peaks in Gesamtionenchromatogrammen (TIC) berechnet. Alle Messungen wurden vom Forschungs- und Servicelabor, The Halal Science Center, Chulalongkorn University, Bangkok, Thailand, gemäß Halal GMP/HACCP und Halal-QHS/ISO 22000 durchgeführt.

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2.5. Bestimmung antioxidativer Aktivitäten

2.5.1. 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl (DPPH) Radikalfänger-Assay

Die DPPH-Radikal-Fängeraktivität (DPPH•) wurde mithilfe der von Chaiyana et al. entwickelten Methode bestimmt. (2017) [27]. Kurz gesagt, 20 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) und in DMSO gelöste Linolsäure wurden mit 180 µL 167 µM ethanolischer DPPH-Lösung in einer 96--Wellplatte gemischt und dann 30 Minuten lang bei inkubiert Raumtemperatur im Dunkeln. Als Positivkontrolle wurde Ascorbinsäure (1 mg/ml) verwendet. Die optische Dichte (OD) wurde bei 520 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Der Prozentsatz der DPPH-Hemmung wurde mit Gleichung (1) berechnet:

DPPH-Hemmung (Prozent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (1)

wobei ODA die OD einer Mischung ist, die entionisiertes Wasser und DPPH·Lösung enthält; B ist die ODB einer Mischung, die DI-Wasser und DMSO enthält; C ist der ODC einer Mischung aus Ölproben und DPPH·Lösung; und ODD ist die OD einer Mischung, die Ölproben und DMSO enthält.

2.5.2. 2,20 -Azino-Bis-3-Ethylbenzthiazolin-6-Sulfonsäure (ABTS)-Assay

Die Abfangaktivität für kationische Radikale (ABTS·plus) von ABTS wurde mit der kolorimetrischen Methode nach Chaiyana et al. gemessen. (2017) und Paradee et al. (2019) [27,28] mit geringfügiger Modifikation. ABTS• plus wurde durch Zugabe von 2 ml 7 mM ABTS mit 3 ml 2,45 mM Kaliumpersulfat erzeugt und 16–24 Stunden lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Das resultierende ABTS• plus wurde anschließend mit Ethanol verdünnt, um eine OD von 0,7 ± 0,1 bei 750 nm zu erhalten. Kurz gesagt, 20 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) und in DMSO gelöste Linolsäure wurden mit 180 µL ABTS• plus ethanolischer Lösung in einer 96--Wellplatte gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert . Die OD wurde bei 750 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. Als Positivkontrolle wurde Ascorbinsäure (1 mg/ml) verwendet. Die Standardkurve wurde durch Auftragen der Absorption bei 750 nm gegen verschiedene Konzentrationen von Trolox im Bereich von 2,5–30 µg/ml erstellt. ABTS• plus Abfangaktivität wurde anhand der Trolox-Standardkurve (R2=0.9922) berechnet und als Trolox-äquivalente Antioxidationskapazität (TEAC) ausgedrückt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt.

2.5.3. FRAP-Assay (Ferric Reducing Antioxidant Power).

Die Eisen reduzierende Antioxidationskraft (FRAP) jeder Probe wurde mithilfe des FRAP-Assays bestimmt, wie in einer früheren Studie von Chaiyana et al. beschrieben. (2017), das von Saeio et al. leicht modifiziert wurde. (2011) [27,29]. FRAP-Reagenz wurde frisch durch Mischen von 300 mM Acetatpuffer (pH 3,6), 10 mM 2,4,6-Tripyridyl-s-triazin (TPTZ) in 40 mM HCl und 20 mM FeCl3 im Verhältnis 10:1:1 erzeugt. In dieser Studie wurden 20 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) und Linolsäure mit 180 µL FRAP-Reagenz in einer 96-Well-Platte gemischt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die OD wurde bei 595 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. Als Positivkontrolle wurde Ascorbinsäure (1 mg/ml) verwendet. Die Standardkurve wurde durch Auftragen der Absorption bei 595 nm gegen verschiedene Konzentrationen von Eisensulfat (FeSO4) im Bereich von 0,003–0,5 mM erstellt. Der FRAP-Wert wurde aus der FeSO4-Standardkurve (R2=0.9965) berechnet und als äquivalente Kapazität (EC1) ausgedrückt. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt.

2.5.4. Eisenthiocyanat (FTC)-Assay

Die Hemmung der Lipidperoxidation wurde mit der Eisenthiocyanat (FTC)-Methode untersucht. Diese Methode wurde gemäß den von Osawa et al. beschriebenen Schritten durchgeführt. (1981) [30] mit geringfügiger Modifikation. Die Mischung bestand aus 50 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) und Linolsäure, 50 µL 50-prozentiger Linolsäure in DMSO und 50 µL 10-prozentiger wässriger Ammoniumthiocyanatlösung (NH4SCN). und 50 µL 2 mM Eisenchlorid (FeCl2). Anschließend wurde die Mischung 1 Stunde lang bei 37 ± 2 °C inkubiert und die OD bei 500 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Mikroplatten-Lesegerät EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. -Tocopherol (0,025–0,1 mg/ml) wurde als Positivkontrolle verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Die Hemmaktivität der Lipidperoxidation wurde mit Gleichung (2) berechnet:
Hemmung der Lipidperoxidation (Prozent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA−ODB)} × 100, (2)
wobei ODA die OD der Mischung ist, die Linolsäure, NH4SCN und FeCl2 enthält; ODB ist die OD von DMSO; ODC ist die OD der Mischung, die Ölproben, Linolsäure, NH4SCN und FeCl2 enthält; und ODD ist die OD der Mischung, die Ölproben und DMSO enthält.

2.6. Bestimmung von Anti-Aging-Aktivitäten

2.6.1. Anti-Hyaluronidase-Aktivität

Die Messung der Anti-Hyaluronidase-Aktivität wurde wie zuvor von Chaiyana et al. beschrieben durchgeführt. (2020) [31]. Zunächst wurden 20 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) mit 100 µL 15 U/ml Hyaluronidase-Lösung gemischt und 10 Minuten bei 37 ◦C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 µL 0,03 % w/v Hyaluronsäure, gelöst in 20 mM Phosphatpuffer (pH 5,35), zugegeben und dann 45 Minuten bei 37 °C inkubiert. Danach wurde 1 ml 0,1-prozentiges Rinderserumalbumin zugegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die OD wurde bei 600 nm mit einem Multimode-Detektor (Beckman Coulter DTX880, Fullerton, CA, USA) bestimmt. Als Positivkontrolle wurde Oleanolsäure (0,25 Prozent w/v) verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Der Prozentsatz der Hyaluronidase-Hemmung wurde mit Gleichung (3) berechnet:

Hyaluronidase-Hemmung (Prozent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (3)
wobei ODA die OD der Mischung ist, die DI-Wasser, Hyaluronidase-Lösung und Hyaluronsäure enthält; ODB ist die OD der Mischung, die DI-Wasser und Phosphatpuffer enthält (pH 5,35); ODC ist die OD der Mischung, die Ölproben, Hyaluronidase-Lösung und Hyaluronsäure enthält; und ODD ist die OD der Mischung, die Ölproben und Phosphatpuffer (pH 5,35) enthält.

2.6.2. Anti-Kollagenase-Aktivität

Die Messung der Anti-Kollagenase-Aktivität wurde gemäß dem von Chaiyana et al. festgelegten Verfahren durchgeführt. (2019) und Thring et al. (2009) mit geringfügigen Modifikationen [32,33]. Kurz gesagt, 20 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) wurden mit 20 µL 0,1 U/ml Kollagenaselösung aus Clostridium histolyticum gemischt und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 80 µL 50 mM Tricin-Puffer (400 mM NaCl und 10 mM CaCl2, pH 7,5) und 40 µL N-[3-(2-furyl) acryloyl]-Leu-Gly- Pro-Ala (FALGPA)-Substratlösung wurde hinzugefügt. Die OD wurde sofort bei 340 nm nachgewiesen und dann 20 Minuten lang kontinuierlich mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. Als Positivkontrolle wurde Oleanolsäure (1 Prozent w/v) verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Der Prozentsatz der Kollagenase-Hemmung wurde mit Gleichung (4) berechnet:

Kollagenasehemmung (Prozent)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (4)
wobei ODA die OD der Mischung ist, die Ölproben, Kollagenaselösung, Tricinpuffer und FALGPA-Substrat enthält; und ODB ist die OD der Mischung, die DMSO, Kollagenaselösung, Tricinpuffer und FALGPA-Substrat enthält.

2.6.3. Anti-Elastase-Aktivität

Die Messung der Anti-Elastase-Aktivität wurde gemäß dem von Chaiyana et al. festgelegten Verfahren durchgeführt. (2019) und Thring et al. (2009) mit geringfügigen Modifikationen [32,33]. Kurz gesagt, 10 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) wurden mit 40 µL 0,03 U/ml Elastaselösung aus Schweinepankreas, dann 50 µL 200 mM Tris-HCL-Puffer (pH 8,0) und 100 µL gemischt 0,8 mM N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-Nitroanilid (AAAPVN)-Substratlösung wurden hinzugefügt. Die OD wurde sofort bei 410 nm nachgewiesen und dann 20 Minuten lang kontinuierlich mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) gemessen. Als Positivkontrolle wurde Oleanolsäure (1 Prozent w/v) verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Der Prozentsatz der Elastase-Hemmung wurde mit Gleichung (5) berechnet:

Elastasehemmung (Prozent)=[(ODA − ODB)/ODA] × 100, (5)
wobei ODA die OD der Mischung ist, die Ölproben, Elastaselösung, Tris-HCl-Puffer und AAAPVN-Substrat enthält; und ODB ist die OD der Mischung, die DMSO, Elastaselösung, Tris-HCl-Puffer und AAAPVN-Substrat enthält.

2.7. Bestimmung der Anti-Tyrosinase-Aktivitäten

Die aufhellende Wirkung eines natürlichen Extrakts wurde durch Messung der Anti-Tyrosinase-Aktivität ermittelt, die nach Saeio et al. durchgeführt wurde. (2011) und Laosirisathian et al. (2020) [29,34]. L-Tyrosin und L-DOPA waren in dieser Studie die Substrate des Tyrosinase-Enzyms. Kurz gesagt, 10 µL Ölproben (PSO1, PSO2, COM1, COM2) wurden mit 30 µL Tyrosinase in einer 96-Well-Platte gemischt und dann 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 100 µL des Substrats, das 2,5 mM L-Tyrosin oder L-DOPA enthält, hinzugefügt und 30 Minuten lang inkubiert. Die OD wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät (Microplate Readers EZ Read 2000, Biochrome, England) bestimmt. Als Positivkontrolle wurde Kojisäure (20 µg/ml) verwendet. Die Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und in drei unabhängigen Versuchen durchgeführt. Der Prozentsatz der Tyrosinase-Hemmung wurde mit Gleichung (6) berechnet:

Tyrosinase-Hemmung (Prozent)={[(ODA − ODB) − (ODC − ODD)]/(ODA − ODB)} × 100, (6)
wobei ODA die OD der Mischung ist, die DMSO, Tyrosinase-Enzym und L-Tyrosin enthält; ODB ist die OD der Mischung, die Tyrosinase-Enzym und PBS mit einem pH-Wert von 6,8 enthält; ODC ist die OD der Mischung, die Ölproben, Tyrosinase-Enzym und L-Tyrosin enthält; und ODD ist die OD der Mischung, die Ölproben, Tyrosinase-Enzym und PBS mit einem pH-Wert von 6,8 enthält.

2.8. Statistische Analyse

Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) analysiert, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test mit GraphPad Prism (Version 8.0, GraphPad Software), und p < 0.05 wurde berücksichtigt statistisch signifikant.

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3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Kürbiskernöl-Charakter

In dieser Studie verwendeten wir eine wässrige enzymatische Extraktion anstelle der Extraktion mit organischen Lösungsmitteln, um Kürbiskernöl aus C. moschata Duch zu extrahieren. Ex Poir (PSO1) und C. moschata (PSO2), weil es ein einfacher, effektiver und produktiver Prozess ist [15,21]. PSO1 war eine dunkelbraune Flüssigkeit mit niedriger Viskosität, während PSO2 eine grünlich-braune Flüssigkeit mit niedriger Viskosität war. Beide Kürbiskernöle hatten ihren charakteristischen Geruch. Die Ausbeuten an PSO1 und PSO2 betrugen 17,7 Vol.-% bzw. 15,6 Vol.-%. Berichten zufolge enthalten Kürbiskerne neben dem Öl auch eine Vielzahl weiterer Nährstoffe. Die ungefähre Zusammensetzung von C. moschata bestand hauptsächlich aus Kohlenhydraten (39,51 Prozent), gefolgt von Fett (28,49 Prozent), Protein (19,23 Prozent), Wasser (7,67 Prozent) und Asche (5,18 Prozent) [35]. Im Vergleich zu früheren Studien mit Lösungsmittel- und mechanischem Pressen ergab die vorliegende Studie jedoch geringere Ausbeuten an C. moschata-Öl. Obwohl die Lösungsmittelextraktion als die effektivste Ölextraktionsmethode beschrieben wurde, mit der bis zu 98 Prozent der Öle aus Samen extrahiert werden, gibt es einige Probleme hinsichtlich Lösungsmittelrückständen und der Reinheit des produzierten Öls [36]. Darüber hinaus beeinflusste das im Extraktionsprozess verwendete Lösungsmittel die Ausbeute des erzeugten Öls. Die Extraktion mit Hexan, Petrolether, Petroleumbenzol, Cyclohexan, Isopropylether, Ethylacetat, Tetrahydrofuran, Propan-2-ol und Aceton ergab 43,4–64,4 Prozent [37,38]. Daher war die Kaltpressung der Lösungsmittelextraktion vorzuziehen. Allerdings kann eine Kaltpressung in der Anfangsphase der Verwendung einer Schneckenpresse zu einigen Schwierigkeiten führen [39]. Daher könnte die wässrige enzymatische Extraktion eine alternative Extraktionsmethode sein, da sie im Vergleich zu kaltgepresstem Öl (33,5 Prozent) einen höheren Kürbiskernölgehalt (36,0 Prozent) lieferte [21]. Obwohl der Prozess der wässrigen enzymatischen Extraktion komplizierter war als die Kaltpressung, ist er mit relativ geringeren Investitionskosten, einer kontinuierlichen Senkung der Kosten kommerzieller Enzympräparate, der Möglichkeit zur gleichzeitigen Isolierung einzigartiger und wertvoller phytochemischer Komponenten sowie der Behandlung verbunden der weit verbreitete Wunsch nach der Implementierung grüner Technologien [21]. In vorläufigen Studien wurde beschrieben, dass verschiedene Enzyme wie Cellulasen, Pektinasen, Hemicellulase und Proteasen häufig zur Zerstörung der Zellwandstruktur von Pflanzen eingesetzt werden, um die bioaktive Extraktion aus Pflanzen zu verbessern [16,17]. Aus diesem Grund haben wir diese Studie so konzipiert, dass Samenöl mithilfe einer Enzymmischung aus Pektinase, Cellulase und Protease (1:1:1) extrahiert wird, wie zuvor von Kanopka et al. beschrieben. (2016), der die enzymatischen Hydrolysebedingungen optimierte, um die höchste Ausbeute an Kürbiskernöl zu erzielen [21]. Darüber hinaus zeigt diese Methode sicherere und umweltfreundlichere Alternativen zur Lösungsmittelextraktion auf, die hier als „grüne Extraktion“ bezeichnet wird.

3.2. Chemische Zusammensetzung von Kürbiskernöl

Zur Analyse der Fettsäurezusammensetzung wurde Kürbiskernöl mittels wässriger enzymatischer Extraktion (PSO1 und PSO2) zusammen mit kommerziellem Kürbiskernöl (COM1 und COM2), das durch Kaltpressextraktion hergestellt wurde, verglichen und analysiert. Die Fettsäurezusammensetzungen von PSO1, PSO2, COM1 und COM2 sind in Tabelle 1 aufgeführt. Alle Kürbiskernölproben bestanden aus mehrfach ungesättigten (PUFA), einfach ungesättigten (MUFA) und gesättigten Fettsäuren. Cis-Linolsäure (C18:2) war der Hauptbestandteil in allen Ölproben. COM2 enthielt den höchsten Fettsäuregehalt (51,74 Prozent), gefolgt von COM1 (48,00 Prozent), PSO1 (39,09 Prozent) und PSO2 (37,63 Prozent). Ebenso war cis-Ölsäure (C18:1) in einem hohen Prozentsatz vorhanden, insbesondere in PSO2 (37,45 Prozent), gefolgt von COM1 (33,39 Prozent), PSO1 (31,22 Prozent) und COM2 (28,64 Prozent). Gesättigte Fettsäuren wie Palmitinsäure (C16:0) und Stearinsäure (C18:0) wurden in jeder der Ölproben nur in geringen Mengen gefunden. Spuren anderer PUFA, MUFA und gesättigter Fettsäuren wurden ebenfalls beobachtet und identifiziert.

In der Literatur ist Linolsäure auch als Omega-6 bekannt, eine essentielle Fettsäure, die vom menschlichen Körper nicht synthetisiert werden kann, sondern nur über die Nahrung aufgenommen wird. Linolsäure ist ein wichtiger Nährstoff für die Gesundheitsfunktionen des Menschen und eine Vorstufe von Ceramiden, einem Hauptbestandteil von Zellmembranen, Vitamin D und einer Vielzahl von Hormonen [40,41]. Tierstudien haben gezeigt, dass ein Linolsäuremangel zu schuppiger und juckender Haut führen kann [23]. Darüber hinaus unterstützt Linolsäure aus Pflanzenöl die Wundheilung der Haut und beugt Hautentzündungen und Akne vor [23]. Darüber hinaus hat sich Ölsäure oder Omega--9 bei der Vorbeugung von Krebs, Autoimmun- und Entzündungskrankheiten als vorteilhaft erwiesen [42]. Tatsächlich reduzierte Ölsäure die Stickoxidproduktion an der Wundstelle erheblich, was zu einem schnelleren Wundverschluss führte [43]. Diese Daten belegen, dass Kürbiskernöl, das Linolsäure (Omega-6) ​​und Ölsäure (Omega-9) anreichert, potenzielle gesundheitliche Vorteile aufweist.

cistanche tubulosa

Unseren Erkenntnissen zufolge bestand Kürbiskernöl (PSO1, PSO2, COM1 und COM2) aus vielen Fettsäuren, darunter Linolsäure (C18:2), Ölsäure (C18:2) und Palmitinsäure (C16:0). und Stearinsäure (C18:0), die häufige Bestandteile von Kürbiskernöl sind [44]. Linolsäure (Omega-6) und Ölsäure (Omega-9) waren in allen Ölproben dominant. Die höchste Menge an Linolsäure war COM2, gefolgt von COM1, PSO1 bzw. PSO2. Außerdem war PSO2 die höchste Menge an Ölsäure, gefolgt von COM1, PSO1 und COM2. Diese Ergebnisse erklären, dass die wässrige enzymatische Extraktion von Kürbiskernöl einen etwas geringeren Linolsäuregehalt aufwies, jedoch keinen Ölsäuregehalt als die Kaltpressextraktion. Der Grund für den geringeren Gehalt an Linolsäure in Kürbiskernen aus wässriger enzymatischer Extraktion als in kommerziellen Ölproben war ein Unterschied im Extraktionsverfahren. Frühere Studien haben Unstimmigkeiten in der Menge an ungesättigten Fettsäuren, insbesondere Ölsäure und Linolsäure, in Kürbiskernölen aus verschiedenen Extraktionen festgestellt [39]. Der Gehalt an Ölsäure lag zwischen 28,19 Prozent in kaltgepresstem Kürbiskernöl und 30,56 Prozent in mit Pentan extrahiertem Kürbiskernöl, während der Gehalt an Linolsäure zwischen 43,86 Prozent in mit Pentan extrahiertem Kürbiskernöl lag auf 46,67 Prozent in kaltgepresstem Kürbiskernöl [39]. Neben unterschiedlichen Extraktionsmethoden beeinflussten auch die im Extraktionsprozess verwendeten Lösungsmittel und die Temperatur während der Samenreifung den Linolsäuregehalt von Pflanzensamen. In einer früheren Studie wurde hervorgehoben, dass Petrolether Leinöl mit niedrigem Linolsäuregehalt (26,2 Prozent) ergab, während n-Hexan mit einem Linolsäuregehalt von 46,5 Prozent widersprüchliche Ergebnisse lieferte [45]. Darüber hinaus ist Linolsäure während der Reifung von Sonnenblumenkernen umgekehrt proportional zur Temperatur [46].

Darüber hinaus ergab eine relative Studie, dass die chemische Zusammensetzung in Bezug auf die Fettsäurezusammensetzung ergab, dass Linolsäure und Ölsäure zu 47,45 Prozent bzw. 35 Prozent in Kürbiskernöl (C. maxima) vorhanden waren, das mit Diethylether extrahiert wurde [47]. . Laut Akin et al. (2018) lag der Gehalt an Linolsäure zwischen 53,19 Prozent und 53,27 Prozent, gefolgt von Ölsäure, die ebenfalls in hohen Mengen zwischen 27,52 Prozent und 27,59 Prozent in der kaltgepressten C. pepo L.-Samenölextraktion vorhanden war [48 ]. Daher erzielte die wässrige enzymatische Extraktion in dieser Studie auch geringere Ausbeuten an Fettsäuren als die in früheren Studien erwähnte Lösungsmittelextraktion und Kaltpressextraktion. Im Sortenvergleich stellten wir fest, dass PSO1 (C. moschata Duch. Ex Poir) eine höhere Menge an Linolsäure aufwies als PSO2 (C. moschata oder japanischer Kürbis). Im Gegensatz dazu wies PSO2 eine höhere Menge an Ölsäure auf als PSO1. Wichtig ist, dass Unterschiede in den Fettsäureprofilen und Mengen an Kürbiskernöl von der Herkunft bestimmter Sorten, den klimatischen Bedingungen und dem Management nach der Ernte abhingen [49]. Abgesehen von Unterschieden in den Fettsäureprofilen von Kürbiskernölen, die durch verschiedene Extraktionsmethoden gewonnen wurden, wurde berichtet, dass die Öle aus wässriger Enzymtechnologie reich an Phytosterol und Tocopherol sind [50]. Als alternative Kürbiskernöle für weitere Anwendungen werden daher PSO1 und PSO2 vorgeschlagen, die nach dem Grünextraktionsverfahren hergestellt wurden.


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