Immunantworten des Wirts auf Oberflächen-S-Layer-Proteine ​​(SLPs) von Clostridioides Difficile

Abstrakt:

Clostridioides difficile, ein nosokomialer Erreger, ist ein neu auftretender Darmpathobiont, der Antibiotika-assoziierten Durchfall verursacht. Bei einer Infektion mit C. difficile kommt es zu einer Kolonisierung des Darms und einer Störung der Darmepithelbarriere, was zur Auslösung von Entzündungs-/Immunreaktionen führt. Die Expression zweier wichtiger Exotoxine, TcdA und TcdB, ist die Hauptursache für die Pathogenität von C. difficile. Die Bindung von in Bakterien reichlich vorhandenen Zellwandproteinen oder Oberflächen-S-Layer-Proteinen (SLPs) wie SlpA an Wirtsepithelzellen ist für die Virulenz von entscheidender Bedeutung. Diese Oberflächenbestandteile sind nicht nur Toxine, sondern haben sich auch als stark immunogen erwiesen. Aktuelle Studien weisen darauf hin, dass SLPs von C. difficile eine wichtige Rolle bei der Adhäsion der Bakterien an die Darmepithelzellen, der Störung enger Verbindungen und der Modulation der Immunantwort der Wirtszellen spielen. Diese Proteine ​​könnten als neue Angriffspunkte für Impfstoffe und neue Therapeutika dienen. Diese Übersicht fasst unser aktuelles Verständnis der immunologischen Rolle von SLPs bei der Induktion der Wirtsimmunität und ihrer Verwendung bei der Entwicklung von Impfstoffen und neuartigen Therapeutika zur Bekämpfung von C. difficile-Infektionen zusammen.

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Schlüsselwörter:

Antibiotika-assoziierter Durchfall; Zellwandproteine; Therapeutika; S-Layer-Proteine; Impfstoff

1. Einleitung

Clostridioides difficile, ein toxinproduzierendes anaerobes Bakterium, ist ein wichtiger opportunistischer und nosokomialer Pathobiont im Darm, der Krankheitssymptome aufgrund von Störungen im gesunden Mikrobiom aufgrund einer Vielzahl von Faktoren verursacht, darunter Antibiotikaeinsatz, genetische, Exposom-, mikrobielle, und andere Wirtsfaktoren [1]. Die Selektion und Vermehrung von C. difficile löst den lebensbedrohlichen Zustand einer pseudomembranösen Kolitis aus [2,3]. Nach den neuesten Schätzungen aus dem Bericht des Centers for Disease Control and Prevention aus dem Jahr 2019 verursachte C. difficile im Jahr 2017 223.900 Infektionen und 12.800 Todesfälle, was allein in den Vereinigten Staaten einen Verlust von 1 Milliarde US-Dollar bedeutete [4]. Die Behandlung der ersten Episode einer C. difficile-Infektion (CDI) erfolgt mit Antibiotika. Die Erkrankung weist jedoch eine hohe Rezidivrate auf – 20–30 % nach der ersten Behandlung einer anfänglichen CDI und mehr als 50 % nach dem ersten Rezidiv [5]. Daher ist eine dringende therapeutische Intervention erforderlich, um CDI weltweit zu bekämpfen. Einer der wichtigsten molekularen Faktoren für die Pathogenese von C. difficile ist die Expression und Sekretion von zwei Haupttoxinen, TcdA und TcdB, die von den Genen kodiert werden, die sich innerhalb eines 19,{18}kb großen Pathogenitätsorts (PaLoc) in C. difficile befinden Genom [6]. Die Regulierung der Toxinproduktion und die verschiedenen Transkriptionsfaktoren, die an der Toxinproduktion beteiligt sind, wurden von Chandra et al. ausführlich besprochen. anderswo [6].

Die CDI-Pathogenese beginnt mit der Aufnahme/Keimung von C. difficile-Sporen in vegetative Zellen, die im Darm keimen, wo sie sich vermehren und die Darmschleimhaut besiedeln [1,6]. Die Darmschleimhautbarriere (IMB) ist die erste angeborene Verteidigungslinie gegen Pathobionten. Das Wirts-IMB besteht aus verschiedenen Arten von Epithelzellen, die durch enge Verbindungen fest miteinander verbunden und mit einer dicken schützenden Schleimschicht bedeckt sind, die von Becherzellen abgesondert wird [1]. Eine Störung des IMB ermöglicht es C. difficile, sich an der Oberfläche der Epithelzellen anzuheften, wo die Entwicklung seiner Virulenzfaktoren zur Schädigung und Manifestation der Pathogenität von C. difficile führt [1,6]. Die bakterielle Zellwand vieler Gram-positiver und -negativer Arten, einschließlich C. difficile, ist mit einer reichlich vorhandenen, oberflächenexponierten Schicht aus Proteinmolekülen verbunden, die als Oberflächenschichtproteine ​​(S-Layer-Proteine ​​oder SLPs) bezeichnet werden und vorwiegend aus reichlich vorhandenem Protein bestehen Das Protein SlpA besteht aus einer Domäne mit niedrigem und hohem Molekulargewicht, die elektronenmikroskopisch als parakristalline regelmäßige zweidimensionale Anordnung angeordnet sind [7]. Andere Komponenten des Zellwandproteins (Cwp) der SLP-Schicht sind weniger häufig und schlecht charakterisiert, spielen aber ebenfalls eine wichtige Rolle bei der CD-Pathogenität. In den letzten Jahren hat die Forschung zu SLPs zunehmend an Aufmerksamkeit gewonnen, da gezeigt wurde, dass diese Proteine ​​neben ihrer Rolle als Teil der Immunantwort des Wirts eine Schlüsselrolle bei der Oberflächenadhäsion, der Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren, der Induktion der Zytokinproduktion und der Aktivierung von Inflammasomen spielen Rolle für das Wachstum und Überleben des Bakteriums [7–9].

In diesem Aufsatz diskutieren wir die Immunantwort des Wirts auf die wichtigsten SlpA-Komponenten und andere weniger häufig vorkommende Cwps im Lichte der jüngsten Erkenntnisse über C. difficile-SLPs und heben deren Potenzial für die Verwendung als neuartiger Impfstoff und therapeutisches Ziel hervor, das für die CDI-Pathogenese von hoher Relevanz ist.

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2. Angeborene Immunantworten des Wirts gegen CDI

Es wurde gezeigt, dass nicht toxigene C. difficile (NTCD)-Stämme bei der Kolonisierung in Tiermodellen Schutz gegen die pathogenen Stämme von C. difficile bieten. In den frühen 1980er Jahren berichteten Wilson und Sheagren, dass Hamster, die nach der Sterilisation mit dem Antibiotikum Cefoxitin von einem NTCD-Stamm besiedelt wurden, geschützt waren, wenn sie einem toxigenen C. difficile (TCD)-Stamm ausgesetzt wurden [10]. Die Behandlung mit anderen Arten, wie C. perfringens, C. bifermentans, C. beijerincki, C. sporogenes und einem durch Hitze abgetöteten, nicht toxigenen C. difficile NTCD-Stamm, schützte jedoch nicht vor CDI. Darüber hinaus ging der Schutz verloren, als das kolonisierende NTCD vor der Belastung mit Vancomycin-Behandlung sterilisiert wurde [11]. Ermutigt durch diese Erkenntnisse wurden Sporen des NTCD-M1-Stamms bei einer begrenzten Anzahl klinischer Patienten mit rezidivierendem CDI (rCDI) mit beträchtlichem Erfolg (ca. 50 %) eingesetzt [12]. Derzeit sind die Behandlungsmöglichkeiten für CDI begrenzt und basieren stark auf dem Einsatz von Antibiotika wie Vancomycin, Fidaxomicin und Metronidazol [13,14]. Übermäßiger Einsatz von Antibiotika führt zu einer Dysbiose des gesunden Mikrobioms und unterstützt außerdem die Auswahl von Pathobionten wie C. difficile, die später einen Rückfall erleiden können [1,15]. Um diese Herausforderungen wirksam zu umgehen, müssen alternative Behandlungsmethoden umgehend behandelt werden. Einige dieser Behandlungsoptionen umfassen die Neutralisierung von C. difficile-Toxinen mithilfe monoklonaler Antikörper gegen TcdB, wie beispielsweise die Infusion von Bezlotoxumab, die die durch Toxine verursachte Schädigung des Darmepithels verhindert [16]. Eine weitere faszinierende Methode ist die Wiederherstellung eines gesunden Mikrobioms mithilfe einer fäkalen Mikrobiota-Transplantation (FMT) von einem gesunden Spender unter unmittelbaren Familienmitgliedern. FMT hat vielversprechende Ergebnisse gegen wiederkehrende CDI mit Erfolgsraten von bis zu 90 % gezeigt [17,18]. Leider befassten sich diese Studien nicht mit der Rolle der Immunantwort des Wirts beim Schutz dieser Patienten. Daher kann argumentiert werden, dass lebendes NTCD einige Antigene/Zellwandkomponenten absondert, die eine starke Immunantwort gegen das toxigene TCD auslösen. Ebenso ist der FMT-Schutz schlecht definiert. Daher könnte das Verständnis, wie die Einführung von FMT Wirtsreaktionen auslöst, bei der Identifizierung von Schlüsselantigenen hilfreich sein, was wiederum zu einem besseren Verständnis der Immunantwort und der Entwicklung neuartiger Impfstoffe gegen CDI beitragen kann.

Im Darm ist das angeborene Immunsystem des Wirts die erste Verteidigungslinie gegen einen eindringenden Krankheitserreger, der eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung und dem Aufbau einer robusten adaptiven Immunantwort des Wirts spielt [1]. Die angeborene Reaktion besteht hauptsächlich aus drei Teilen: (i) dem Darmepithel und der Schleimhautschicht (physikalische Barriere), (ii) antimikrobiellen Peptiden, die das Ausscheidungsprodukt von Epithelzellen, Paneth-Zellen und einigen Mitgliedern der Darmmikrobiota sind (chemische). Barriere) und (iii) zelluläre Reaktionen durch Rekrutierung angeborener Immunzellen wie Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen, angeborene lymphoide Zellen (ILCs) und dendritische Zellen (DCs), die durch mehrere angeborene Signalwege zur Bekämpfung des eindringenden Krankheitserregers koordiniert werden [ 1]. Wirtszellen tragen auf ihrer Oberfläche Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), wie z. B. TLRs, die bestimmte konservierte bakterielle Signaturen auf Mikroben erkennen, die als Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) bezeichnet werden. Diese PRRs werden auch als Toll-like-Rezeptoren (TLRs) bezeichnet. Bei Erkennung dieser Gefahrensignale (PAMPs) durch TLRs löst die Wirtszelle eine Immunantwort aus. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass der Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4) Gefahrensignale von C. difficile erkennt, eine Aktion, die an der Auslösung der Entzündungsreaktion des Wirts beteiligt ist. In diesem Zusammenhang wurde gezeigt, dass SLPs von C. difficile mit dem TLR-4 des Wirts interagieren, während Flagellen von C. difficile über TLR5 interagieren [19,20].

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3. S-Layer-Proteine ​​(SLPs) in C. difficile

Im letzten Jahrzehnt haben die Proteine ​​der Oberflächenschicht (S-Schicht) von C. difficile große Aufmerksamkeit erhalten. SLPs wurden erstmals von Kawata et al. identifiziert. im Jahr 1984 und machen etwa 15 % der gesamten Zellmasse aus [21,22]. SLPs kommen in vielen verschiedenen prokaryotischen Arten vor. Die meisten SLPs sind auf der äußersten Oberfläche der Zellen als einzelnes Protein in einer zweidimensionalen parakristallinen Anordnung angeordnet [7]. Bei C. difficile besteht die S-Schicht hauptsächlich aus den heterodimeren SlpA-Proteinen. SlpA ist ein Heterodimer, das aus einem Protein mit hohem Molekulargewicht (HMW) und einem Protein mit niedrigem Molekulargewicht (LMW) besteht und von einem einzelnen slpA-Gen kodiert wird. Das LMW-SLP bildet die freiliegende obere Schicht, während das HMW-SLP die untere Schicht bildet. Das LMW-SLP ist einzigartig bei C. difficile. Im Stamm C. difficile 630 ist der slpA-Locus eine 36,6 kb große Region, die 11 slpA-Paralogs beherbergt. Darüber hinaus gibt es weitere 17 Paraloge, die über das gesamte Genom verstreut sind [23,24]. Diese Paralog-Gene werden jetzt als clostridiale Zellwandproteine ​​(CwpX) bezeichnet, wobei X die identifizierte Paralog-Nummer bezeichnet (X=1–29) und in Tabelle 1 beschrieben ist. Cwp84 und CwpV wurden benannt, bevor diese neue Namenskonvention übernommen wurde [23]. Alle Cwps sind typische Proteine, die ein N-terminales Signalpeptid und drei mutmaßliche Zellwandbindungsdomänen mit signifikanter Ähnlichkeit zu HMW SLP enthalten [25,26]. Verschiedene C. difficile-Stämme zeigten Variationen im slpA-Locus und es wurden etwa 12 verschiedene S-Layer-Kassettentypen dokumentiert. Die anderen 28 Cwps fungieren als akzessorische Komponenten, die in der polymerisierten parakristallinen Schicht verankert sind, die etwa 5–20 % der S-Schicht ausmacht [7].

Tabelle 1. Mutmaßliche Funktionen der 29 Cup-Gene, die in den 630-Genomen von Clostridium difficile gefunden wurden.

Tabelle 1. Forts.

4. Expression und Stammvariation von Zellwandproteinen

Im C. difficile-Stamm 630 wurde berichtet, dass etwa neun Cwps-kodierende Gene exprimiert werden [25]. Während die Gene cwp2, cwp84, cwp6, cwp12, cwpV, cwp24 und cwp25 unter normalen Wachstumsbedingungen auf der Oberfläche der Zelle exprimiert werden (44), wurden die Gene cwp66 und cwp5 exprimiert, aber nicht in Zelloberflächenextrakten gefunden. In einer separaten Studie haben Biazzo et al. analysierte Becher, die über das gesamte Genom von C. difficile verstreut sind. Sie beobachteten, dass die Gene cwp13, cwpV, cwp16, cwp18, cwp19, cwp20, cwp22, cwp24 und cwp25 exprimiert werden und gut konservierte Sequenzen aufweisen, während die Gene cwp17, cwp26, cwp27, cwp28 und cwp29 signifikante Unterschiede in den Expressionsniveaus aufwiesen Ribotypen und waren weniger konserviert [45]. Viele slpA-Locus-Gene weisen erhebliche Unterschiede zwischen den Stämmen auf, insbesondere in den oberflächenexponierten Regionen. Beispielsweise wurde gezeigt, dass slpA, cwp66, secA2 und cwp2 eine hohe Variation innerhalb des slpA-Locus aufweisen (der eine 10-kb-Kassette bildet); Bisher wurden 12 divergente Varianten dieser Kassette als Ergebnis einer homologen Rekombination zwischen verschiedenen Genotypen gefunden [46]. Laut Karjalainen et al. weist cwp66 nur 33 % Identität zwischen den Stämmen auf [26]. Die cwp2-Variante wurde durch einen 23,8 kb großen vorhergesagten S-Layer-Glykosylierungs-Gencluster im slpA-Locus ersetzt (46). SlpA ist das am häufigsten vorkommende SLP in Zelloberflächenextrakten von C. difficile und der Hauptbestandteil von C. difficile SLP. Das reife Protein wird nach der Sekretion in HMW- und LMW-Proteinformen durch die Wirkung einer Protease Cwp84 gespalten, um den heterodimeren Komplex H/L-Komplex zu bilden, der zur Bildung der S-Schicht polymerisiert [47] (Abbildung 1). Die Inaktivierung des cwp84-Gens in C. difficile 630∆erm führte zu einer S-Schicht, die nur aus einem unreifen einkettigen SlpA mit veränderter Koloniemorphologie bestand, was auf eine wichtige Rolle von Cwp84 bei der Bildung der reifen S-Schicht hindeutet [32]. Das Vorhandensein des secA2-Gens im slpA-Locus ist wichtig für den Transport von SlpA und anderen Cwps durch die Zytoplasmamembran [48].

Abbildung 1. Die SLPs von C. difficile vermitteln die Adhäsion und Aktivierung der Immunzellen. Das entstehende SlpA-Peptid wird durch die Protease Cwp84 in die LMW- und HMW-Untereinheit gespalten, die den reifen SlpA-Komplex der SLP-Schicht der Zellwand bildet [31–33]. SLPs vermitteln die Adhäsion über TLR4, stören die enge Verbindung der Darmepithelzellen und aktivieren weiter dendritische Zellen/Makrophagen, die wiederum verschiedene Zytokine und Chemokine produzieren, was zur Induktion von Th1/Th2 und einer humoralen Reaktion führt [9,27]. Interleukin (IL), dendritische Zellen (DC), niedriges Molekulargewicht (LMW), hohes Molekulargewicht (HMW), Toll-like-Rezeptor 4 (TLR4).

5. Funktionen von S-Layer-Proteinen

SLPs sind an verschiedenen Funktionen in der Biologie von C. difficile beteiligt (siehe Tabelle 1), wie z. B. Zellintegrität, Transport, Bildung von Poren und Ankern, Abbau, Adhäsion/Invasion von Wirtszellen, Umgehung des Immunsystems und Schutz vor konkurrierenden Mikroorganismen (22). . Pechineet al. fanden Antikörper gegen die N-terminalen und C-terminalen Domänen des Cwp66-Antigens in den Seren von Patienten mit Clostridium difficile-assoziierter Erkrankung (CDAD) [49]. In einer anderen Studie haben Wright et al. trennten die Cwps mittels 2D-PAGE und identifizierten mehrere Cwps (SlpA, Cwp2, Cwp5, Cwp84, Cwp18, Cwp19), die mit Patientenseren reagierten, die mit dem Stamm C. difficile Ribotyp 017 infiziert waren, was auf die Induktion einer starken Immunantwort gegen SLPs schließen lässt [50]. Kürzlich haben Kirk et al. identifizierten zwei C. difficile-Stämme, denen eine S-Schicht fehlte und die nicht anfällig für Bakteriocin waren, das Poren bildet und die konkurrierenden Bakterienzellen depolarisiert. Allerdings zeigten diese C. difficile-Stämme eine deutlich erhöhte Anfälligkeit gegenüber Lysozym und dem antimikrobiellen Peptid LL-37 und erzeugten in einem Hamster-Infektionsmodell keine Krankheitssymptome von CDI [51]. Eine aktuelle Studie untersuchte die Auswirkungen von SlpA, das aus drei toxikogenen Stämmen (RT126, RT001, RT084) isoliert wurde, auf die Expression von Tight Junction (TJ)-Proteinen und die Induktion entzündungsfördernder Zytokine in der menschlichen Kolonkarzinomzelllinie HT-29 . Die SlpA-Behandlung verringerte die Expressionsniveaus der Claudine-Familie und der JAM-A-Tight-Junction-Proteine ​​​​signifikant (Abbildung 1) [9]. Darüber hinaus erhöhte das SlpA-Protein die Expressionsniveaus von TLR-4 und induzierte die Sekretion von TNF-, IL-1 und IL-8. Diese Ergebnisse zeigen, dass das SlpA-Protein die Pathogenese vermittelt und Entzündungsreaktionen im Darm hervorruft [9]. Daher ist es vernünftig zu argumentieren, dass SLPs für die Pathogenität und Immunantwort von C. difficile essentiell sind.

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6. Immunantwort auf SLPs

Jüngste Untersuchungen haben die wichtige Rolle von SlpA nicht nur für das Überleben und Wachstum von Bakterien, sondern auch für die Gestaltung der Immunantwort des Wirts aufgezeigt. Immunproteomische Ansätze haben das Vorhandensein von Anti-SLP-Antikörpern in den Seren von sechs mit C. difficile Ribotyp 017 infizierten Patienten gezeigt, was darauf hindeutet, dass SLP-Proteine ​​immundominant sind und während der Infektion exprimiert werden [50]. Eine Studie unter der Leitung von Bruxelles et al. zeigten bei CDI-Patienten einen erhöhten Spiegel an Anti-SlpA-Antikörpern im Vergleich zu gesunden Patienten [52]. In einer anderen Studie haben Negm et al. konnten in Seren von insgesamt 327 Personen mit CDI IgG-Antikörper gegen SLP-Extrakte verschiedener C. difficile-Stämme nachweisen [53]. Zusätzlich zu SlpA ist die exponierte C-terminale Domäne des zweithäufigsten Proteins Cwp66 sehr variabel, während die N-terminale Domäne gut konserviert ist. Es wurde gezeigt, dass die variablen C-terminalen Domänen von Cwp66 und Cwp84 beim Menschen immunogen sind [49,54]. Darüber hinaus waren bei CDI-Patienten die mittleren Gesamt-Anti-Cwp66- und Anti-Cwp84-Spiegel niedriger als bei der gesunden Kontrollgruppe, was auf die schützende Wirkung der Antikörper schließen lässt. Daher spielen SLPs, insbesondere SlpA, und andere Komponenten eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr und sind potenzielle Ziele für die Entwicklung von Immuntherapeutika und Impfstoffen, wie in den folgenden Abschnitten beschrieben.

7. SLPs vermitteln die Adhäsion von C. difficile

C. difficile löst eine Infektion aus, indem es sich an die Darmepithelzellen anheftet und so zur Kolonisierung führt. In dieser Hinsicht spielen bakterielle SLPs wie SlpA und Cwp66 eine entscheidende Rolle bei der Adhäsion. Es wurde berichtet, dass Variationen bei SLPs, insbesondere SlpA, in isolierten C. difficile-Stämmen Veränderungen in der Adhärenz zeigten [55]. Es wurde gezeigt, dass SLPs verschiedene Zelllinien binden, beispielsweise menschliche Magen-Darm-Zelllinien von Hep-2- und Vero-Zellen sowie viele Proteine ​​der extrazellulären Matrix. Darüber hinaus hemmte die Behandlung mit Anti-HMW-SLP-Antikörpern die Adhärenz von C. difficile. Darüber hinaus verhinderte die Vorbehandlung der Wirtszellen entweder mit gereinigten SlpA-Untereinheiten oder Anti-SlpA-Antikörpern auch die Adhäsion von C. difficile [55]. Das größte Mitglied der SlpA-Proteinfamilie ist das CwpV-Protein, das phasenvariabel exprimiert wird. In einer separaten Studie wurde gezeigt, dass die C-terminale repetitive Domäne des CwpV-Proteins die Aggregation von C. difficile vermittelt. Darüber hinaus variiert diese Domäne zwischen den Stämmen und es wurden fünf antigenisch unterschiedliche Wiederholungstypen identifiziert [40].

Es wurde gezeigt, dass ein weiteres immunogenes Protein namens Cwp66 Adhäsionseigenschaften besitzt. Gereinigtes Cwp66 und Antikörper gegen die N-terminalen und C-terminalen Domänen inhibierten die Adhäsion von C. difficile an kultivierte Vero-Zellen, was auf die Adhäsionseigenschaften von Cwp66 schließen lässt [29].

8. Auslösung entzündlicher Reaktionen

Bianco et al. demonstrierten die Rolle von SLPs im Entzündungsprozess. In dieser Studie wurden die SLPs von hypervirulenten und epidemischen (H/E) oder nicht-H/E-C. difficile-Stämmen gereinigt und in menschlichen Monozyten und von Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen (MDDCs) im Hinblick auf die Induktion immunmodulatorischer Zytokine [Interleukin] untersucht (IL)-1 , IL-6 und IL- 10] [56]. Die Studie zeigte, dass SLPs nicht nur die Reifung von MDDCs mit erhöhter Antigen-präsentierender Aktivität induzierten, sondern auch die Sekretion hoher IL-10-Spiegel induzierten. Es wurden jedoch keine signifikanten Unterschiede in der Aktivierung von Monozyten und MDDCs durch SLP-Präparate aus H/E- und Nicht-H/E-Stämmen gefunden, was darauf hindeutet, dass SLPs nicht zur erhöhten Schwere der Erkrankung beitragen [56]. In einer anderen Studie haben Ausiello et al. extrahierten SLPs aus dem klinischen Isolat C253 und zeigten, dass SLPs die Sekretion erhöhter Mengen an IL-1- und IL-6-proinflammatorischen Zytokinen in ruhenden Monozyten induzierten, die Reifung menschlicher MDDCs induzierten und die Proliferation von T Zellen [57]. Darüber hinaus setzten diese behandelten MDDCs auch erhöhte Mengen an IL-10 und IL-12p70 frei und induzierten eine gemischte Th1/Th2-Immunantwort. TLR-4 spielte eine wichtige Rolle bei der SLP-vermittelten Aktivierung von DCs. Es wurde gezeigt, dass SLPs aus TLR4-mutierten C3H/HeJ-Mäusen isolierte DCs nicht aktivieren konnten und keine nachfolgende Th-Immunantwort auslösen konnten, was darauf hindeutet, dass SLPs die durch den TLR4-Rezeptor vermittelte angeborene und adaptive Immunität aktivieren [19]. In einer anderen Studie wurde an Makrophagen gezeigt, dass SLPs von C. difficile eine Clearance-Reaktion im Sinne der Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen mit erhöhter Makrophagenmigration und phagozytotischer Aktivität induzierten [58]. Die Behandlung mit einem p38-Inhibitor kehrte diese Reaktionen um, was auf die Rolle von Signalmolekülen bei SLP-vermittelten Reaktionen schließen lässt [58]. Eine sehr aktuelle Studie berichtete über eine dosisabhängige Aktivierung von Inflammasomen durch C. difficile-SLPs. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die cholesterinreichen Mikrodomänen (Lipid-Rafts) auf Zellmembranen die Bindung von SLPs an die Zellmembran unterstützen. Dies basierte auf Fluoreszenzmikroskopie, bei der gezeigt wurde, dass die Behandlung mit Methyl- -cyclodextrin (M CD), die das Membrancholesterin abbaut, die SLP-Bindung verringerte, was darauf hindeutet, dass SLPs die Lipidflöße rekrutieren, die für die Kolonisierung von C. difficile und die Aktivierung von Inflammasomen entscheidend sind [59]. ]. Diese Studien argumentieren, dass SLPs von C. difficile die angeborenen und adaptiven Immunantworten aktivieren können, die teilweise durch TLR4 vermittelt werden, was darauf hindeutet, dass SLPs eine wichtige Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort spielen. Daher deuten diese Ergebnisse auch auf das Potenzial von SLPs als Impfstoffkandidaten gegen CDI hin.

9. Antikörperreaktionen gegen CDI

Mehrere immunologische Studien weisen darauf hin, dass eine C. difficile-Infektion und der Ausgang von der Intensität der Immunantwort des Wirts abhängen, einem Schlüsselfaktor für die CDI-Pathogenität. Daher kann die Unfähigkeit, eine robuste Antikörperantwort zu entwickeln, eine Prognose für die Schwere und das Wiederauftreten der Krankheit sein [60]. In dieser Hinsicht wurden die Antikörperspiegel gegen die wichtigsten Toxine mit dem Wiederauftreten und der Schwere der Erkrankung korreliert [61,62]. Auch im Serum von CDI-Patienten wurde in früheren Studien über Antikörper gegen die Oberflächenkomponenten von C. difficile berichtet [63]. Drudy et al. untersuchten humorale Immunantworten auf C. difficile-SLP-Extrakte in einer Kohorte von 146 Patienten, bestehend aus 55 Patienten mit C. difficile-assoziierter Diarrhoe (CDAD), 34 Patienten mit asymptomatischen Trägern und 57 Kontrollpersonen [64]. Die Studie isolierte die Extraktion der SLPs mit hohem und niedrigem Molekulargewicht, die hauptsächlich das reichlich vorhandene Protein SlpA enthielten. Sie maßen in dieser Kohorte Serumantikörper mittels Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) und fanden keine signifikanten Unterschiede in den Serum-IgM-, IgA- oder IgG-Antikörperspiegeln. Interessanterweise hatten Patienten mit wiederkehrenden CDAD-Episoden signifikant niedrigere IgM-Anti-SLP-Werte als Patienten mit einzelnen Episoden. Die Studie kam zu dem Schluss, dass weitere Studien durchgeführt werden sollten, um spezifische Anti-SLP-Antikörperreaktionen und Schutzstudien mit C. difficile-SLPs zu bestimmen [64].

Passive und aktive Immunisierung mit isolierten Extrakten von HMW- und LMW-SLPs haben ermutigende Ergebnisse mit verbesserten Überlebensraten in tödlichen Hamster-Challenge-Modellen gezeigt. O'Brien et al. zeigten die schützende Reaktion von Anti-SLP-Antikörpern auf eine C. difficile-Infektion bei Hamstern, wobei das Überleben in den mit Anti-SLP behandelten Gruppen im Vergleich zu Kontrollgruppen signifikant verlängert war [65]. Es wurde gezeigt, dass die Schutzwirkung des Antiserums auf der Verstärkung der Phagozytose von C. difficile beruht [65]. Eidhin et al. testeten mithilfe aktiver Immunisierung rohen SLP-Extrakt, der äquimolare Mengen der LMW- und HMW-Peptidkomponenten von SlpA enthielt, als Impfstoff mit verschiedenen systemischen und mukosalen Adjuvanzien in Goldhamstern und BALB/c-Mausmodellen. Die Studie berichtete von einer mäßigen bis schwachen Antikörperstimulation innerhalb verschiedener Therapien und Mausmodelle zeigten im Vergleich zu Hamstern stärkere Antikörperreaktionen auf SLPs [66]. In einer anderen Studie hat Brunet al. untersuchten die in vivo-Adjuvansaktivität von zwei Peptiden, bestehend aus der Rezeptorbindungsdomäne von Toxin A (TxA (C314)) und einem Fragment von SLP-36 kDa aus dem C. difficile-Stamm C253 gegen Fibronektin-bindendes Protein A (FnbpA). ), ein schützendes Impfantigen gegen Staphylococcus aureus [67]. Sie bewerteten die Reaktion auf intranasalem und subkutanem Weg und stellten fest, dass beide Fragmente die Produktion von zirkulierendem Anti-FnbpA-IgG und IgA steigerten. Sie kamen zu dem Schluss, dass diese Fragmente, wenn sie als Adjuvantien verwendet werden, das Immunsystem unterschiedlich beeinflussen und polarisieren [67]. In einer anderen Studie haben Shirvan et al. erzeugten und exprimierten spezifische rekombinante Antikörper gegen SLPs wie Cwp66 und SlpA aus C. difficile 630-Proteinen mittels Phagendisplay und zeigten, dass diese rekombinanten Antikörper stammspezifisch und mit hoher Spezifität auf SLPs und ihre Komponenten reagierten [68].

Immunantwort und Schutz in einem Hamstermodell unter Verwendung der Cwp84-Protease als Antigen wurden durch verschiedene Immunisierungswege bewertet [69]. Die Studie ergab unterschiedliche Antikörpertiter basierend auf den Immunisierungswegen. Der beste Schutz wurde über den rektalen Impfweg beobachtet. Darüber hinaus führten immunisierte Hamstergruppen nach einer C. difficile-Exposition zu einer um 26 % schwächeren und langsameren C. difficile-Darmbesiedlung mit einer deutlich höheren Überlebensrate (33 % höher) als die nicht immunisierten Gruppen [69].

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10. SLPs-basiertes Anti-C. difficile Therapeutics

Spezifische antikörperbasierte Therapeutika zur Neutralisierung von C. difficile können eine wirksame Strategie sein. Kandalaft et al. verwendeten Einzeldomänen-Antikörper, um auf SLPs abzuzielen [70]. Die Gruppe stellte eine Reihe SLP-spezifischer Einzeldomänen-Antikörper (VHHs) aus dem hypervirulenten C. difficile-Stamm QCD-32g58 (027-Ribotyp) her. Ihre Ergebnisse zeigten, dass eine Reihe von VHHs mit hoher Affinität an QCD-32g58-Epitope gebunden sind, die sich auf der LMW-Untereinheit von SLP befinden. Darüber hinaus berichteten sie, dass diese VHHs eine Bindungsspezifität für die Ribotypen 001 und 027 aufwiesen und dass eine Untergruppe dieser VHHs-Antikörper weitgehend kreuzreaktiv mit den Ribotypen 012, 017, 023 und 078 war. Es wurde auch gezeigt, dass diese VHHs die Motilität von C. difficile QCD-32g58 in vitro hemmen [70].

Die Entwicklung eines weiteren präzisionsantibakteriellen Wirkstoffs Av-CD291.2 durch Kirk et al. Es wurde berichtet, dass es C. difficile gezielt abtötet und die Kolonisierung bei Mäusen verhindert [51]. Es wurde gezeigt, dass Av-CD291.2 verschiedene C. difficile-Isolate abtötet, basierend auf dem Vorhandensein von SLP-Sequenzen in den C. difficile-Stämmen. Die Autoren behaupten, SLP-Nullmutanten identifiziert zu haben, die eine Punktmutation im slpA-Gen enthalten und gegen Av-CD291.2-Wirkstoffe resistent sind. Diese Mutanten wiesen ebenfalls Sporulationsdefekte auf, konnten jedoch trotz der Abschwächung der Virulenz in einem Hamstermodell den Darmtrakt besiedeln [51]. Darüber hinaus konstruierten sie eine Reihe von Avidocin-CDs, die verschiedene C. difficile-Stämme in einer von der SLP-Sequenz abhängigen Weise abtöten, was auf eine wichtige Rolle dieser auf SLPs basierenden antibakteriellen Mittel bei der Verhinderung von CDI schließen lässt [51].

11. Abschließende Bemerkungen und kritische unbeantwortete Fragen

Der Wirt entwickelt eine robuste spezifische Immunantwort gegen C. difficile-Toxine und Oberflächenbestandteile. Es wurde gezeigt, dass SLPs eine Rolle bei der Zelladhäsion, der Induktion verschiedener Zytokine durch TLR4-Aktivierung und der Aktivierung sowohl der angeborenen als auch der humoralen Immunantwort spielen. Allerdings sind Studien zur Aktivierung von T-Zell-Antworten durch SLPs erforderlich, um die Rolle von CD4- und CD8-Zellen weiter zu analysieren. Basierend auf der Aktivierung der humoralen Reaktion können diese neutralisierenden Antikörper gegen die Toxine und Oberflächenbestandteile klinische Anzeichen von CDI verhindern. Studien mit aktiver oder passiver Immunisierung gegen SLPs haben vielversprechende Ergebnisse gezeigt, was darauf hindeutet, dass die Strategie zu neuartigen Therapeutika gegen die CDI-Pathogenität weiterentwickelt werden kann. SlpA wurde als Impfstoffkandidat große Aufmerksamkeit geschenkt; Aufgrund der hohen Sequenzvariabilität von SlpA zwischen den Stämmen ist der Impfstoff jedoch möglicherweise nicht gegen alle Ribotypen wirksam. Daher sind möglicherweise epitopbasierte Impfstoffe erforderlich, um dieses Problem zu umgehen. In dieser Hinsicht sind Einzeldomänen-Antikörper (VHHs) gegen SLPs eine praktikable Option, die die LMW-SLP-Untereinheit von C. difficile mit hoher Spezifität binden und nachweislich die Motilität der C. difficile-Stämme hemmen. Derzeit befindet sich das Verständnis der mechanistischen Rolle von SLPs und ihrer Paraloge bei der Pathogenese, Adhäsion und T-Zell-Reaktion von CDI noch im Anfangsstadium und ist weitgehend unerforscht. Weitere Studien sind erforderlich, um die molekularen Funktionen und spezifischen Immunantworten der SLPs zu analysieren und die schnelle Entwicklung neuer Impfstoff-/Arzneimittelziele und Therapeutika zur Bekämpfung von C. difficile-Infektionen zu fördern.

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