Verbessertes Objekterkennungsgedächtnis durch repetitive transkranielle Magnetstimulation nach der Kodierung, Teil 1

Abstrakt

Hintergrund: Es ist bekannt, dass die Hirnstimulation kanonische Signalwege und Proteine ​​beeinflusst, die am Gedächtnis beteiligt sind. Allerdings gibt es widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der Fähigkeit der Hirnstimulation, das Gedächtnis zu verbessern, was möglicherweise auf Schwankungen im Stimulationszeitpunkt zurückzuführen ist.

Es besteht ein enger Zusammenhang zwischen Hirnstimulation und Gedächtnis. Hirnstimulation kann die Aktivität von Gehirnneuronen fördern und dadurch das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten verbessern.

Erstens kann die Hirnstimulation die Verbindung zwischen Neuronen fördern. Durch die Stimulation des Gehirns wird die Kommunikation und Verbindung zwischen Neuronen häufiger und effizienter. Diese Verbindungen werden stabiler und realer und machen das Gehirn flexibler, kreativer und nachdenklicher. Diese Vorteile verschaffen Ihnen einen Vorteil beim Lernen und im Leben.

Zweitens kann die Hirnstimulation zu einem stärkeren Gedächtnis führen. Häufige Hirnstimulation kann die Vitalität und Gesundheit des Gehirns steigern und dadurch das Gedächtnis verbessern. Es besteht ein wichtiger Zusammenhang zwischen der Gesundheit des Gehirns und dem Gedächtnis sowie den kognitiven Aktivitäten. Die Hirnstimulation hilft dem Gehirn, sich zu erholen, zu wachsen und zu reparieren. Auf diese Weise wird es für uns einfacher, Wissen zu erlernen oder sinnvolle Informationen aus dem Leben zu erhalten, und wir können sie besser im Gehirn speichern und abrufen.

Darüber hinaus kann die Hirnstimulation auch das Lernen und Anwenden neuer Informationen fördern. Im Leben stoßen wir ständig auf verschiedene Probleme, mit denen wir nicht umgehen können. Indem wir das Gehirn häufig stimulieren, können wir diese komplexen Informationen schneller und genauer verstehen, uns allmählich daran gewöhnen, Wege finden, sie zu verarbeiten und besser damit umgehen, was uns im Umgang mit Dingen geschickter macht.

Kurz gesagt: Durch Hirnstimulation können wir flexibler, kreativer und nachdenklicher sein. Wir werden auch den Problemen und Herausforderungen des Lebens mit mehr Selbstvertrauen begegnen. Hirnstimulation ist eine gute Möglichkeit, unsere kognitiven Fähigkeiten zu verbessern, das Lernen zu stärken und das Gedächtnis zu verbessern. Halten wir uns an unseren Gehirnübungsplan, bewahren wir eine positive Einstellung, seien wir positiv, streben wir eine bessere persönliche Entwicklung an und verwirklichen wir unsere Ideale. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholinspiegels und der Wachstumsfaktoren, die für das Gedächtnis und das Lernen sehr wichtig sind. Darüber hinaus kann Cistanche auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

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Hypothese: Wir stellten die Hypothese auf, dass eine repetitive transkranielle Magnetstimulation (rTMS), die nach einer Lernaufgabe und innerhalb der Zeit vor dem Abruf verabreicht wird, zur Verbesserung des Gedächtnisses beitragen könnte. Methoden: Wir implantierten männlichen B6129SF2/J-Mäusen (n=32) eine kraniale Befestigung, um die rTMS-Spulen zu sichern dass den Mäusen bei freier Bewegung eine gleichmäßige Stimulation des Frontalbereichs verabreicht werden konnte.

Anschließend durchliefen die Mäuse die Probenahmephase des Objekterkennungstests und erhielten 3, 24 und 48 Stunden nach dem Test eine Behandlung. Die Behandlung bestand aus einer 10-minütigen 10-Hz-rTMS-Stimulation (TMS, n=10), einer Scheinbehandlung (SHAM, n=11) oder einer Kontrollgruppe, die weder den Verhaltenstest durchführte noch rTMS erhielt (CONTROL n=11).

Bei þ72 h wurden Mäuse auf ihre Erkundung des neuartigen gegenüber dem vertrauten Objekt getestet. Ergebnisse: Bei 72- h hatten nur die Mäuse, die rTMS erhielten, eine größere Erkundung des neuartigen Objekts als des vertrauten Objekts.

Wir zeigen weiterhin, dass die Förderung von synaptischem GluR2 und die Aufrechterhaltung synaptischer Verbindungen im perirhinalen Kortex und CA1 im Hippocampus für diesen Effekt wichtig sind.

Darüber hinaus fanden wir Hinweise darauf, dass diese Veränderungen mit den CAMKII- und CREB-Signalwegen in Neuronen des Hippocampus zusammenhängen.

Schlussfolgerung: Indem wir die bekannten biologischen Wirkungen von rTMS mit Gedächtniswegen verknüpfen, liefern wir den Beweis, dass rTMS das Gedächtnis wirksam verbessert, wenn es während der Konsolidierungs- und Erhaltungsphase verabreicht wird.

1. Einführung

Es ist bekannt, dass nicht-invasive Hirnstimulation kanonische Pfade und Proteine ​​beeinflusst, die am Gedächtnis beteiligt sind. Aktuelle Studien, die die Auswirkungen der Hirnstimulation, insbesondere der repetitiven transkraniellen Magnetstimulation (rTMS), auf das Gedächtnis untersucht haben, kamen jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen [1].

Ein Grund dafür könnte darin liegen, dass die Stimulation zu unterschiedlichen Zeitpunkten während der Gedächtnisbildung und des Abrufs gezielt durchgeführt wird [1]. Es gibt Hinweise darauf, dass sich die Ausrichtung auf rTMS in der Post-Kodierungs- oder Konsolidierungsphase als vorteilhaft für die Entwicklung stabiler Langzeitgedächtnisse erweisen könnte [2]e4].

Konsolidierung ist die Phase, in der ein Kurzzeitgedächtnis in ein Langzeitgedächtnis (LTM) übergeht. Der Prozess hängt von der zeitspezifischen Proteinsynthese ab, die die neuen Informationen in stabile synaptische Modifikationen mit erhöhten postsynaptischen Rezeptordichten umwandelt [5,6].

Die Bedeutung dieser zeit- und regionalspezifischen Proteinsynthese wurde in Studien gezeigt, die die Denovo-Proteinsynthese blockieren. Beispielsweise beeinträchtigte eine Studie, die die Proteinsynthese im Hippocampus 3- Stunden, aber nicht 6- Stunden nach einem Lernereignis blockierte, das LTM, aber nicht das Kurzzeitgedächtnis bei Ratten[7].

Von diesen Proteinen wurden mehrere wichtige Signalwege identifiziert, die hochreguliert und für diesen Prozess wichtig sind.

An der Synapse existieren mehrere Signalwege, die die für LTM erforderliche Innervation des Rezeptors und die Stabilität der Wirbelsäule signalisieren. Diese werden durch ein Stimulusereignis der Langzeitpotenzierung (LTP) aktiviert und häufig durch neurotrophe Faktoren wie den aus dem Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) verstärkt [8].

BDNF ist von besonderer Bedeutung bei der Schaffung von Langzeitgedächtnissen, da die Blockierung der BDNF-Synthese zu bestimmten Zeitpunkten und das anschließende Lernen dessen Konsolidierung blockieren [5].

BDNF bindet an Tyrosinkinase-Rezeptoren (TrkB) und kann mehrere Signalwege wie Mitogen-aktivierte Proteinkinase/extrazelluläre signalregulierte Kinase (ERK) oder Phospholipase-Cg-Wege initiieren. Diese Signalwege laufen auf die Aktivierung des Transkriptionsregulationsfaktors cyclisches AMP-responsives Element-Bindungsprotein (CREB) hinaus.

Calciumaktivierte Proteine ​​wie Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CAMKII) spielen ebenfalls eine Rolle bei der CREB-aktivierten Genregulation[9–11] und können auch direkt die synaptische Expression der glutamatergen AMPA-Rezeptoren vermitteln und das synaptische Gerüst stabilisieren [12–15]. .

Zusammen führen diese Signalwege zu einer Verschiebung der Rezeptorexpression und -translokation, die die erhöhte Aktivierung an der Synapse vermittelt und so zur Stabilisierung der Synapsen dient und zur Aufrechterhaltung einer verlängerten LTP beiträgt [16]. Wichtig ist, dass frühere Studien gezeigt haben, dass es möglich ist, die Gedächtniskonsolidierung zu verbessern durch periodische Reaktivierung dieser Konsolidierungswege in experimentellen Umgebungen [17].

Frühere Studien haben die Fähigkeit von rTMS gezeigt, diese spezifischen Signalwege im Gehirn direkt zu beeinflussen. In-vivo-Studien haben gezeigt, dass rTMS die BDNF-Spiegel im Gehirn erhöht [18–20]. Direkter gesagt führt In-vitro-rTMS zu erhöhtem Ca2þ in Neuronen, einem vorherrschenden Signalmolekül im CAMKII-Signalweg [18]. Eine erhöhte CAMKII- und CREB-Phosphorylierung wurde auch in vitro nach rTMS gezeigt [20,21].

rTMS beeinflusst auch direkt die Expression synaptischer Rezeptoren, erhöht die AMPA-Rezeptordichte [22–24] und reguliert die AMPA-Rezeptoruntereinheiten Glutamatrezeptor 1 (GluR1) und Glutamatrezeptor 2 (GluR2) [25,26].

Daher aktiviert asrTMS diese Signalwege und wäre bei der Verbesserung des Gedächtnisses während der Konsolidierungsphase am wirksamsten. Diese Studie untersuchte den Einsatz von rTMS zur Verbesserung des Gedächtnisses durch gezielte Stimulation der Konsolidierungs- und Erhaltungsphasen des Gedächtnisses.

Wir stellten die Hypothese auf, dass die Verabreichung von rTMS im Anschluss an eine Lernaufgabe und innerhalb der Zeit vor dem Abruf die Gedächtnisleistung verbessern könnte. Dies wäre das Ergebnis einer periodischen Reaktivierung von Signalwegen, die am Gedächtnis beteiligt sind und auch von rTMS beeinflusst werden.

Anhand eines Tiermodells eines bestimmten episodischen LTM konnten wir zeigen, dass rTMS das Objektgedächtnis verbesserte, wenn es innerhalb von 72-h zwischen Kodierung und Abruf verabreicht wurde, wohingegen die Mäuse, denen die SHAM-Behandlung verabreicht wurde, das Gedächtnis nicht aufrechterhielten.

Dieser Effekt wurde durch Veränderungen der synaptischen Verbindungen im perirhinalen Kortex und CA1, eine erhöhte Aktivierung von CREB und CAMKII und eine dynamische Verschiebung der AMPA-Rezeptor-Untereinheiten an der Synapse unterstützt.

2. Material und Methoden

2.1. Tiere

Für diese Studie verwendeten wir n=33 männliche B6129SF2/J-Mäuse im Alter von 2 bis 4 Monaten. Alle Mäuse lebten in einem 12-stündigen Licht-/12-stündigen Dunkelzyklus mit freiem Zugang zu Trockenfutter und Wasser. Sämtliche Tierpflege und -verfahren entsprachen dem Tierschutzgesetz und entsprachen den institutionellen Richtlinien und wurden vom VA Palo Alto Committee on Animal Research genehmigt.

2.2. Spulenunterstützungschirurgie

Jede der Mäuse wurde operiert, um eine Spulenhalterung anzubringen, die eine konsistente rTMS-Stimulation der wachen Tiere ermöglichte. Einzelheiten zum chirurgischen Eingriff finden sich in Poh et al., 2018[27].

Kurz gesagt, die Tiere wurden mit 3 % Isofluran anästhesiert und mit einem Nasenkegel bei 2e3 % gehalten. Nach der Rasur und Reinigung der Stelle zur Sterilität wurde mit einer Skalpellklinge ein sagittaler Schnitt von etwa 10 mm Länge vorgenommen.

Das Periost wurde vorsichtig abgeschabt und eine vorgefertigte Spulenhalterung wurde mit Cyanacrylat an der Bregma befestigt und mit Zahnzement verstärkt. Anschließend wurde die Wunde um den Spulenträger herum vernäht.

2.3. Verhaltens- und Stimulationsverfahren

Einen Überblick über das Verhalten und die Stimulationsverfahren finden Sie in Abb. 1a. Nach fünf Tagen Erholung von der Spulenunterstützungsoperation wurden die Mäuse drei Tage lang an einen separaten Stimulationskäfig und Spulenverfahren gewöhnt.

Am letzten Tag der Spulengewöhnung wurden die Mäuse 10- Minuten lang dem Open Field Test (OFT) unterzogen, der auch als Gewöhnung für den Objekterkennungstest (ORT) diente. Am folgenden Tag wurden die Mäuse 10 Minuten lang der ORT-Probenahmephase mit zwei gleichen Objekten ausgesetzt. Die Objekte hatten eine ähnliche Größe, aber unterschiedliche Farben und Formen. Diese Objekte wurden in gegenüberliegenden Ecken einer quadratischen Testarena platziert.

Drei Stunden später wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt: TMS, die eine aktive Stimulation von 10-min 10 Hz rTMS erhielten, und SHAM, die gleich behandelt wurden, außer dass die Spule während der Stimulation ausgeschaltet war.

Sowohl TMS- als auch SHAM-Mäuse wurden erneut behandelt24- und 48-h nach der Eingewöhnung. Am letzten Tag (72-h nach der Eingewöhnung) wurden die Mäuse der ORT-Testphase für 10-min mit einem vertrauten und einem neuen Objekt ausgesetzt.

Um festzustellen, ob die Erkundung des neuen Objekts größer war als die des vertrauten Objekts, berechneten wir den Diskriminierungsindex (((Erkundung eines neuen Objekts)-(Erkundung eines vertrauten Objekts))/((Erkundung eines neuen Objekts)þ(Erkundung eines vertrauten Objekts))). Wir haben 72-h gewählt, da sowohl frühere Studien [28] als auch Pilotdaten (nicht gezeigt) zeigten, dass Mäuse unter normalen Bedingungen das ORT-Gedächtnis zu diesem Zeitpunkt nicht behalten.

Sowohl die Objekttypen als auch der Standort des neuartigen Objekts waren zwischen den Gruppen ausgeglichen. Für die Gewöhnung, Probenahme und Sondensitzung wurde den Mäusen immer 30 Minuten Zeit gegeben, sich vor den Versuchen an den Experimentierraum zu gewöhnen, und nach jeder Maus wurden die Objekte und die Arena mit 70 %igem Ethanol gereinigt.

Um die Auswirkungen allein der Verhaltensaufgabe zu untersuchen, schlossen wir auch eine Gruppe ein, die genauso behandelt wurde wie die SHAM-Mäuse, außer dass sie die ORT nicht durchführten.

Stattdessen wurden sie einer Probenahme- und Sondensitzung ausgesetzt, jedoch ohne Gegenstände. Eine Maus in der TMS-Gruppe erreichte in der Probenahmesitzung nicht den erforderlichen Schwellenwert einer gesamten Erkundung beider Objekte von 20-s und wurde daher von der Studie ausgeschlossen. Diese Maus wurde von der anschließenden biochemischen Analyse ausgeschlossen.

Alle anderen Mäuse erreichten sowohl bei der Probenahme als auch bei der Sondensitzung die Kriterien. Mit Ausnahme der einen Maus waren die endgültigen Zahlen in den Versuchsgruppen TMS n=10, SHAM n=11 und CONTROLn=11.

2.4. Western-Blot

Drei Stunden nach der Sondensitzung wurden die Mäuse mit einer Überdosis Ketamin getötet und die Hippocampus- und Frontalcortex-Gewebe wurden schnell auf Trockeneis präpariert und bei 80 °C gelagert.

Diese Proben wurden mit 300 ml eiskaltem Syn-Per Synaptic Protein Extraction Reagent (Thermo Scientific) mit 1x Protease Inhibitor Cocktail (Roche) und 1x Phosphatase Inhibitor Cocktail (Roche) Tabletten (pro 10 ml) 5 s lang homogenisiert.

Homogenate wurden 10 Minuten lang bei 1200 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Der Überstand wurde entnommen und ein Teil des Überstands zur Analyse des vollständigen Homogenats aliquotiert. Der Rest wurde bei 15,000 g für 20- Minuten bei 4 C zentrifugiert.

Die Pellets, die Synaptosomen enthielten, wurden vorsichtig in Syn-Per mit 1,5 ml/g Gewebe resuspendiert, um das synaptische Homogenat zu erzeugen. Zur Quantifizierung der Proteinkonzentration in der Probe wurde ein Nanotropfen verwendet.

Das vollständige Homogenat und das synaptische Homogenat wurden bis zur Analyse bei 80 °C gelagert. Sowohl das vollständige als auch das synaptische Homogenat wurden auf 4 mg/ml in eiskaltem PBS verdünnt und mit 1:4 Protein Loading Buffer (LiCor) und 1:4000 Mercaptoethanol gemischt. Anschließend wurden sie 5-min lang auf 95 C erhitzt und in Mini PROTEAN TGX-Gele (Bio-Rad) geladen.

Nach der Trennung mittels Elektrophorese bei 100 V wurden die Proteine ​​auf eine Nitrozellulose-Blotmembran (GE Healthcare Lifesciences) übertragen. Die Membranen wurden in SuperSignal WesternBlot Enhancer Antigen Pretreatment Solution (Thermo Scientific) gewaschen und dann mit Blockierungspuffer (Rockland) und 1 % Ziegenserum für 1- Stunden blockiert.

Nach dem Blockieren wurde die Membran über Nacht bei Raumtemperatur mit Primärantikörpern, verdünnt in SuperSignal Western BlotEnhancer Primary Antibody Diluent (Thermo Scientific), inkubiert.

Als primäre Antikörper wurden Maus-monoklonales ERK 1/2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology), Kaninchen-monoklonales Phospho-p44/42 MAPK (pERK 1:1000, Cell SignalingTechnologies), Maus-monoklonales CREB (1:500, Cell SignalingTechnologies) und Kaninchen-monoklonales Antikörper verwendet Phospho-CREB (S133) (pCREB1:500, Cell Signaling Technologies), monoklonales Kaninchen-CAMKIIalpha (1:1000, Cell Signaling Technologies), monoklonales Maus-Phospho-CAMKII (Thr286) (pCAMKII 1:1000, Invitrogen), monoklonales Maus-GluR1 (1: 750, Santa Cruz Biotechnology), monoklonales Kaninchen-Phospho-GluA1 (S845) (pGluR1(845) 1:750, CellSignaling Technologies), monoklonales Kaninchen-Phospho-GluA1 (S831) (pGluR1(831) 1:750, Cell Signaling Technologies), Maus monoklonales GluR2 (1:750, Invitrogen), polyklonales Kaninchen-Phospho-GluR2(S880) (pGluR2 1:500, Invitrogen), monoklonales Maus-TrkB (1:500, BD Transduction Laboratories) oder polyklonales Kaninchen-Phospho-TrkB( Tyr816) (pTrkB 1:500, EMD Millipore).

Für die Standardbeladungskontrolle wurde polyklonales Kaninchen-Cofilin (1:2000, Sigma) verwendet. Nach dem Spülen in TBS-Tween wurde die Membran 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in Ziegen-Anti-Kaninchen 800 und Ziegen-Anti-Maus 680 (1:3000, LiCor) inkubiert.

Der Immunblot wurde mit dem Odyssey Clx Infrarot-Bildgebungssystem (LiCor) abgebildet und die Datenanalyse der Bandenintensität wurde mit Image Studio (LiCor) durchgeführt.

2.5. Immunhistochemie

Drei Stunden nach der Sondensitzung wurden Mäuse, die mit einer Überdosis Ketamin getötet wurden, dann transkardial mit 50 ml kalter 1 M PBS perfundiert.
Die Gehirne wurden sofort in 4 % Paraformaldehydlösung bei 4 °C nachfixiert und für mindestens 48- Stunden in 30 % Saccharose in PBS überführt, bevor sie in 30-mm-Schnitte kryogeschnitten wurden. Frei schwebende Schnitte wurden blockiert und mit 10 % Ziegen-Esel-Serum in 0,1 % Triton in 1 M PBS permeabilisiert und dann für 48- Stunden mit dem polyklonalen Kaninchen-PSD95 (1:300, Thermo Scientific) und dem monoklonalen Maus-SV2A (1:300, Thermo Scientific) inkubiert. Santa Cruz Biotechnologie).

Anschließend wurden die Schnitte 1- Stunden lang mit den Sekundärantikörpern Alexa Fluor Ziege Anti-Kaninchen 568 (1:500, Invitrogen) und Alexa Fluorgoat Anti-Maus 488 (1:500, Invitrogen) inkubiert. Anschließend wurden die Schnitte mit dem Kernfarbstoff DAPI gewaschen (1:1000, Sigma), auf Objektträger montiert und mit Fluoromount (Thermo Scientific) abgedeckt.

Die Färbung wurde im frontalen Kortex (FC), im dorsalen CA1-Hippocampus, im entorhinalen Kortex (EC) und im perirhinalen Kortex (PC) quantifiziert.

Z-gestapelte Bilder wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop BZ-X700 (Keyence) bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen, um synaptische Puncta im gesamten Schnitt zu identifizieren. Die gesamten PDS95-Puncta, SV2A-Puncta und kolokalisierten (definiert als zwei Puncta nebeneinander oder überlappend) wurden aus mindestens vier Bildern für jeden Bereich gezählt und der Durchschnitt der Ergebnisse für jede Maus ermittelt. Die Quantifizierung des kolokalisierten Prozentsatzes wurde durch Zählen (überlappender SV2A- und PSD95-Punkte)/(Gesamt-SV2A- und PSD95-Punkte) vervollständigt.

2.6. Statistiken

Alle Daten erfüllten die Normalitätsannahmen, wie durch die Untersuchung der Schiefe, der Kurtosis und des Shapiro-Wilk-Werts der berechneten Residuen ermittelt wurde, und es gab keine Verstöße gegen die Homogenität der Varianz, wie anhand der Levene-Statistik ermittelt.

Für die Verhaltenstests wurden T-Tests der Schüler verwendet, um SHAM mit TMS zu vergleichen, und für die Erforschung neuer und vertrauter Objekte innerhalb von Gruppen wurde eine zweistufige ANOVA mit wiederholten Messungen verwendet.

Immunhistochemische und Western-Blot-Daten wurden mithilfe einer One-Way-ANOVA auf Signifikanz getestet. Für alle post-hoc-paarweisen Vergleiche wurde eine Tukey-Anpassung mit einer Signifikanz bei p < 0.05 verwendet.

Wenn die Homogenität der Varianz verletzt wurde, wurde die Signifikanz mit dem Welch-Test bestimmt und anschließend eine Post-hoc-Korrektur mit Games-Howell durchgeführt. Diese Fälle werden in den Ergebnissen vermerkt. Alle Statistiken wurden mit SPSS (Version 22, IBM) erstellt und Grafiken wurden mit GraphPad (Version 7, Prism) erstellt.

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