Integrative Omics-Analyse enträtselt mikrovaskuläre Entzündungs-bezogene Wege in Nieren-Allotransplantat-Biopsien

edmund.chen@wecistanche.com

Bei der Transplantation fester Organe haben sich microRNAs (miRNAs) als Schlüsselakteure bei der Regulierung der Zellfunktion von Allotransplantaten als Reaktion auf Verletzungen herausgestellt. Um einen Einblick in die Rolle von miRNAs bei der Antikörper-vermittelten Abstoßung zu gewinnen, einem Abstoßungsphänotyp, der histologisch durch mikrovaskuläre Entzündung definiert ist,Niere Allotransplantat-Biopsien wurden einem miRNA-, aber auch einem Messenger-RNA (mRNA)-Profiling unterzogen. Unter Verwendung eines einzigartigen mehrstufigen Auswahlverfahrens, das spezifisch für die BIOMARGIN-Studie ist (Entdeckungskohorte, N=86; Auswahlkohorte, N=99; Validierungskohorte, N=298), sechs differentiell exprimierte miRNAs wurden konsistent identifiziert: miR-139-5p (unten) und miR-142-3p/150-5p/155-5p/{ {7}}p/223-3p (nach oben). Ihr Expressionsniveau korrelierte allmählich mit der Intensität der mikrovaskulären Entzündung. Die Zellspezifität von miRNAs-Zielgenen wurde untersucht, indem ihre in vivo-mRNA-Ziele mit Einzelzell-RNA-Sequenzierung aus einer unabhängigen Allotransplantat-Biopsie-Kohorte integriert wurden. Die vom Endothel stammende miR-139-5p-Expression korrelierte negativ mit der MHC-bezogenen Genexpression. Umgekehrt war die epitheliale miR-222-3p-Überexpression stark mit einer verschlechterten Elektrolythomöostase der Niere und unterdrückten immunbezogenen Signalwegen verbunden. In Immunzellen regulierte miR-150-5p die NF-kB-Aktivierung in T-Lymphozyten, während miR-155-5p das mRNA-Spleißen in Antigen-präsentierenden Zellen regulierte. Insgesamt ermöglichten uns integrierte Omics, neue Wege aufzudecken, die an mikrovaskulären Entzündungen beteiligt sind, und darauf hinzuweisen, dass Stoffwechselmodifikationen in tubulären Epithelzellen als Folge einer Antikörper-vermittelten Abstoßung über das nahe gelegene Endothelkompartiment hinaus auftreten.

Schlüsselwörter:Nierentransplantation, microRNA, Multi-Omics, mikrovaskuläre Entzündung, Antikörper-vermittelte Abstoßung

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN

EINLEITUNGImNierentransplantation(KT) wird die alloimmune Verletzung normalerweise in zwei Arten von Allotransplantat-Abstoßung gemäß der räumlichen Verteilung der Immuninfiltration und Informationen über das Vorhandensein oder Fehlen von Spender-spezifischen Anti-HLA-Antikörpern dichotomisiert. Die Diagnose stützt sich auf die Allotransplantat-Biopsie mit der Einstufung der histologischen Läsionen gemäß der Banff International Consensus-Klassifikation(1). Tubulitis ("t"-Läsion) und interstitielle Entzündung ("I"-Läsion) sind charakteristische histologische Merkmale der T-Zell-vermittelten Abstoßung (TCMR) und stehen im Zusammenhang mit direkter Zytotoxizität für das tubulointerstitielle Kompartiment. Die Antikörper-vermittelte Abstoßung (ABMR) ist am häufigsten mit zirkulierenden Anti-HLA-Antikörpern verbunden, wobei die Entzündung auf das mikrovaskuläre Kompartiment abzielt. Aktive histologische ABMR-Läsionen schließen das Vorhandensein von mononukleären Zellen in glomerulären Kapillaren ("g"-Läsion) und in peritubulären Kapillaren ("ptc"-Läsion) ein, die zusammen als "mikrovaskuläre Entzündung" (MVI) bezeichnet werden. Bei chronisch aktiver ABMR addieren sich chronische Gewebeverletzungen wie Transplantatglomerulopathie oder arterielle Intimafibrose zu diesen akuten Läsionen(1). Bei Verwendung der derzeitigen auf T-Zellen gerichteten Immunsuppressiva wird angenommen, dass TCMR einen begrenzten prognostischen Einfluss hat, während ABMR eine Hauptursache für Transplantatversagen ist, was mit dem Mangel an wirksamen therapeutischen Ansätzen zusammenhängt (2).

Um bessere Therapien für MVI und ABMR zu finden, sind bessere Einblicke in die biologischen Mechanismen erforderlich, die diesen Verletzungsprozessen zugrunde liegen. Hochdurchsatz-Omics-Technologien scheinen für diesen Zweck geeignet zu sein, da sie ein exaktes und gleichzeitiges Screening von Tausenden von Genen, Proteinen und Metaboliten ermöglichen(3). Gesamt-Transkriptom-Abfrage vonNiereAllotransplantat-Biopsien haben tiefgreifende Veränderungen der mRNA-Genexpression in den verletzten residenten Zellen oder in infiltrierenden Zellpopulationen während ABMR(4) gezeigt. Inzwischen haben sich microRNAs (miRNAs) zu Schlüsselspielern im Zellstoffwechsel entwickelt, indem sie Boten-RNA (mRNA) auf posttranskriptioneller Ebene regulieren. Tatsächlich haben miRNAs unser Verständnis der Feinabstimmung der physiologischen Prozesse des Körpers, die an Proliferation, Apoptose, Differenzierung und Entwicklung beteiligt sind, revolutioniert(5). Es überrascht nicht, dass eine fehlregulierte miRNA-Expression zur Entwicklung vieler Pathologien führt, einschließlichNierenkrankheit(6). Da sich die miRNA-Expressionsprofile zwischen kranken und gesunden Zuständen unterscheiden, haben viele Studien miRNAs entweder allein oder in Kombination mit anderen traditionelleren Markern analysiert, nicht nur um Krankheiten zu diagnostizieren und das Fortschreiten der Krankheit zu prognostizieren, sondern auch um potenzielle therapeutische Anwendungen zu entwickeln (7).

Im Zusammenhang mit der Transplantation fester Organe können miRNAs durch ihre Rolle bei der Regulation der Immunzellfunktion und bei der Reaktion von Allotransplantat-residenten Zellen auf Verletzungen an der Abstoßung beteiligt sein (6,8). Mehrere Studien haben Allotransplantat-miRNAs als Biomarker und/oder Effektoren in den Einstellungen von TCMR (8,9) untersucht, aber keine hat sich bisher auf MVI und ABMR konzentriert. In dieser Studie wollten wir verschiedene Omics-Ebenen von integrierenNiereAllotransplantatbiopsien, um einen Einblick in die Rolle von miRNAs bei diesem schädlichen Abstoßungsphänotyp zu gewinnen.

MATERIALIEN UND METHODEN StudiendesignDiese Studie ist Teil der vom FP7-finanzierten BIOMArkers ofNierenGraft INjuries-Forschungsprogramm (BIOMARGIN, https://cordis.europa.eu/project/id/305499, ClinicalTrials.goy, Nummer NCT02832661), geleitet von einem europäischen Forschungskonsortium auf der Suche nach Biomarkern für Allotransplantat-Immunläsionen inNierentransplantationEmpfänger, mit diagnostischem und/oder prognostischem Wert. BIOMARGIN ist eine multizentrische, prospektive, mehrphasige Studie, die bei vier durchgeführt wirdNierentransplantationZentren in Europa (Necker-Krankenhaus, Paris, Frankreich; Universitätskliniken, Leuven, Belgien; Medizinische Hochschule Hannover, Hannover, Deutschland; und Universitätsklinikum, Limoges, Frankreich). Die Proben wurden prospektiv zum Zeitpunkt des Screenings und der Indikationsbiopsien zwischen April 2013 und Juni 2015 entnommen (Abbildung IA). Alle Transplantationen wurden mit negativen komplementabhängigen Zytotoxizitätskreuzproben durchgeführt. In diesen vier klinischen Zentren wurden Protokollbiopsien 3, 12 und manchmal 24 Monate nach der Transplantation gemäß der lokalen Praxis der Zentren zusätzlich zu den Indikationsbiopsien durchgeführt. Das institutionelle Prüfungsgremium an jedem Standort genehmigte die Studie, und alle Patienten gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab.

StudienkohortenDie Studie war in drei Phasen unterteilt (Abbildung 1A). In der ersten Fall-Kontroll-Entdeckungsphase wurden N=88-Biopsieproben für die globale miRNA-Expressionsanalyse verwendet (N=754-miRNAs, ausgenommen potenziell normalisierende miRNAs). . Wir haben Proben basierend auf Verfügbarkeit und histologischen Kriterien ausgewählt (ausgenommen Fälle mit der Diagnose Glomerulonephritis oder Polyomavirus-assoziierte Nephropathie und Fälle mit unklarer Diagnose). Basierend auf lokalen Biopsiewerten wurde eine erste Auswahl getroffen, die durch zentrales Lesen durch eine Gruppe von Pathologen, unabhängig vom ursprünglichen Zentrum, weiter verfeinert wurde. Eine statistische Analyse (siehe miRNA-Auswahl) wurde verwendet, um die erweiterte Liste von miRNAs auszuwählen, die am unterschiedlichsten zwischen histologischen Phänotypen exprimiert werden, die anschließend in der 2. Phase quantifiziert wurden.

Ein ähnliches Fall-Kontroll-Studiendesign wurde für die zweite (Auswahl-)Phase verwendet, in der eine gezielte miRNA-Expressionsanalyse (N=143) an N=99-Biopsieproben durchgeführt wurde. Dieselbe statistische Pipeline wurde angewendet, um eine noch eingeschränktere Liste von miRNAs auszuwählen, die anschließend in der 3. Phase quantifiziert werden. Schließlich wurden in der dritten (Validierungs-)Kohorte alle Proben prospektiv und nacheinander gemäß dem BIOMARGIN-Protokoll zwischen dem 24. Juni 2014 und dem 2. Juli 2015 und mit angemessenen Proben entnommenNiereQualität der Allotransplantat-Biopsie wurden für die 38 miRNAs bewertet, die als Ergebnis der zweiten Auswahlphase ausgewählt wurden. In dieser Real-Life-Setting-Kohorte wurde keine Auswahl basierend auf Histologie, Demografie, Zeit oder anderen Faktoren als Probenverfügbarkeit und Qualitätskontrollkriterien (Angemessenheit der Biopsie und RNA-Ausbeute) getroffen.

miRNA-AuswahlEine robuste statistische Pipeline wurde speziell für die BIOMARGIN-Studie in R(R Core Team(10), Version 1.0.44) als Erweiterung des Biosignal-R-Pakets(1l) entwickelt. Kurz gesagt haben wir in der Entdeckungsphase eine Merkmalsauswahlstrategie durchgeführt, die univariate und multivariate Ansätze umfasste. Für die univariate Auswahl verwendeten wir einen nichtparametrischen Test (Wilcoxon-Mann-Whitney-Test) und einen parametrischen Test (Student's t-Test) sowie eine Discovery-Kohorte (BIOS-03-0023, BIOS-06-0238). Die Vorhersage-Scores jedes miRNA-Transkripts in jedem multivariaten Modell wurden integriert, um einen "multivariaten Score" zu erhalten. Durch die Kombination der Ergebnisse dieser univariaten und multivariaten Analysen konnten wir eine Untergruppe von miRNA-Kandidaten einordnen und auswählen, die Teil der erweiterten Liste sein sollten, die in der nächsten Phase quantifiziert werden soll.Für diese Post-hoc-Analyse, die sich auf VMI-Wege konzentriert, wurde die mediane normalisierte Expression jeder miRNA zwischen Fällen und Kontrollen unter Verwendung des Wilcoxon-Tests in allen drei Kohorten verglichen. Wir kontrollierten für multiples Testen unter Verwendung der FDR-Methode (False Discovery Rate) von Benjamini & Hochberg.

Klinisch-pathologische BeurteilungDie einzelnen histologischen Läsions-Scores wurden gemäß den Kriterien von Banff 2019(16) halbquantitativ bewertet. Der Begriff „mikrovaskuläre Entzündung“ (MVI) wurde verwendet, um sich auf jeden Grad der Kombination von Glomerulitis (g) und/oder peritubulärer Kapillaritis (ptc) zu beziehen Nachweis einer akuten Gewebeverletzung und Nachweis einer aktuellen/aktuellen Antikörperinteraktion mit vaskulärem Endothel), aber nicht alle erfüllten das dritte Kriterium [serologischer Nachweis von Spender-spezifischen Antikörpern (DSA) und/oder CAd-Färbung]. DSAs nach der Transplantation wurden von der lokalen Praxis des Zentrums bestimmt, wobei die DSA-Positivität als nachweisbare spenderspezifische Serum-Anti-HLA-Antikörper mit einem mittleren Fluoreszenzintensitätswert (MFI) von 500 zum Zeitpunkt der Biopsie oder zu einem beliebigen Zeitpunkt davor definiert ist.

RNA-Extraktion aus Biopsieproben für die mRNA- und miRNA-ProfilierungEs wurden jeweils zwei Nadelkerne entnommenNiereAllotransplantat-Biopsie. Eines wurde für die herkömmliche histologische Einstufung verwendet und mindestens die Hälfte des anderen wurde sofort in Allprotect-Gewebereagenz (Qiagen Benelux BV, Venlo, Niederlande) gelagert. Die Allprotect-Röhrchen wurden bei 4 °C gelagert (mindestens 24 Stunden bis maximal 72 Stunden). , und dann bis zur RNA-Extraktion bei -20 Grad gelagert. Gesamt-RNA wurde daraus isoliertNiereAllotransplantat-Biopsieproben mit dem Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit (Qiagen Benelux BV) auf einem QIAcube Instrument (Qiagen Benelux BV). Die Menge (Extinktion bei 26{{20}} nm) und Reinheit (Verhältnis der Extinktion bei 230,260 und 280 nm) der isolierten RNA wurden mit dem NanoDrop ND-1000-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific/Life Technologies Europe BV, Gent, Belgien). Die RNA-Integritätszahl (RIN) wurde mit dem Eukaryote nano/pico RNA Kit (Agilent Technologies Belgium NV, Diegem, Belgien) auf dem Bioanalyzer 2100-Instrument (Agilent Technologies Belgium NV) bewertet MVI-Gruppen [RIN (Mittelwert ± SD): 5,6 ± 1,96 vs. 5,4 ± 1,97, P=0, 66; 260/280-Verhältnis (Mittelwert ± SD): 1,87 ± 0,06 vs. 1,87 ± 0,1 l, P{{26 }}.40]. Für RNA-Proben mit niedrigem RIN(<6.5), we="" excluded="" samples="" with="" a="" 260/280=""><1.6. the="" extracted="" rna="" was="" subsequently="" split="" and="" stored="" at="" -80℃℃.half="" of="" the="" rna="" extract="" was="" used="" for="" mirna="" profiling="" and="" the="" other="" half="" for="" mrna="" transcriptomic="" analysis.="" the="" associated="" data="" are="" available="" from="" the="" gene="" expression="">

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/RENALE DIALYSE VERBESSERN

miRNA-ProfilierungSpecific reverse transcription of 150ngof total RNA was performed using Megaplex"RT Primers Human Pool A v2.1(Step 1)or Custom RT Primers Human Pool (Step 2 and 3)(Thermo Fisher Scientific, Les Ulis, France), on a Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). No complementary(c)DNA preamplification was required. miRNA expression was assessed by qPCR, using TaqManArray Cards (Applied Biosystems", Thermo Fisher Scientific), where the primers and probe of each miRNA were spottedanddried in duplicate wells of a microfluidic card. We used TaqMan"Array Human MicroRNA A +B Card Sets v3.0 for the discovery cohort(a two-card set enabling quantitation of 754 unselected human miRNAs)and Custom TaqManArray MicroRNA Cards for the selection and validation cohorts. Data analysis was performed by using Expression Suite software version 1.0.3. Assays with a cycle threshold(CT) values >35 wurden als nicht ausgedrückt betrachtet. RNU44 und RNU48 zeigten eine konsistente Expression in allen Proben, der mittlere Variationskoeffizient (RNU44 plus RNU48) betrug 3,73 Prozent in Array-Karte A und 3,79 Prozent in Array-Karte B] und wurden als Haushaltsgene für die Datennormalisierung in allen Teilstudien verwendet.

mRNA-TranskriptomanalyseDie Transkriptomanalyse wurde wie bereits beschrieben (17) durch Microarray durchgeführt. Kurz gesagt, die aus den Biopsieproben extrahierte Gesamt-RNA wurde zuerst amplifiziert und mit dem GeneChip 39 IVT PLUS Reagent Kit (Affymetrix) zu komplementärer RNA (cRNA) biotinyliert und mit dem Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2 hybridisiert.0 Arrays( Affymetrix), die 54.675 Sondensätze umfasste, die das gesamte Genom abdecken. Wir verwendeten eine Robust Multichip Average (RMA)-Normalisierung. Die mediane normalisierte Expression jeder mRNA wurde zwischen Fällen und Kontrollen unter Verwendung des Wilcoxon-Tests verglichen. Wir kontrollierten die Inflation des Risiko-Alpha aufgrund multipler Tests, indem wir die FDR-Methode (False Discovery Rate) von Benjamini & Hochberg anwandten. Die Microarray-Daten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien zum Mindestmaß an Informationen über Microarray-Experimente gehandhabt.

In-Silico-AnalysenDie Software Biological Interpretation Of Multiomics EXperiments (BIOMEX) wurde für die Differentialanalyse der Transkriptomdaten unter Verwendung der Ensembl-ID-Annotation verwendet(18). Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Build: 478438M Content version:44691306, Qiagen) und OMICSnet(19) wurden verwendet, um die Gensätze zu bestimmen, die durch die ausgewählten miRNAs reguliert werden. OMICSnet wurde verwendet, um eine Gen-Ontologie-Analyse mit der Reactome Pathway-Datenbank durchzuführen, wobei der vollständige Pathway (20) verwendet wurde. Der Aufbau von Gennetzwerken erfolgte völlig unbeaufsichtigt und stützte sich auf die Anzahl der gemeldeten molekularen Wechselwirkungen jedes einzelnen Gens mit allen anderen Genen im Netzwerk. Gene mit der höchsten Anzahl an Interaktionen wurden automatisch im Zentrum des Netzwerks positioniert, während die Gene mit einer geringeren Anzahl an Interaktionen in die Peripherie gestreut wurden. Der zelluläre Ursprung ausgewählter miRNAs wurde im Rahmen des Fantom5-Projekts(21) untersucht, das eine Cap-Analyse der Genexpression in menschlichen Zellen und Geweben liefert. Für die miRNA-Expressionsanalyse haben wir alle berücksichtigtNiere-verwandte Strukturzellen und alle zirkulierenden hämatopoetischen Zellen, ohne weitere Selektion.

Einzelzell-RNA-SequenzierungsdatenanalyseZuvor veröffentlichte menschliche Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten (siRNA-seq) von zwei ABMR-Biopsien und vier gesunden Referenzen, die Transplantationsüberwachungsbiopsien entsprechen, wurden verwendet. Die zugehörigen Rohzählungen oder Matrizen wurden jeweils von GEO (GSE145927, https://www.ncbi.nlm. nihgov/geo)(22) und heruntergeladenNierePrecision Medicine Project (KPMP, https://atlas.kpmp.org/repository). Rohe Genexpressionsmatrizen, die pro Probe generiert wurden, wurden zusammengeführt und unter Verwendung des Seurat V4-Pakets (23) analysiert. Die zum Erstellen und Filtern von Seurat-Objekten angewendeten Parameter waren wie folgt: Einbeziehung von Zellen, die zwischen 500 und 10.000 erkannten Genen und weniger als 25 % mitochondriale Transkripte exprimieren. Nach dem Filtern wurden alle Objekte mithilfe des SCTransform-Integrationsworkflows auf Seurat (24) integriert. Kurz gesagt, 3000 Features wurden für die Integration mit der PrepSCTIntegration-Funktion verwendet, und die FindIntegrationAnchors-Funktion wurde verwendet, um den Stapeleffekt zu begrenzen. Ein vollständiger UMAP-Datensatz (Uniform Manifold Approximation and Projection) wurde unter Verwendung der DimPlot-Funktion und der 16 wichtigsten Hauptkomponenten generiert. Cluster wurden unter Verwendung der Funktionen FindNeighbors und FindClusters mit einer Auflösung von 0,6 erstellt. Die Clusteridentifizierung wurde unter Verwendung der FeaturePlot-Funktion durchgeführt, indem die Expression spezifischer Marker in jedem Cluster ausgewertet wurde. Punktdiagramme wurden unter Verwendung der Diagrammfunktionen DotPlot und FeaturePlot mit normalisierten Zählungen im RNA-Assay als Eingabedaten erstellt.

CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENINFEKTIONEN VERBESSERN

Statistische AnalysePatienten- und Spendermerkmale wurden durch Zahlen, Prozentsätze und Häufigkeiten für kategoriale Variablen beschrieben. Wir berichteten kontinuierliche Variablen unter Verwendung von Mittelwerten und Standardabweichungen (SD) bei Normalverteilung, Mediane und Interquartilbereiche (IQR) für Variablen mit einer schiefen Verteilung. Wir haben ihre Eigenschaften gegebenenfalls mit dem Fisher- oder dem Wilcoxon-Test verglichen. Wir verwendeten den Kruskal-Wallis-Test, um die mediane miRNA-Expression gemäß der MVI-Intensität zu vergleichen, und den Spearman-Test für die Korrelationsanalyse. Wir haben die statistische Signifikanz für P-Werte kleiner als 0 berücksichtigt.05. Wir haben GraphPad Prism (Version 8; GraphPad Software, San Diego, CA) und RStudio (Version 4.0.3) für die statistische Analyse und Datenpräsentation verwendet. Folgende R-Pakete wurden verwendet: heatmap3 (heatmap3_1.1.9) für Heatmap-Analysen, fmsb(fmsb_0.7.0) und scales (scales_1.1.1)-Pakete für Radarplots, ggplot2 (ggplot2_3.3.5) für Balkendiagramme und complot(corrplot_0.90) für die Korrelationsmatrixanalyse.

ERGEBNISSE

Mehrstufige Identifizierung von MVI-assoziierten miRNAsBetween April 2013 and July 2015,646 patients enrolled in the BIOMARGIN study provided 716 indication or surveillance biopsies. Inadequate biopsies (N=49), biopsies with no paired sample for research use(N=135)or samples not passing molecular biology QC(N=49) were excluded, leaving 483 samples from 441 individuals available for this study (Figure 1A). Baseline and clinical characteristics of the study groups are provided in Supplementary Tables S1-3, and the histological characteristics of the biopsies are provided in Supplementary Tables S4-6. In the discovery cohort, a total of 27 patients met the MVI composite endpoint(MVI+), defined as clinical ABMR diagnosis and/or any level of MVI(g and/or ptc>0). Die anderen 59 Patienten (MVI-) präsentierten verschiedene Diagnosen, darunter T-Zell-vermittelte Abstoßung (TCMR, N=8), interstitielle Fibrose und tubuläre Atrophie (IFIA, N=20) und normale Biopsien (N{{6 }}), aber kein MVI. Von den 754 miRNA-Kandidaten wurden 18 miRNAs zwischen den MVI plus- und MVI-Gruppen unterschiedlich exprimiert (Abbildung 1B). In der Auswahlkohorte wurde eine eingeschränkte Liste von 143 miRNAs in 99 Proben quantifiziert. In dieser Auswahlkohorte wurden 14 miRNAs zwischen Fällen mit (N=28) und ohne (N=71)ABMR (Abbildung 1C) unterschiedlich exprimiert. Schließlich wurden in der größten transsektionalen Kohorte 38 miRNAs in 298 Proben quantifiziert, von denen 12 miRNAs zwischen ABMR(N=29)- und keiner ABMR (N=269)-Biopsie unterschiedlich exprimiert wurden (Abbildung 1D ).

Konsistente Identifizierung von 6 MVI-assoziierten miRNAs und Korrelation zur HistologieAls nächstes haben wir die 3 Listen von differentiell exprimierten miRNAs durchschnitten und 6 miRNAs identifiziert, die konsistent mit MVI oder ABMR über die 3 unabhängigen Kohorten hinweg assoziiert waren (Abbildung 2A).miR-142-3p,miR-150-5p,miR -155-5p, miR-222-3p und miR-223-3p wurden in MVI/ABMR überexprimiert, während die miR-139-5p-Expression verringert war. Radardiagramme (Abbildung 2B) zeigen für jeden Schritt den differenziellen Ausdruck zwischen Fall und Kontrollen der 6 miRNAs und unterstützen die Robustheit der miRNA-Profile über die drei unabhängigen Kohorten. Als nächstes untersuchten wir, wie die 6 miRNAs-Expression mit einzelnen histologischen Läsionen über alle 483 Allotransplantat-Biopsien zusammengenommen assoziiert ist. Die Expression der 5 hochregulierten miRNAs nahm allmählich mit der Intensität der MVI-Läsionen zu, während die Expression von miR-139-5p negativ korrelierte (Abbildung 2C).MiR-139-5p/142-3p/ 150-5p/155-5p/223-3p waren nicht nur stark mit ABMR-bezogenen Merkmalen (g, ptc, C4d-Ablagerung), sondern auch mit TCMR-bezogenen Läsionen (i, t ) und IFTA-Läsionen (ct, ci), was auf ihre Beteiligung an häufigen, nicht-ABMR-spezifischen, entzündlichen und vernarbenden Prozessen hindeutet. Alternativ könnte von Natur aus eine gewisse intrinsische Kollinearität zwischen den Läsionen bestehen, was dazu führt, dass wir nicht in der Lage sind, die wahre Spezifität für eine Läsion zu identifizieren. MiR-222-3p korrelierte nicht mit histologischen Läsionen von TCMR oder IFTA (Abbildung 2D).

Multi-Omics-Integration: mRNA-miRNA-Interaktion in MVAls nächstes bewerteten wir die differentiell exprimierten Gene zwischen MVI plus- und MVI-Fällen im zuvor veröffentlichten Discovery-Set (25). Von den 54.675 Sonden wurden insgesamt 2755 differentiell exprimierte Gene (DEGs) zwischen MVI plus und MVI- identifiziert.

Gruppen, bestehend aus 1085 herunterregulierten und 1670 hochregulierten Genen (Abbildung 3A). Die am stärksten differentiell exprimierten mRNAs in MVI plus Proben waren CXCL9 und CXCL10, in Übereinstimmung mit früheren Berichten (17,26), dass diese Gene bei ABMR am stärksten überexprimiert sind. Als nächstes verwendeten wir IPA und OMICSnet, um die mutmaßlichen Zielgene für jede miRNA in silico zu identifizieren. Es wurde vorhergesagt, dass insgesamt 4504 mRNAs von mindestens einer der 6 miRNAs angegriffen werden. Dann integrierten wir diese 4504 vorhergesagten Ziele mit den DEGs in Allotransplantatbiopsien. Die integrierte miRNA/mRNA-Analyse identifizierte 61 DEGs, auf die miR-139-5p abzielte, die in MVI plus Biopsien signifikant erhöht waren. Es wurden auch 28, 58, 52, 43 und 27 DEG identifiziert, die bei MVI signifikant verringert waren, plus Biopsien, die jeweils von miR-142-3p, miR{-150-5p, miR-155-5p, miR{ {22}}p und miR-223-3p (Abbildung 3B).

Zellulärer Ursprung der MV-assoziierten miRNAsDer zelluläre Ursprung der sechs miRNAs wurde in verschiedenen charakterisiertNieren-Zell- und hämatopoetische Zellsubtypen unter Verwendung des online verfügbaren miRNA-Atlas [Fantom-Datenbank (27)]. Unüberwachtes Clustering diskriminiertNieren-Zell-abgeleitete miRNAs von Immunzellen-abgeleiteten miRNAs (Abbildung 4A). Es zeigte auch einen oder zwei dominante Zelltypen für jede miRNA. MiR-139-5p schien hauptsächlich von glomerulären Endothelzellen (EC) exprimiert zu werden. MiR-222-3p, obwohl seine Expression nicht mit tubulärer Entzündung korreliert war (Banff-Läsionen "t", Fig. 2D), war hauptsächlich verwandt mitNieren-Epithelzellen. Die vier verbleibenden miRNAs wurden hauptsächlich in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) oder Granulozyten exprimiert, wobei miR-142-3p in NK-Zellen und Monozyten angereichert war, miR-150-5p in CD4 plus und CD8 plus T-Zellen, miR -155-5p in CD19 plus B-Zellen und Makrophagen und miR-223-3p in Neutrophilen.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung identifizierte alle Nierenzellen und infiltrierende Immunzellen Um die potenzielle Rolle der einzelnen MVI-assoziierten miRNAs zu charakterisieren, analysierten wir öffentlich verfügbare sc-RNAseq-Daten von zweiNieren-Allotransplantatbiopsien mit ABMRund hohen MVI-Scores (g2, ptc3)(22). Diese Datensätze wurden mit 4 gesunden Referenzbiopsien ohne MVI integriert. Nach Qualitätskontrolle und Filterung wurden 31545 Zellen erkannt und unüberwachtes Clustering ergab 12 Cluster (Abbildung 4B). Wir haben etablierte Marker (28) verwendet, um alle Hauptsubtypen von residenten und infiltrierenden Zellen zu identifizieren und zu kennzeichnen (ergänzende Abbildung S2). Als nächstes konzentrierten wir uns auf die Zellpopulationen, aus denen unsere sechs miRNAs vermutlich stammen. Zu diesem Zweck haben wir die Zellen in 4 Hauptcluster geschichtet, die Endothel, Epithel, Lymphozyten und APCs entsprechen (Abbildung 4C). In Übereinstimmung mit früheren Analysen dieser Daten (22) wurden in den sc-RNASeg-Datensätzen weder neutrophile noch NK-Zellpopulationen nachgewiesen.

miR-139-5p kontrolliert die EC-Aktivierung und den Antigen-Präsentationsweg während MVIMiR-139-5p war die einzige herunterregulierte miRNA in unserer Studie in Fällen mit MVI/ABMR (Abbildung 2A) und es wurde festgestellt, dass sie hauptsächlich aus der glomerulären EC stammt (Abbildung 4A). Es wurde bestätigt, dass 61 seiner Zielgene im Bulk-Microarray von MVI plus-Fällen hochreguliert werden (Abbildung 3B), und ihre Expression wurde bei Einzelzellauflösung in den 3 zuvor identifizierten EC-Subclustern weiter untersucht (Abbildungen 4B,C). Wie in Abbildung 5A dargestellt, war der aktivierte ECcluster nur in MVI-Plus-Proben nachweisbar. Außerdem war die Hälfte der 61 Gene (N=30) in sc-RNAseq MVI plus Biopsien konsistent erhöht, unabhängig von den drei EC-Subclustern. Unter diesen war GBP5 das am stärksten erhöhte Gen. Als nächstes identifizierte eine genontologische Analyse unter Verwendung dieser 30 von Endothelien stammenden Transkripte UBE2D1 und YWHAG als zentrale Akteure im Gennetzwerk (Abbildung 5B). Genauer gesagt wurden immunbezogene Signalwege und Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-vermittelte Antigenprozessierungs- und -präsentationswege angereichert (Abbildung 5C). Eine Pseudozeitanalyse wurde durchgeführt, um die Genexpressionsänderungen im Verlauf der EC-Aktivierung besser zu charakterisieren, die Across-Cells-State-Trajektorie (Abbildungen 5D, E), UBE2D1, YWHAG und GBP5 stiegen während der MVI-assoziierten Endothelaktivierung kontinuierlich an. Sehr ähnliche Trajektorien wurden für die MHC-verwandten Gene HLA-A, -B und -DRA gefunden, aber auch für die echte endotheliale Aktivierung und Entzündungsmarker wie VCAM1, CXCL9 und CXCL10, was darauf hindeutet, dass alle diese Gene gleichzeitig während der endothelialen Aktivierung exprimiert werden. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass miR-139-5p während MV-Läsionen verringert ist und den MHC-Antigen-Präsentationsweg in aktiviertem EC nicht länger unterdrückt.

miR-222-3p beeinträchtigt beidesNierenPhysiologische und immunbezogene Signalwege in Epithelzellen während MVI Als nächstes konzentrierten wir uns auf miR-222-3p, eine hochregulierte miRNA in MVI-Proben mit aNieren-Epithelzellursprung und eine exklusivere Korrelation zu ABMR-bedingten histologischen Läsionen (Abbildungen 2A, D, 4A). Zellauflösung in den verschiedenenNieren-Epithelpopulationen, die wir zuvor identifiziert haben (Abbildungen 4B, C). Eine massive Abnahme von 41 dieser 43 (95 Prozent) Gene bei allen identifiziertenNieren-Epithelzellcluster deutet auf ein Gen-Silencing hin

Profil in VMI (Abbildung 6A). Interessanterweise sind 4 Gene daran beteiligtNieren-physiologische Signalwege (ERBB4, ATPIB1, TIMM50 und KIF3B), aber auch immunbezogene Gene (TRAPI und PEBPI) wurden als zentrale Gene im Netzwerk identifiziert (Abbildung 6B). Die Genontologie der the43-Gene zeigte eine Anreicherung in ErbB-Signalwegen, aber auch in immunbezogenen Signalwegen, und die Zytokinantwort (Abbildung 6C) und die ERBB4-Expression wurden für alle weiter bestätigtNieren-Zellen (Abbildung 6D). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass während VMI ein hohes Maß an -222-3p inNieren-Epithelzellen ist mit einer starken Repression von Genen verbunden, die an beiden beteiligt sindNieren-Elektrolythomöostasewege und immunbezogene Wege im Epithel.

miR-150-5p reguliert die NF-kB-Aktivierung in T-Lymphozyten während MVI In ähnlicher Weise untersuchten wir die regulatorische Rolle von (erhöhtem) miR-150-5p während MVI im T-Zell-Cluster, in dem es am stärksten exprimiert wurde (Abbildung 4A). Wir haben die 58 verringerten MVI-assoziierten DEGs, die in Massenbiopsieproben von Allotransplantaten identifiziert wurden, aufgetragen (Abbildung 3B) und wir haben sie der Genexpression im sc-RNAseq-T-Zell-Cluster gegenübergestellt (Abbildung 7A). Der Anteil der Gene, auf die sowohl miR150-5p abzielte als auch spezifisch in T-Zellen während MVI unterexprimiert wurden, war überraschend niedrig (15/58, 25,9 %), was darauf hindeutet, dass die globale Abnahme dieser Gene in vivo nicht ausschließlich auf die zurückzuführen ist T-Lymphozyten-Kompartiment. Dennoch haben wir aus dieser hochselektierten Liste von 15 Genen und unter Verwendung der OMICSnet-Plattform ein Gennetzwerk konstruiert (Abbildung 7B) und eine Genontologieanalyse durchgeführt (Abbildung 7C). Wir haben beobachtet, dass eine miR-150-5p-Überexpression mit NF assoziiert war -KB-Regulierung in T-Lymphozyten während MVI.

miR-155-5p reguliert mRNA-Spleißen in APCs während MV Schließlich wurde genau die gleiche Strategie für die 52miR-155-5p-Zielgene angewendet, die während MVI unterexprimiert wurden (Abbildung 3B). Im Gegensatz zu miR-150-5p in T-Lymphozyten beobachteten wir, dass fast zwei Drittel der miR-155-5p-Zielgene waren im APC-sc-RNAseq-Cluster konsistent verringert (31/52,59,6 Prozent, Abbildung 8A). Die Gennetzwerkanalyse ergab, dass AIFMI und CIAO1 zentrale Gene waren (Abbildung 8B). Darüber hinaus zeigte die Genontologie eine starke Anreicherung in Wegen, die mit dem mRNA-Spleißen zusammenhängen (Abbildung 8C).

DISKUSSIONDurch ihr einzigartiges Design ist die BIOMARGIN-Studie der typische Rahmen für die Multi-Omic-Datenintegration. Tatsächlich wurden sehr robuste Pipelines sowohl in Entdeckungs-, Auswahl- als auch Validierungskohorten verwendet, die eine große Anzahl von Patienten aus verschiedenen Transplantationszentren umfassten. In den drei unabhängigen Kohorten beobachteten und bestätigten wir gleichzeitig das besondere Expressionsprofil von 6 miRNAs während MVI: miR-139-5p war verringert, während miR-142-3p/150-5p/{{5} }p/222-3p und miR-223-3p wurden erhöht. Wichtig ist, dass der Spiegel jeder dieser 6 miRNAs mit dem MVI-Schweregrad korrelierte, was auf einen dosisabhängigen Regulationsmechanismus hindeutet. Als nächstes verwendeten wir Siliziumplattformen, um jeden miRNA-Zellursprung zu untersuchen. Auffallenderweise wurden zwei unterschiedliche Gruppen von miRNAs beobachtet: eine erste, die von infiltrierenden Immunzellen stammt, und eine zweite, die spezifischer für den Bewohner istNieren-Zellen. Anschließend wurden sowohl miRNAs als auch mRNAs in demselben Discovery-Set von Biopsieproben gemessen, was eine integrierte Analyse von in vivo validierten, differentiell exprimierten mRNAs/miRNAs im Zusammenhang mit MVI ermöglichte. Nachdem wir schließlich die mRNAs/miRNAs-Assoziation bei der Massengewebeauflösung beschrieben hatten, bestätigten wir das Zusammenspiel von mRNAs/miRNAs bei der Einzelzellauflösung für vier der 6 identifizierten miRNAs.

Interessanterweise war miR-139-5p die einzige miRNA, die negativ mit MVI-Läsionen korrelierte. Es stammt hauptsächlich aus EC und es wurde berichtet, dass es MHC-verwandte Gene reguliert. Unter seinen Zielgenen wurde UBE2D1 während der mit MVI assoziierten endothelialen Aktivierung stark hochreguliert. Die UBE2D-Familie ist eine E2-Ubiquitin-konjugierende Enzymfamilie im Ubiquitin-Proteasom-System(29, 30) und es wurde gezeigt, dass UBeD1 die March-I-Ubiquitinierung verstärkt, was zur Hochregulierung von MHC-Klasse-II-Proteinen führt(31). Darüber hinaus war GBP5 die am häufigsten vertretene Gen-inaktivierte EC während MVI, was mit unseren jüngsten Berichten übereinstimmt, die zeigen, dass GBP5 in ABMR-Biopsien (17), aber auch in Blutproben (32) stark hochreguliert ist. Interessanterweise wurde gezeigt, dass die GBP5-Expression zusammen mit CXCL9 und CXCL10 durch Typ-II-Interferon in humanen mikrovaskulären Endothelzellen des Uterus induzierbar ist (33). Die frühe Rolle dieser beiden proinflammatorischen Chemokine bei akuten Abstoßungsprozessen ist gut dokumentiert, und ihre Konzentration im Urin wird vorgeschlagen, um das akute Abstoßungsrisiko bei der routinemäßigen Überwachung von Nierentransplantatempfängern zu überwachen (34). Ein weiteres miR-139-5p-Ziel ist YWHAG. YWHAG kodiert für die Proteinfamilie von HLA-F und wurde als während des aktiven profibrotischen Prozesses bei diabetischer Nephropathie unterschiedlich exprimiert beschrieben (35). Die mögliche Rolle von miR-139-5p bei Fibrose, einem letzten gemeinsamen Weg nach einer Entzündung, ist umso relevanter, als IFTA kürzlich in einen zusammengesetzten Score aufgenommen wurde, um das Überleben von Nieren-Allotransplantaten nach ABMR vorherzusagen(36). Insgesamt legen diese Ergebnisse nahe, dass miR-139-5p die MCH-Antigenexpression an der Anethum-Oberfläche während MVI nicht mehr unterdrückt und am Chemoattraktions- und Fibroseprozess teilnehmen könnte, aber diese Mechanismen müssen noch experimentell bestätigt werden Expression an der Endotheloberfläche während MVI und könnten an Chemoattraktions- und Fifibroseprozessen teilnehmen, aber diese Mechanismen müssen noch experimentell bestätigt werden.

Der ZweiteNieren--abgeleitete miRNA, die wir identifiziert haben, ist miR-222- 3p, deren Expression sich als spezifischer für MVI-Läsionen herausstellte: Sie ist mit g- und PTC-Scores sowie mit C4d-Ablagerung assoziiert, aber nicht mit i- oder t-Läsionen. Es entstand jedoch hauptsächlich aus Epithelzellen. Nach Multiomic-Integration bei Zellauflösung stellten wir fest, dass miR-222-3p hauptsächlich die ErbB-Signalgebung unterdrückt, die für grundlegende Zellfunktionen wie Proliferation, Migration, Wachstum und Differenzierung entscheidend ist (37). In der Humanbiologie wird die physiologische ErbB-Signalgebung benötigtNieren-Elektrolythomöostase und Aufrechterhaltung der Nierenintegrität (38). Unsere Ergebnisse identifizierten auch ADAM22, NRG1, ZNF91 als ErbB-Signalisierungs-verwandte Gene, die während MVI im Epithel besonders reprimiert wurden. Andere Gene, die für die Nierenphysiologie essentiell sind, wie ATP1B1 und KIF3B, wurden ebenfalls im Nierenepithel durch miR-222-3p während MVI reprimiert. Früher haben Baker et al. zeigten, dass ATP1B1 (b1-Untereinheit von Na plus /K plus -ATPase) antreibtNieren-tubuläre Reabsorption von Natrium (39). Darüber hinaus haben Aguado-Fraile et al. haben das Mitglied der Kinesin-Familie 3B (KIF3B) als am Zelltransport in proximalen Tubuluszellen der Ratte beteiligt identifiziert. KIF3B scheint ein Schlüsselmediator der Reaktion proximaler epithelialer Tubuluszellen auf Ischämie/Reperfusion zu sein, mit potenzieller Anwendung inNieren-ischämisches Schadensmanagement (40). Wir können daher spekulieren, dass miR-222-3p wesentliche physiologische Signalwege während MVI im Epithel unterdrückt. Darüber hinaus werden auch immunbezogene Signalwege durch miR-222-3p-Überexpression reguliert: Wichtige Gene wie TRAP1 und PEBP1 wurden in Proben mit starkem MVI vollständig gehemmt. Interessanterweise zeigte sich, dass TRAP1 besser wurdeNieren-tubulointerstitielle Fibrose bei Mäusen mit einseitiger Harnleiterobstruktion durch SchutzNieren-tubuläre Epithelzellen-Mitochondrien (41). Darüber hinaus bietet PEBP1 entzündungshemmende Wirkungen durch Hemmung sowohl des MAPK- als auch des NF-kB-Weges unter homöostatischen/basalen Bedingungen (42). ImNieren-Epithel, eine Studie von Marko et al. zeigten elegant, dass die postischämische NF-kB-Aktivierung die tubuläre Verletzung verschlimmert und die Entzündung verschlimmert (43). In unseren Händen wurde PEBP1 vollständig durch miR-222-3p unterdrückt, was darauf hindeutet, dass der NF-kB-Weg während MVI freigesetzt wird. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Epithelbiologie während MVI und gestört istNieren-Epithelzellen reagieren aktiv auf MVI-Verletzungen, während die Beteiligung dieses Gewebes an MVI selten angesprochen wird. Diese molekularen Erkenntnisse könnten ein neues Licht auf akute tubuläre Verletzungen werfen, ein gut etabliertes, aber lange vernachlässigtes ABMR-Kriterium. Außerdem wurde gezeigt, dass Epithelzellen exosomales miR-222-3p sezernieren und den M2-Phänotyp in Makrophagen induzieren können (44). Inzwischen haben Li et al. berichteten kürzlich, dass M2-Makrophagen miR-155 überexprimieren und diese miRNA in die Mikroumgebung abgeben, auch durch sekretierende Exosomen. Bei Nierentransplantationen war miR-155 bei verschiedenen Zuständen (IFTA, akute Abstoßung und TCMR) und in Körperflüssigkeiten oder Geweben erhöht (45). Interessanterweise kann miR- 155 den epithelial-mesenchymalen Übergang fördern, indem es auf RASSF4 in Epithelzellen abzielt (46). Dieses miRNA-basierte Crosstalk zwischen Makrophagen undNieren-Epithelzellen müssen noch beurteilt werdenNierentransplantationund insbesondere im Zusammenhang mit MVI. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen beobachteten wir, dass miR-155-5p hauptsächlich von APCs exprimiert wurde, die Monozyten und Makrophagen umfassten. In dieser speziellen Untergruppe zeigte die miR- 155-5p-Zielgen-Ontologie eine Anreicherung in premRNA-Spleißwegen. Interessanterweise haben Janssen et al. berichteten, dass eine Lungenentzündung prä-mRNA-Spleißwege in Alveolarmakrophagen induzierte. Darüber hinaus unterschied sich die Prä-mRNA-Splicing-Aktivierung in geweberesidenten Makrophagen im Vergleich zu (aus Blut rekrutierten) von Monozyten stammenden Makrophagen. Es wurde über Veränderungen im Kernstoffwechsel in rekrutierten Makrophagen berichtet, mit erhöhtem Efflux durch die Glykolyse und verringertem Efflux durch den Tricarbonsäurezyklus (TCA-Zyklus, dh Krebszyklus) (47). In Bezug auf miR-150-5p fanden wir heraus, dass seine Überexpression während MVI mit dem NF-kB-Weg im Lymphozytencluster assoziiert war, der sowohl angeborene NKT-Zellen als auch adaptive T-Zellen umfasste. Interessanterweise ist miR-150-5p entscheidend für die Erzeugung reifer und funktioneller NK-Zellen (48) und miR-150-5p-defiziente CD8 plus T-Zellen wurden als weniger zytotoxisch beschrieben (49). Außerdem können CD8-T-Zellen auch miR-150-5p in Exosomen sezernieren (50), was wiederum die Aktivierung von Fibroblasten in tubulären Epithelzellen und in der Folge fördern könnteNieren-Fifibrose, wie in neueren Berichten vorgeschlagen (51, 52).

CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN

Unsere Studie hat einige Einschränkungen. Wir konzentrierten unsere Forschung auf 6 miRNAs, die in unserem mehrstufigen Design konsistent identifiziert wurden. Wir gingen jedoch mit einer schrittweisen miRNA-Auswahl vor, wobei nur ein Bruchteil aller bekannten miRNAs in der Validierungskohorte quantifiziert wurde. Der statistische Weg für die miRNA-Auswahl stützte sich auf das ursprüngliche Design von BIOMARGIN, das geeignet war, diagnostische Biomarker für mehrere Endpunkte (ABMR, aber auch TCMR und IFTA) zu identifizieren. Daher wurde miR-146a in der Validierungskohorte nicht quantifiziert, obwohl es in den Entdeckungs- und Auswahlkohorten signifikant erhöht war (Abbildung 2A). Dadurch wurde miR-146a de facto aus unserem Auswahlprozess ausgeschlossen, obwohl die Literatur eine Rolle bei Ischämie/Reperfusion bei Nierentransplantationen (53) und bei der Treg-vermittelten Kontrolle von Alloimmunantworten nahelegt (54). Darüber hinaus können wir nicht ausschließen, dass eine stärkere Stichprobengröße mehr miRNAs ergeben hätte, wie z. B. miR{-138 (down) und miR-511 (up), die in ABMR-Fällen der Auswahlkohorte unterschiedlich exprimiert wurden und zeigte einen Trend in die gleiche Richtung in der Discovery-Kohorte. Außerdem haben wir keine sc-RNAseq-Analyse an unseren eigenen Biopsieproben durchgeführt, sondern einen online verfügbaren sc-RNAseq-Datensatz verwendet. Zum Zeitpunkt des Studiendesigns und der Entnahme von Biopsieproben war die scRNAseq-Technologie tatsächlich noch nicht verfügbar, und der Bedarf an frisch entnommenen Proben erlaubte nicht die nachträgliche Verwendung von gefrorenen oder in Paraffin eingebetteten Proben. In ähnlicher Weise wurde das mRNA-Profiling mit Microarrays durchgeführt, der damaligen Benchmark-Technologie, die jetzt von RNA-seq der nächsten Generation übertroffen wurde. Die Verwendung eines online verfügbaren sc-RNAseq-Datensatzes schränkt unsere Fähigkeit ein, die grundlegenden demografischen Merkmale der Patienten zu melden. Diese fehlenden Informationen könnten Bedenken hinsichtlich der Repräsentativität von Bevölkerungsgruppen aufkommen lassen. Darüber hinaus haben wir keinen technischen Aspekt der Sequenzierung kontrolliert. Daher hat unsere sc-RNAseq-Analyse bei der gewählten Auflösung keine Neutrophilen- oder NK-Zell-Cluster in diesen Proben nachgewiesen. Daher beschränkten sich unsere nachgelagerten Analysen von miR-142-3p und miR-223-3p auf den Aufbau ihres jeweiligen Zielgennetzwerks und ihrer jeweiligen Ontologie (ergänzende Abbildung S2) und erlaubten keine Untersuchung der Einzelzellauflösung. Das Gennetzwerk und die Ontologie der 27 Zielgene von miR-223-3p zeigten jedoch eine Anreicherung des TCA-Zyklus (ergänzende Abbildung S2) zusammen mit der ERBB-Signalübertragung. Wir können daher spekulieren, dass sowohl miR-155-5p in Monozyten als auch miR-223-3p in Neutrophilen eine Rolle beim Metabolismus und der Entzündungsreaktion spielen, die von diesen Zellen während MVI ausgelöst werden. Außerdem wurde bereits gezeigt, dass miR-142-3p bei der Abstoßung von Nierenallotransplantaten erhöht ist (9, 55, 56), wurde aber bisher nicht spezifisch mit ABMR in Verbindung gebracht. Eine weitere Einschränkung unserer Studie besteht darin, dass spezifische Genexpressionsänderungen in den seltenen infiltrierenden Zellen in der Massengenexpressionsanalyse maskiert werden könnten. Weitere Studien mit mehr Proben sind daher erforderlich, um eine ordnungsgemäße Untersuchung aller, auch seltener Zellsubtypen zu ermöglichen, sind jedoch derzeit durch die relativ hohen Kosten der Technik begrenzt.

Zusammenfassend haben wir hier die molekularen Wege untersucht, die mit MVI, der wichtigsten histologischen Verletzung im Zusammenhang mit ABMR, verbunden sind. Der verwendete integrierte Omics-Ansatz ermöglichte es uns, neue Wege zu entschlüsseln, die an MVI beteiligt sind, und legt nahe, dass Modifikationen des tubulären Epithelstoffwechsels als Folge von ABMR über das nahe gelegene Endothelkompartiment hinaus auftreten. Unsere Studie veranschaulicht das große Potenzial von Multi-Omics zur Entschlüsselung von Krankheitsmechanismen und ebnet den Weg für neue Untersuchungen, um die Wechselwirkungen zwischen ihnen weiter aufzuklärenNieren-residente und Allotransplantat-infiltrierende Zelluntergruppen.