Untersuchung der Wirkung von Hyperthyreose auf den Stress des endoplasmatischen Retikulums und den kanonischen 1-Kanal des transienten Rezeptorpotentials in der Niere

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Nuriye Ezgi BEKTUR AYKANAT^1,*,Erhan ŞAHİN², Sedat KAÇAR², Rıdvan BAĞCI³, Serife KARAKAYA²,Dilek BURUKOĞLU DÖNMEZ², Varol ŞAHİNTÜRK²

¹Abteilung für Histologie und Embryologie, Medizinische Fakultät, Universität Atılım, Ankara, Türkei²Institut für Histologie und Embryologie, Medizinische Fakultät, Osmangazi-Universität, Ankara, Türkei ³Andrologisches Labor der IVF-Abteilung, Bildungs- und Forschungskrankenhaus der Stadt Adana, Adana, Türkei

Hintergrund/Ziel:Hyperthyreoseist mit einer erhöhten glomerulären Filtrationsrate sowie einer erhöhten Renin-Angiotensin-Aldosteron-Aktivierung verbunden. Die Störung der Ca2 plus Homöostase im endoplasmatischen Retikulum (ER) ist mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich diabetischer Nephropathie undHyperthyreose. Der Transient Receptor Potential Canonical 1 (TRPC1)-Kanal ist das erste geklonte Protein der TRPC-Familie. Obwohl es an vielen Stellen in der ausgedrückt wirdNiere, ihre Funktion ist ungewiss. TRPC1 ist an der Regulierung der Ca2-Plus-Homöostase beteiligt, und seine Hochregulierung erhöht den ER-Ca2-Plus-Spiegel, aktiviert die ungefaltete Proteinantwort, was zu Zellschäden in der Zelle führtNiere. Diese Studie untersuchte die Rolle von TRPC1 in derNierenvon hyperthyreoten Ratten in Bezug auf ER-Stressmarker, die Glukose-reguliertes Protein 78 (GRP78), aktivierender Transkriptionsfaktor 6 (ATF6), (Proteinkinase R (PKR)-ähnliche endoplasmatische Retikulumkinase) (PERK), Inosit-erforderndes Enzym 1 sind (IRE1).

Materialien und Methoden: Zwanzig männliche Ratten wurden in Kontroll- und Hyperthyreosegruppen eingeteilt (n=10).Hyperthyreosewurde durch Zugabe von 12 mg/L Thyroxin in das Trinkwasser von Ratten über 4 Wochen induziert. Gemessen wurden Serum-freies T3 und T4 (fT3, fT4), TSH, Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Kreatinin. Die histochemische Analyse vonNiereSchnitte auf morphologische Veränderungen und auch immunhistochemische und Western-Blot-Analysen von Nierenschnitten wurden für GRP78-, ATF6-, PERK-, IRE1-, TRPC1-Antikörper durchgeführt.

Ergebnisse: Die TSH-, BUN- und Kreatininspiegel nahmen ab, während die fT3- und fT4-Spiegel bei hyperthyreoten Ratten anstiegen. Die morphologische Analyse ergab eine Verdickung der kapillaren Basalmembran in den Glomeruli und auch im Western Blot, und die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten einen Anstieg von TRPC1, GRP78 und ATF6 bei hyperthyreoten Ratten (p <>

Schlussfolgerung: Zusammenfassend haben wir in unserer Studie zum ersten Mal gezeigt, dass die Beziehung zwischen ER-Stress und TRPC1 und deren erhöhte Expression Nierenschäden bei hyperthyreoten Ratten verursacht.

Schlüsselwörter:Hyperthyreose, Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER), transientes Rezeptorpotential kanonisch 1 (TRPC1),Niere, Ratte

1. Einleitung

Trijodthyronin (T3) und Thyroxin (T4) sind Schilddrüsenhormone, die für eine normale Organentwicklung und Stoffwechselfunktionen notwendig sind [1]. Außerdem regulieren sie die Wachstumsrate, die Natrium-/Kalium-Pumpfunktion, die Herzfrequenz, den Blutdruck, die Atmung, den Sauerstoffverbrauch, die Verdauung, den Lipid-, Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel, die Funktion des zentralen Nervensystems, Bewegungen und Stoffwechselfunktionen anderer endokriner Drüsen [2]. .

Hyperthyreosehat viele Auswirkungen auf Cholesterin, Triglyceride, Lipide, Oxidation, Antioxidantien, Malondialdehyd (MDA), Katalysatorenzym Katalase (CAT), Leberenzyme, Harnsäure, Harnstoff, Kreatinin und histopathologische Veränderungen in Leber und Niere [3]. Eine Schilddrüsenfunktionsstörung beeinflusst die Nierenphysiologie und -entwicklung. Bei Hypothyreose, bei der die Schilddrüse weniger arbeitet, nimmt die Nierenmasse (Niere/Körpermasse-Verhältnis) ab, während beiHyperthyreosein denen die Drüse hart arbeitet, nimmt die Nierenmasse zu [4]. Eine schwere Hyperthyreose führt jedoch zu einem Proteinabbau und schließlich zu einer Nierenatrophie. Hyperthyreose verursacht eine Erhöhung des renalen Blutflusses (RBF) und der glomerulären Filtrationsrate (GFR) [5]. Bei Hyperthyreose ist die Reabsorption von Natrium im proximalen Tubulus, die Aktivierung von basolateralem Na plus /K plus ATPase [6], apikalem Na plus /H plus Modifikator [7] und Na plus /Pi Cotransporter [8] erhöht. Außerdem aktiviert das Schilddrüsenhormon den Na plus /Ca2 plus-Modifikator, möglicherweise über den cAMP-verknüpften Signalweg, wodurch die Kalziumabsorption im Blut verbessert wirdNieren[9].

Calcium ist ein zweiter Botenstoff, der die meisten Zellfunktionen reguliert, einschließlich Genexpression und zellulärer Homöostase [10], Freisetzung von Neurotransmittern und neuronaler Funktion [11], Stoffwechsel und Modulation des Zelllebens [12]. Die Familie der Kanäle mit transientem Rezeptorpotential (TRP) ist eine der größten Familien von Kationenkanälen. Die TRP-Familie ist in die Untergruppen TRPC (kanonisch), TRPM (Melastatin), TRPP (Polycystin), TRPV (Vanilloid), TRPML (bukolisch), TRPA (Ankyrin) und TRPN (NOMPC-ähnlich) unterteilt. Es ist bekannt, dass TRPC-Proteine ​​Ca2-plus-durchlässige, nichtselektive Kationenkanäle bilden und daher eine wichtige Rolle bei der Ca2-plus-Signaltransduktion spielen. Die Säuger-TRPC-Familie hat sieben Mitglieder namens TRPC1-TRPC7 [13]. Mitglieder der TRPC-Familie werden in verschiedenen Teilen der exprimiertNiere. TRPC1, das insbesondere bei der diabetischen Nephropathie eine Rolle spielt, wird fast überall in renalen Mesangialzellen, Glomeruli, proximalen Tubuluszellen und im dünnen absteigenden Teil der Henle-Schleife exprimiert, aber seine genaue Funktion ist noch unbekannt [14].

Schwere Ca2+-Störungen können Zellschäden auslösen, die durch Stress des endoplasmatischen Retikulums (ER) als Reaktion auf verschiedene pathologische Zustände verursacht werden [5,15]. Störungen in Ca2 plus Homöostase in ER sind mit vielen Krankheiten assoziiert [16]. ER ist eine intrazelluläre Organelle, die für die Regulierung von Ca2 plus Homöostase und Proteinsynthese und -faltung wichtig ist. Die Modulation der Expression/Funktion von Ca2 plus-durchlässigen Kanälen beeinflusst auch die intrazellulären Ca2 plus-Konzentrationen und folglich Ca2 plus-verwandte Prozesse wie Zellproliferation, ER-Stress, Apoptose und Autophagie. ER-Stress ist ein Zustand, der das Redoxgleichgewicht und die luminale Ca2-Plus-Homöostase stört, was zur Anhäufung ungefalteter/fehlgefalteter Proteine ​​führt. Die Aktivierung der unfolded protein response (UPR) bewirkt einen Anstieg des Glucose-regulierten Proteins 78 (GRP78), des ER-Chaperons, was die Proteinfaltungskapazität des ER erhöht [17]. Die Aktivierung von ER-Stress initiiert die evolutionär konservierte UPR durch die drei Hauptsignalwandler der ER-Membran: PERK, IRE1 und ATF6. Zelldysfunktion und Zelltod treten unter Bedingungen auf, bei denen der ER-Stress chronisch verlängert ist und die Proteinbelastung des ER wesentlich übersteigt. Es ist bekannt, dass einer der Wege, die den Zelltod verursachen und bei chronischen Krankheiten wie Hypoxie, Ischämie/Reperfusionsverletzung, Neurodegeneration, Herzerkrankungen und Diabetes beobachtet werden, auf ER-Stress zurückzuführen ist [12].

Angesichts all dieser Informationen wollten wir die Beziehung zwischen den Wegen der TRPC1-Signaltransduktion und ER-Stress in untersuchenNieren, die allgemein betroffen sind inHyperthyreose.

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2. Materialien und Methoden

2.1. Tiere

Unsere Studie wurde von der lokalen Tierethikkommission der Universität Eskişehir Osmangazi genehmigt (Entscheidung Nr. 634 in der Sitzung Nr. 117 am 30.11.2017) und folgte dem von den National Institutes of Health veröffentlichten Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Zwanzig erwachsene (7–8 Wochen alte) männliche Wistar-Albino-Ratten, erhalten vom Medical and Surgical Experimental Research Center (TICAM), wurden während 12 Stunden bei 24 ± 2 Grad und 55 ± 5 Prozent Luftfeuchtigkeit in einer hellen/dunklen Umgebung gehalten das Experiment. Die Tiere wurden vor dem Experiment 2 Wochen lang in Polycarbonatkäfige gesetzt und konnten sich an die Umgebungsbedingungen anpassen, und dann wurden sie nach dem Zufallsprinzip Kontroll- und Schilddrüsenüberfunktionsgruppen zugeordnet. Die Kontrollgruppe (euthyroid) wurde während des Experiments mit einem Standard-Rattenfutter und Leitungswasser gefüttert. Die Gruppe mit Hyperthyreose wurde mit einer Standard-Rattenfütterung für 4 Wochen und dem Trinken von Leitungswasser mit 12 mg/l Thyroxin gebildet [18]. Am Ende der vierten Woche wurden die Ratten durch intramuskuläre Injektion von Ketamin (45 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) eingeschläfert. Sofort wurden allen Tieren intrakardiale Blutproben entnommen. GanzNierenwurden durch die Nephrektomie entfernt. Dann rechts und linksNierenvon Ratten wurden längs in zwei Stücke geschnitten. Sowohl rechte als auch linke Nierenstücke wurden sowohl für die Western-Blot- als auch für die lichtmikroskopische Analyse verwendet

2.2. Biochemische Analysen

Blutproben wurden 10 Minuten lang bei 11,000 U/min zentrifugiert. Die Seren wurden in Röhrchen gefüllt und bis zum Tag der Analyse bei -80 Grad gelagert. Serum-freies T3 (fT3), freies T4 (fT4) und Schilddrüsen-stimulierendes Hormon (TSH) wurden dann unter Verwendung der ELISA-Technik gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Die Expressionswerte der optischen Dichte (OD) wurden bei 450 nm mit dem BioTek Microplate Reader 800 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) abgelesen, dann wurden die Ergebnisse berechnet. Die kommerziellen Kits für fT3 (YLA0127RA), fT4 (YLA0239RA) und TSH (YLA0047RA) wurden von Shanghai YL Biotech, China, bezogen. Außerdem wurden Serum-Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Kreatininspiegel mit dem Absorptionsphotometrieverfahren von Cobas Integra 400 Plus Roche (Roche Diagnostics Ltd., Schweiz) gemessen.

2.3. Histologische Auswertung

NiereStücke, die zur Untersuchung auf Lichtmikroskopebene entnommen wurden, wurden 48 Stunden lang in 1 0 Prozent Formaldehyd fixiert. Nach routinemäßiger Gewebeverarbeitung wurden Paraffinblöcke erhalten. Dann wurden 5-µm-Serienschnitte genommen und mit der Perjodsäure-Schiff-Technik (PAS) gefärbt. Die mikroskopische Bewertung wurde für Glomeruli und Tubuli unter einem Olympus BX-51-Mikroskop (Olympus America, Inc., New York, USA) durchgeführt. Die Schnitte wurden verblindet, halbquantitativ unter Verwendung einer etablierten Bewertungsskala bewertet. Für jede Ratte in den Gruppen wurden mindestens 10 Hochleistungsfelder (× 1000) untersucht. Der Prozentsatz der Glomeruli, die eine Verdickung der glomerulären Basalmembran aufwiesen, wurde wie folgt bewertet: 0=keine, 1 kleiner oder gleich 25 Prozent, 2=25 Prozent bis 50 Prozent, 3 =50 Prozent bis 75 Prozent , 4 Größer oder gleich 75 Prozent [19]. Die Dicke der glomerulären Basalmembran (µm) wurde mit der ZEISS ZEN 3.0 Microscope Software (Carl Zeiss Microscopy GmbH ZEISS Group, München, Deutschland) gemessen.

2.4. Immunhistochemische Bewertung

Paraffinblockschnitte von jedemNiereGewebe wurden auf positiv geladene Objektträger genommen. Nach der Entparaffinierung wurden die Objektträger durch eine Reihe von abgebautem Ethanol und dann durch Xylol überführt. Die Schnitte wurden mit 3 % Wasserstoffperoxid inkubiert, um endogene Peroxidase-Aktivität zu verhindern. Nach der Antigengewinnung mit Citratpuffer wurden die Schnitte mit einem Pap-Pen abgegrenzt, 3 × 5 min mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann mit Ultra V-Block für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden mit polyklonalem Kaninchen-ATF6-Antikörper (ab203119, Abcam Inc., Cambridge, USA), polyklonalem Kaninchen-IRE1-Antikörper (YID5384, Shanghai YL Biotech Co., Ltd, China), monoklonalem Maus-PERK-Antikörper (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc ., Heidelberg, Deutschland) und monoklonalem Maus-TRPC1-Antikörper (sc133076, Santa Cruz Biotechnology Inc.) über Nacht bei plus 4 Grad unter befeuchteten Bedingungen. Nach 3 × 5 min Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit geeigneten sekundären Antikörpern (sc2359, sc2781, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden sie erneut für 3 × 5 min mit PBS gewaschen und mit Hämatoxylin gegengefärbt. Auf die Objektträger wurde ein Deckglas unter Verwendung von Medien auf Wasserbasis aufgebracht. Die mikroskopische Untersuchung wurde unter Verwendung eines Olympus BX51-Mikroskops und eines computergestützten Bildgebungssystems (Olympus America, Inc., New York, USA) durchgeführt.

Alle immungefärbten Schnitte wurden vom Hauptautor, der gegenüber dem Gruppennamen der Experimente verblindet war, kodiert ausgewertet. TRPC1-, ATF6-, IRE1- und PERK-Expressionen wurden hauptsächlich in den Tubuli und/oder Glomeruli nachgewiesen. Die Ausprägungen wurden halbquantitativ nach dem Prozentsatz an Positiven bestimmtNiereAbschnitte. Die Färbungsintensität wurde in vier Grade eingeteilt: keine ({{0}}), schwach (1), mäßig (2) und stark (3). Der Prozentsatz positiver histologischer Nierenschnitte wurde in 4 Grade eingeteilt: 0 (0 Prozent), 1 (1 Prozent – ​​10 Prozent), 2 (11 Prozent – ​​49 Prozent) und 3 (50 Prozent – ​​100 Prozent). Die Gesamtbewertung war ein Produkt aus zwei Bewertungen und die Endbewertung einer Probe war der Mittelwert von 10 mikroskopischen Feldern. TRPC1, ATF6, IE1 und PERK wurden gemäß der berichteten Methode [20] bewertet.

Cistanche-Nierenfunktion

2.5. Western-Blot-Analysen

Um die Änderungen in der Menge an spezifischem Protein in der zu bestimmenNiereGewebe vonHyperthyreoseund Kontrollgruppen wurden die Nieren in kleine Stücke geschnitten, und die Homogenisierung wurde durch Zugabe von Lysepuffer RIPA zu 2-ml-Röhrchen mit Perlen durchgeführt. Nach der Homogenisierung wurden die Röhrchen bei 4 Grad für mindestens 30 min inkubiert, und dann wurden die Gewebelysate bei 4 Grad, 15,000 g für 20 min zentrifugiert. Der Gesamtprotein enthaltende Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt. Die Proteinbestimmung wurde aus dem Überstand mit einem Qubit 2.0-Gerät (Invitrogen Inc., Waltham, MA, USA) durchgeführt. 50 ug Protein wurden in jede Vertiefung geladen, einer Elektrophorese mit SDS-PAGE Bio-Rad MiniTrans Blot (Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornien, USA) unterzogen und dann mit einer Bio-Rad Trans Turbo-Vorrichtung auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden mit 5 Prozent Rinderserumalbumin (BSA) für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und dann mit monoklonalem Maus-GRP78-Antikörper (sc166490, Santa Cruz Biotechnology Inc.), polyklonalem Kaninchen-ATF6-Antikörper (ab203119, Abcam Inc., Cam Bridge, USA), polyklonaler IRE1-Antikörper aus Kaninchen (YID5384, Shanghai YL Biotech Co. Ltd., China), monoklonaler Maus-PERK-Antikörper (sc377400, Santa Cruz Biotechnology Inc.), monoklonaler Maus-TRPC1-Antikörper (sc133076, Santa Cruz Biotechnology, Inc. ) und monoklonalem Maus-Aktin-Antikörper (sc47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) (zur Ladekontrolle) über Nacht bei 4 Grad. Danach wurden die Membranen für 3 × 10 min mit Waschlösung (TBST) gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit geeigneten sekundären Antikörpern (sc2005, sc2030, Santa Cruz Biotechnology Inc.). Nachdem die Membranen 3 × 10 min mit TBST gewaschen wurden, wurden die Expressionsniveaus von Proteinen in den immunreaktiven Banden durch das Bildgebungssystem (C-Digit, Licor, Cambridge, UK) überwacht. Die Bildergebnisse wurden mit dem Programm Image J 1.49v analysiert.

2.6. statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden mit dem Statistikpaketprogramm IBM SPSS 21.0 (IBM Corp., Armonk, NY, USA) durchgeführt. Das Western-Blot-Experiment wurde dreimal für jede Gruppe wiederholt. Das Signifikanzniveau wurde als p < 0,05="" angenommen.="" der="" shapiro-wilk-test="" wurde="" verwendet,="" um="" die="" normalverteilung="" der="" daten="" zu="" bestimmen.="" der="" varianzhomogenitätstest="" (der="" levene-test)="" wurde="" verwendet,="" um="" zu="" beurteilen,="" ob="" gruppen="" gleiche="" varianzen="" aufwiesen.="" für="" die="" daten,="" die="" eine="" normalverteilung="" zeigen,="" wurde="" ein="" t-test="" bei="" unabhängigen="" stichproben="" durchgeführt.="" der="" mann-whitney-u-test="" wurde="" für="" die="" daten="" durchgeführt,="" die="" eine="" nicht-normalverteilung="">

3. Ergebnisse

3.1. Biochemische Ergebnisse

Die fT3-, fT4- und TSH-Serumspiegel, die BUN-Serumspiegel und die Kreatininspiegel der Rattengruppen sind in Abbildung 1 dargestellt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die fT3- und fT4-Spiegel in der hyperthyreoten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant anstiegen (beide p < {{5="" }}.05).="" außerdem="" wurde="" eine="" signifikante="" abnahme="" der="" tsh-spiegel="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" festgestellt="" (p="">< 0,05)="" (abbildung="" 1a).="" die="" bun-="" (abbildung="" 1b)="" und="" kreatininspiegel="" (abbildung="" 1c)="" im="" serum="" nahmen="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" im="" vergleich="" zur="" kontrollgruppe="" signifikant="" ab="" (beide="" p=""><>

3.2. Histochemische Ergebnisse

Histologische Veränderungen vonNierender Rattengruppen sind in Abbildung 2 dargestellt. Die Nierenhistologie (die Glomeruli, Tubuli und Gefäßstrukturen) war in der Kontrollgruppe typisch (Abbildung 2A). Jedoch,Hyperthyreoseverursachte eine Verdickung der kapillaren Basalmembran im Glomerulus (Abbildung 2B). Die Dicke der glomerulären Basalmembran nahm in der hyperthyreoten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant zu (Abbildung 3–4), (p < 0,05).="" hinsichtlich="" der="" tubulären="" histologie="" gab="" es="" keinen="" offensichtlichen="" unterschied="" zwischen="" der="" kontrollgruppe="" und="" der="" gruppe="" mit="">

Abbildung 1. Spiegel von freiem Triiodthyronin (fT3), freiem Thyroxin (fT4) und Schilddrüsen-stimulierendem Hormon (TSH) der Rattengruppen (a). * Unterschiedlich zur Kontrollgruppe (p < 0.05).="" bun-="" (b)="" und="" kreatininspiegel="" (c)="" im="" serum="" der="" rattengruppen.="" *abweichend="" von="" der="" kontrollgruppe="" (p="">< 0,001)="" wurde="" ein="" unabhängiger="" stichproben-t-test="">

Abbildung 2. Mikroskopische Aufnahmen vonNiereGewebe der Kontroll- (A) und hyperthyroiden (B) Gruppen. In der Kontrollgruppe ist eine typische Nierenhistologie zu sehen (A). In der hyperthyreoten GruppeHyperthyreoseverursachte eine Verdickung der kapillaren Basalmembran im Glomerulus. Eine Verdickung der kapillaren Basalmembran im Glomerulus (Pfeil) wurde beobachtet (B). Es gibt keine offensichtlichen Unterschiede im Nierenmark beider Rattengruppen. (Periodsäure-Schiff (PAS)-Färbung). Balken sind 20 µm und 50 µm.

3.3. Immunhistochemische Ergebnisse

Die immunhistochemischen Reaktionen von TRPC1, GRP78, ATF6, IRE1, PERK und deren Expression werden halbquantitativ gemäß dem Prozentsatz positiver Ergebnisse bestimmtNierender Rattengruppen (Abbildung 5–9). Auch ihre durchschnittliche Variation ist in der Tabelle gezeigt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe stiegen die TRPC1-, GRP78-, ATF6-, IRE1- und PERK-Proteinexpressionen in der hyperthyreoten Gruppe in Glomerulus und Tubuli signifikant an (Abbildung 5–9) (p < 0,="" 000).="" die="" ergebnisse="" zeigten,="" dass="" trpc1="" sowohl="" in="" glomerulären="" als="" auch="" tubulären="" strukturen="" in="" der="" kontrollgruppe="" exprimiert="" wurde="" (abbildung="" 5-1ab)="" und="" seine="" expression="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" erhöht="" war="" (abbildung="" 5-2ab).="" grp78="" wurde="" in="" der="" kontrollgruppe="" nicht="" exprimiert="" (abbildung="" 6-1ab)="" und="" seine="" positive="" reaktion="" wurde="" sowohl="" in="" den="" tubuli="" als="" auch="" in="" den="" glomeruli="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" beobachtet="" (abbildung="" 6-2ab);="" während="" atf6="" in="" der="" kontrollgruppe="" nicht="" exprimiert="" wurde="" (abbildung="" 7-1ab),="" reagierte="" seine="" expression="" sowohl="" in="" den="" tubuli="" als="" auch="" in="" den="" glomeruli="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" positiv="" (abbildung="" 7-2ab).="" ire1="" wurde="" in="" der="" kontrollgruppe="" nicht="" exprimiert="" (abbildung="" 8-1ab),="" und="" seine="" positive="" reaktion="" wurde="" sowohl="" in="" den="" tubuli="" als="" auch="" in="" den="" glomeruli="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" beobachtet="" (abbildung="" 8-2ab).="" während="" perk="" in="" der="" kontrollgruppe="" nicht="" exprimiert="" wurde="" (abbildung="" 9-1ab),="" war="" die="" expression="" von="" perk="" in="" der="" hyperthyreoten="" gruppe="" auf="" die="" tubuli="" beschränkt="" (abbildung="">

Abbildung 3. Vergleich der Dicke der glomerulären Basalmembran zwischen Kontroll- und Hyperthyreosegruppe. *Abweichend von der Kontrollgruppe (p < 0,05)="" wurde="" ein="" unabhängiger="" stichproben-t-test="">

Abbildung 4. Vergleich der Bewertung der Dicke der glomerulären Basalmembran zwischen der Kontroll- und der Schilddrüsenüberfunktionsgruppe. *Im Unterschied zur Kontrollgruppe (p < 0,05)="" wurde="" der="" mann-whitney-u-test="">

3.4. Western-Blot-Ergebnisse

Western-Blot-Ergebnisse (Abbildung 10) zeigten einen statistisch signifikanten Anstieg der TRPC1-, PERK-, ATF6- und GRP78-Expressionen in der hyperthyreoten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (p < 0,05).="" der="" anstieg="" von="" ire1="" war="" statistisch="" signifikant,="" wenn="" auch="" nicht="" so="" stark="" wie="" bei="" anderen="" proteinspiegeln="" (p=""><>Hyperthyreoseverursachten im Vergleich zur Kontrollgruppe einen Anstieg der Expression von GRP78 (2,16-fach), ATF6 (2,82-fach), PERK (1,95-fach), IRE1 (1,60-fach) und TRPC1 (1,53-fach).

4. Diskussion

In dieser Studie haben wir zum ersten Mal vorgeschlagen, wie das Nierengewebe beeinflusst wirdHyperthyreosein Bezug auf die Rollen von ER-Stress und TRPC1-Kanal in diesem Prozess. In unserer Studie verursachte die erhöhte TRPC1-Expression eine Erhöhung der Ca2-Plus-Konzentration in der Zelle, insbesondere eine Verdickung der kapillaren Basalmembran und eine erhöhte GRP78-Expression in den Tubuli, insbesondere in den Glomeruli. Wir glauben, dass ER-Stress bei diesem Prozess der Zellschädigung eine aktive Rolle spielt, insbesondere durch den ATF6- und PERK-Signalwandler im UPR-Signalweg (Unfolded Protein Response).

Wie in vielen Studien wie in unserer Studie [18] zu sehen ist, steigen die fT3- und fT4-Werte bei Hyperthyreose, während der TSH-Spiegel abfällt. Jede Dysfunktion in der Schilddrüse kann die Produktion von fT3 und fT4 beeinträchtigen, was mit verschiedenen Pathologien im ganzen Körper in Verbindung gebracht werden kann [21]. DasNierenspielen eine wichtige Rolle bei der Ausscheidung von Abfallprodukten und Giftstoffen wie Harnstoff, Kreatinin und Harnsäure. Die Beurteilung der Nierenfunktion ist wichtig bei der Behandlung von Patienten mit Nierenerkrankungen oder Pathologien, die die Nierenfunktion beeinträchtigen. Nierenfunktionstests sind nützlich, um das Vorhandensein einer Nierenerkrankung zu identifizieren, die Reaktion der Nieren auf die Behandlung zu überwachen und das Fortschreiten der Nierenerkrankung zu bestimmen. Die Serum-Kreatininspiegel sinken bei Hyperthyreose, nicht nur aufgrund einer Erhöhung der GFR, sondern auch einer Zunahme der Muskelzerstörung. Auch die Abnahme der BUN-Konzentration inHyperthyreosewird auf eine verringerte Expression von Aquaporin 1 und 2 zurückgeführt. Daher verringerten sich die BUN- und Kreatininspiegel in vielen Studien [22] wie in unserer Studie. Unter pathologischen Bedingungen können Zellen die Proteostase verlieren, was zur Akkumulation von ungefalteten und fehlgefalteten Proteinen im ER führt, was den UPR- oder ER-Stress auslöst [23].

Abbildung 5. Immunhistochemische Färbung für TRPC1 in Kontroll- (1A-B) und Hyperthyreose- (2A-B) Gruppen inNiereGewebe. Die Expression von TRPC stieg in der hyperthyreoten Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe (Pfeile). Balken sind 5 0 µm. *Im Unterschied zur Kontrollgruppe (p < 0,000)="" wurde="" der="" mann-whitney-u-test="">

Abbildung 6. Immunhistochemische Färbung für GRP78 in Kontroll- (1A-B) und Hyperthyreose- (2A-B) Gruppen inNiereGewebe. Die Expression von GRP78 ist in der hyperthyreoten Gruppe erhöht (Pfeile). Balken sind 5 0 µm. *Im Unterschied zur Kontrollgruppe (p < 0,000)="" wurde="" der="" mann-whitney-u-test="">

Abbildung 7. Immunhistochemische Färbung für ATF6 in Kontroll- (1A-B) und Hyperthyreose- (2A-B) Gruppen inNiereGewebe. Die Expression von ATF6 ist in der hyperthyreoten Gruppe erhöht (Pfeile). Balken sind 5 0 µm. *Abweichend von der Kontrollgruppe (p < 0,000)="" wurde="" der="" mann-whit-ney-u-test="">

Abbildung 8. Immunhistochemische Färbung für IRE1 in Kontroll- (1A-B) und Hyperthyreose- (2A-B) Gruppen inNiereGewebe. Die Expression von IRE1 ist in der hyperthyreoten Gruppe erhöht (Pfeile). Balken sind 5 0 µm. *Im Unterschied zur Kontrollgruppe (p < 0,000)="" wurde="" der="" mann-whitney-u-test="">

Abbildung 9. Immunhistochemische Färbung für PERK in Kontrollgruppen (1A-B) und Hyperthyreose (2A-B) inNiereGewebe. Die Expression von PERK ist in der hyperthyreoten Gruppe erhöht (Pfeile). Balken sind 5 0 µm. *Im Unterschied zur Kontrollgruppe (p < 0,000)="" wurde="" der="" mann-whitney-u-test="">

Störungen in ER und zytosolischem Ca2 plus Homöostase sind mit vielen Krankheiten verbunden, einschließlich derNiere. Die Störung von ER Ca2 plus Homöostase löst UPR aus, was eine weitere Akkumulation neu synthetisierter Proteine ​​im ER verhindert. Somit zeigt es einen überlebensfördernden Abwehrmechanismus, indem es die Belastung für ER reduziert [24].

Es ist bekannt, dass verschiedene Faktoren ER-Stress induzieren und auslösenNiereSchaden. ER-Stress in der Niere kann eine tubuläre Epithelzelldifferenzierung durch den mesenchymalen Übergang aus dem Epithel, einen renalen tubulären Epithelzellverlust durch Apoptose und schließlich eine Nierenpathologie einschließlich Nephronverlust verursachen, was die Filtrationskapazität der Niere verringert. In der Studie von Dickhout et al. wurde ein ER-Stress-induzierter epithelial-mesenchymaler Übergangsprozess in der renalen proximalen Tubulus-Zelllinie HK-2 für chronische Nierenerkrankungen gezeigt [25]. Zusätzlich zu vielen Studien [9], wie in unserer Studie zu sehen,Hyperthyreoseverursachte eine Verdickung der kapillaren Basalmembran im Glomerulus. Es wurde vermutet, dass die verstärkte Verdickung der kapillären Basalmembran in den Glomeruli als Folge des epithelial-mesenchymalen Übergangsprozesses aufgrund der erhöhten Expression von GRP78 und ER-Stress-Signalwandlern entstanden ist. Die Bedeutung von ER-Stress wurde bei chronischen Erkrankungen gezeigtNiereKrankheit in vielen pathologischen Zuständen. In dem Streptozotocin-induzierten Diabetesmodell in C57BL/6-Mäusen entwickelte sich ER-Stress, und eine schwere Nephropathie, die im zweiundzwanzigsten Monat auftrat, war mit der Regulation von CHOP/GADD153, einer der Komponenten des ER-Stress-vermittelten Apoptosewegs, verbunden [26 ]. Bei Patienten mit nephrotischem Syndrom, IgA-Nephropathie, primärer mesangialer proliferativer Glomerulonephritis und membranöser Nephropathie, einschließlich minimal symptomatischer Patienten, waren die immunhistochemischen Expressionen von GRP78 und einem induzierbaren endoplasmatischen Retikulum (ER) Chaperonmolekül Oxygen-Regulated Protein 150 (ORP150) im Vergleich zu Kontrollen erhöht. Die CHOP/GADD153-Expression war ebenfalls erhöht und eine Kernlokalisierung wurde im proximalen Tubulusepithel von nephrotischen Patienten beobachtet. In menschlichen Nierenzellen, die hohen Konzentrationen von Serumalbumin ausgesetzt waren, wurde eine ER-Stressinduktion beobachtet und es wurde gezeigt, dass sie über den CHOP/GADD153-Weg Apoptose verursacht [25]. Die tubulointerstitielle ER-Stressreaktion wurde bei glomerulären Erkrankungen mit tubulärer Zellapoptose in Verbindung mit Puromycin-Aminonukleosid-Nephrose, Proteinüberladung und Proteinurie in Verbindung mit experimenteller oder humaner diabetischer Nephropathie gefunden [27]. Lorzet al. berichteten, dass Paracetamol, ein Analgetikum und Antipyretikum, Nierentubulusschäden und Apoptose aufgrund von ER-Stress verursacht [28]. Paracetamol induziert eine ER-Stressreaktion, einschließlich Induktion von CHOP und Spaltung von Caspase-12. Eine übermäßige Akkumulation von sekretorischen Proteinen induziert ER-Stress und verursacht Podozytenschäden [29]. Der Komplementangriff induziert auch ER-Stress und aktiviert den PERK-Weg, was zu einer Schädigung der glomerulären Epithelzellen führt. All diese Ergebnisse zeigen, dass ER-Stress eine der Hauptursachen für Nierenschäden ist und die ER-Stressreaktion ein Abwehrmechanismus dagegen istNiereSchaden [30]. In unserer Studie glauben wir, dass 12 mg/l Thyroxin-induzierte Hyperthyreose ER-Stress im Nierengewebe und die dadurch verursachten Schäden verursachtHyperthyreoseim Nierengewebe ist mit der Regulation von insbesondere ATF6 und PERK verbunden.

Der erste geklonte Säugetier-TRP-Kanal, der TRPC1-Ionenkanal, wird in der Zelle innerhalb des ER, der Plasmamembran, der intrazellulären Vesikel und der primären Ziliar gefunden. Es wird fast überall im Gewebe von Menschen und Nagetieren exprimiert. TRPC1 interagiert mit verschiedenen Proteingruppen, einschließlich Ionenkanaluntereinheiten, Rezeptoren und zytosolischen Proteinen, um seine Wirkung auf das Ca2-Plus-Signal zu vermitteln. Es fungiert als nichtselektiver Kationenkanal in Signalwegen, die den Ca2-plus-Einstrom als Reaktion auf die Aktivierung von Zelloberflächenrezeptoren kontrollieren. Durch diese Funktion sind auch Proliferation, Überleben, Differenzierung, Sekretion und Zellmigration sowie Merkmale wie neuronale Wachstumskegel und Myoblastenfusion von chemotropen zellspezifischen Funktionen verfügbar [12].

Es gibt viele Studien zur Veränderung der TRPC1-Expression bei vielen pathologischen Zuständen, die ER-Stress verursachen. Sukumaran et al. zeigten, dass es eine Korrelation zwischen ER-Stress und TRPC1-Expression gibt, die das Zellüberleben in der Speicheldrüse verändern könnte. Sie drückten aus, dass die TRPC1-Expression unter ER-Stressbedingungen abnahm und auch der Zelltod aufgrund von ER-Stress von der CHOP-Expression abhängig war. Erhöhter ER-Stress und Infiltration in Speicheldrüsenzellen von TRPC1-/--knock-out-Mäusen wurden beobachtet [16].

Abbildung 10. DieNiereGRP78-, ATF6-, TRPC1-, IRE1- und PERK-Proteinexpressionsniveaus und Diagramm des Fold Change. Der Anstieg aller Proteine ​​war statistisch signifikant (*p < 0,05),="" ein="" unabhängiger="" stichproben-t-test="" wurde="">

WannNierenvon diabetischen Rattenmodellen untersucht wurde, wurde berichtet, dass die TRPC1-mRNA-Expression verringert war [31]. Bei Patienten mit diabetischer Nephropathie oder Zucker-diabetischen Ratten im Vergleich zu Kontrollen deutete eine verringerte TRPC1-Expression darauf hin, dass TRPC1 die Entwicklung einer diabetischen Nephropathie beeinflusste [32]. TRPC1 spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung von ER Ca2 plus Homöostase, und eine reduzierte Funktion führt zu einer verlängerten Aktivierung des UPR-Signalwegs und unterbricht die Aktivierung von AKT, was dann zu Neurodegeneration führt. Eine Abnahme der TRPC1-Expression wurde im Neurotoxin-induzierten Maus-Parkinson-Krankheitsmodell beobachtet. Eine erhöhte Expression von TRPC1 erhöht das Überleben von Neuronen durch Regulierung des AKT/mTOR-Signalwegs, trotz ER-Stress und UPR, die durch Neurotoxin verursacht werden [33]. Liet al. berichteten, dass die TRPC1-Expression auch bei Namptin-induzierter Kardiomyozyten-Hypertrophie zeitabhängig erhöht war. Wenn das TRPC1-Gen zum Schweigen gebracht wurde, führte dies zu einer Hemmung der Nicotinamid-Phosphoribosyl-Transferase-induzierten Herzhypertrophie. Es wurde jedoch angenommen, dass die Nicotinamid-Phosphoribosyltransferase durch Überexpression von TRPC1 eine Kardiomyozyten-Hypertrophie über einen ER-Stress-induzierten Weg induziert. Aus dieser Sicht kann die Stummschaltung des TRPC1-Gens eine schützende Rolle bei der Prävention von Herzhypertrophie spielen [34]. In unserer Studie nahmen auch ER-Stress und TRPC1 signifikant zu. Dies deutet darauf hin, dass eine kapillare Basalmembranverdickung durch erhöhten ER-Stress im Nierengewebe bedingt istHyperthyreoseist auf eine erhöhte Expression von TRPC1 zurückzuführen.

Diese Studie hat einige Einschränkungen. Gentechnisch veränderte Mäuse könnten anstelle des Thyroxin-induzierten Hyperthyreose-Rattenmodells verwendet worden sein. Mit Urin, der mit Stoffwechselkäfigen gesammelt wurde, einigeNiereFunktionstests könnten auch im Urin gemessen worden sein. Die Veränderung des ER-Stresslevels konnte mit dem TRPC1-Inhibitor untersucht werden.

Als Ergebnis unserer Literaturrecherche wurde die Wirkung einer Hyperthyreose auf die Beziehung zwischen ER-Stress und dem TRPC1-Kanal im Nierengewebe erstmals in dieser Studie nachgewiesen. Das wurde festgestelltHyperthyreoseverursachte eine Erhöhung der TRPC1-Expression, die ER-Stress induziert. Wir schlagen vor, dass die Verringerung der TRPC1-Expression eine mögliche therapeutische Strategie für Hyperthyreose-induzierte sein könnteNiereund vielleicht andere Organschäden.

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