Warum kann der Retinsäurerezeptor-Responder1 die Entwicklung glomerulärer Erkrankungen fördern?

Retinsäurerezeptor-Responder1 fördert die Entwicklung glomerulärer Erkrankungen über den Nuklearfaktor-kB-Signalweg

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Katja Möller-Hackbarth1,2 , Dina Dabaghie1,2 , Emmanuelle Charrin1,2 , Sonia Zambrano1,2, Guillem Genove´ 1,3 , Xidan Li1,3 , Annika Wernerson4 , Mark Lal5 und Jaakko Patrakka1,2

1 KI/AZ Integrated Cardio Metabolic Centre, Karolinska Institutet am Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Schweden; 2 Department of Laboratory Medicine, Division of Pathology, Karolinska Institutet am Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Schweden; 3 Department of Medicine Huddinge, Karolinska Institutet am Karolinska University Hospital, Huddinge, Stockholm, Schweden; 4 Department of Clinical Sciences, Intervention and Technology, Division of Renal Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden; und 5 Bioscience Renal, Research, and Early Development Cardiovascular, Renal and Metabolism (CVRM), R&D Biopharmaceuticals, AstraZeneca, Göteborg, Schweden

Kidney International (2021) 100, 809–823; https://doi.org/10.1016/j.kint.2021.05.036

Copyright ª 2021, Internationale Gesellschaft für Nephrologie. Veröffentlicht von Elsevier Inc. Dies ist ein Open-Access-Artikel unter der CC BY-Lizenz

Korrespondenz: Jaakko Patrakka, Department of Laboratory Medicine, Division of Pathology, Karolinska Institutet, Blickagången 6, SE-141 57 Huddinge, Schweden. E-Mail: jaakko.patrakka@ki.se Eingegangen am 27. Juli 2020; überarbeitet am 11. Mai 2021; angenommen 20. Mai 2021; online veröffentlicht am 18. Juni 2021

SCHLÜSSELWÖRTER: glomerulärEndothelzelle; NF-kB; Podozyt; Selten1

Entzündungswege werden in den meisten Fällen aktiviertglomeruläre Erkrankungenaber die molekularen Mechanismen, die sie im Nierengewebe antreiben, sind kaum bekannt. Wir haben uns identifiziertdie RetinsäureResponder Responder 1 (Rarres1) als stark an Podozyten angereichertes Protein in gesunden Nieren. Studien an Podozyten-spezifischen Knockout-Tieren zeigten, dass Rarres1 nicht für die normale Entwicklung oder Aufrechterhaltung der Glomerulus-Filtrationsbarriere benötigt wird und das Ergebnis einer Nierenerkrankung in einem Glomerulonephritis-Modell nicht moduliert. Interessanterweise haben wir eine Induktion der Rarres1-Expression in glomerulären und peritubulären kapillaren Endothelzellen bei IgA und diabetischer Nierenerkrankung sowie bei ANCA-assoziierter Vaskulitis festgestellt. Die Analyse öffentlich zugänglicher RNA-Datensätze zeigte, dass die Induktion der Rarres1-Expression ein gemeinsamer molekularer Mechanismus bei chronischen Nierenerkrankungen ist. Eine konditionale Knock-in-Mauslinie, die Rarres1 spezifisch in Endothelzellen überexprimiert, zeigte keinen offensichtlichen Nierenphänotyp. Die Überexpression förderte jedoch das Fortschreiten der Nierenschädigung in einem Glomerulonephritis-Modell. Dementsprechend wurden bedingte Knock-out-Mäuse, denen Rarres1 in Endothelzellen fehlt, im Krankheitsmodell teilweise geschützt. Mechanistisch förderte Rarres1 Entzündung und Fibrose über den Transkriptionsfaktor Nuclear Factor-kB-Signalweg durch Aktivierung der Rezeptortyrosinkinase Axl. Daher ist die Induktion der Rarres1-Expression in Endothelzellen ein vorherrschender molekularer Mechanismus bei menschlichen Glomerulopathien, und dies scheint eine pathogene Rolle beim Antreiben von Entzündungen und Fibrose über den Nuclear Factor-kB-Signalweg zu spielen.

Übersetzungserklärung

Wir identifizierten die Hochregulierung vondie RetinsäureRezeptor-Responder-Protein 1 (Rarres1) in Endothelzellen (ECs) von häufigen menschlichen Glomerulopathien. Die Induktion scheint eine pathogene Rolle in zu habenglomeruläre Erkrankungda das Fortschreiten der Glomerulonephritis (i) in einer Maus verschlimmert wurde, die Rarres1 spezifisch in ECs überexprimierte, und (ii) in einer EC-spezifischen Rarres1-Knockout-Linie gebessert wurde. Rarres1 kann ein Biomarker zum Nachweis von mikrovaskulären Schäden bei Nierenerkrankungen und möglicherweise ein neuartiges therapeutisches Ziel sein.

Glomeruläre ErkrankungProzesse sind eine der Hauptursachen für Nierenerkrankungen im Endstadium. Die diabetische Nephropathie (DN) ist weltweit die häufigste Ursache einer Nierenerkrankung im Endstadium, während die IgA-Nephropathie (IgAN) die am weitesten verbreitete primäre Glomerulonephritis (GN) ist.1,2 Histologisch manifestiert sich der glomeruläre Schaden bei diesen häufigen Erkrankungen sehr ähnlich Mode. Dazu gehören die Aktivierung von glomerulären Endothelzellen (GECs), die Expansion der extrazellulären Matrix, die Proliferation von Mesangialzellen, Podozytenschädigung und schließlich Podozytenverlust.3

Globale Transkript-Profiling-Studien in menschlichen Nierenbiopsien haben eine starke Entzündungssignatur bei glomerulären Erkrankungen gezeigt,4–7 und Studien an Mäusen haben gezeigt, dass die Aktivierung des Kernfaktors kB (NF-kB) und des transformierenden Wachstumsfaktors b (TGF-b) Signalwege spielen eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit.8,9 Wichtig ist, dass das pharmazeutische Targeting des NF-kB-Signalwegs renoprotektive Wirkungen in Tiermodellen hat, was darauf hinweist, dass der Signalweg ein potenzielles Ziel für eine Behandlung istglomeruläre Erkrankungen.10,11 In Podozyten identifizierten wir kürzlich G-Protein-gekoppelte Rezeptoren der Klasse C, Gruppe 5, Mitglied B, als Modulator der NF-kB-vermittelten Entzündungsreaktion.12 Die Aktivierung von Entzündungswegen bei Glomerulopathien wird jedoch wahrscheinlich von mehreren Zelltypen angetrieben . Tatsächlich wird die Aktivierung des NF-kB-Signalwegs in GECs bei vielen menschlichen Nierenerkrankungen nachgewiesen.13,14 Die molekularen Mechanismen, die an der NF-kB-Aktivierung in GECs beteiligt sind, sind kaum bekannt.

Retinsäure-Rezeptor-Responder1 kann die Entwicklung von fördernGlomeruläre Erkrankungen

In dieser Studie haben wir molekulare Signaturen des Menschen analysiertglomeruläre Erkrankungenund identifiziert die Induktion vondie RetinsäureRezeptor-Responder 1 (Rarres1)-Expression in GECs als gemeinsame molekulare Signatur bei DN-, IgAN- und anti-neutrophiler zytoplasmatischer Autoantikörper (ANCA)-assoziierter Vaskulitis. Studien an Mauslinien mit Aktivierung/Inaktivierung der Rarres1-Expression in Endothelzellen (ECs) zeigen, dass diese Induktion in einem Mausmodell von GN eine pathogene Rolle spielt. Mechanistisch aktiviert Rarres1 die Rezeptortyrosinkinase Axl, was zur Aktivierung des NF-kB-Signalwegs führt. Wir schlagen Rarres1 als neuen Biomarker für mikrovaskuläre Schäden vor, der ein attraktives therapeutisches Ziel für sein könnteglomeruläre ErkrankungProzesse durch Modulation von Entzündungsreaktionen.

Abbildung 1|(Fortsetzung) (c) BackSPIN-Analyse, die die Rarres1-Expression speziell in Podozyten (PD) in RNAseq-Daten von murinem Nierengewebe zeigt (Daten von Woroniecka et al.6). (d) Relative mRNA-Spiegel von Rarres1 in isoliertem Tub und Glom aus menschlichen Proben. Die Daten werden als fache Änderung der Rarres1-Expression in Glom im Vergleich zu Tub ausgedrückt. *P < 0.05="" gegenüber="" wanne.="" (e)="" repräsentatives="" konfokales="" fl-fluoreszenzmikroskopbild="" der="" rarres1-expression="" (grün)="" durch="" podozyten="" in="" menschlichen="" glomeruli="" von="" normalen="" probanden.="" (f)="" repräsentative="" konfokale="" mikroskopische="" bilder,="" die="" die="" expression="" von="" rarres1="" in="" podozyten="" von="" menschlichen="" probanden="" zeigen;="" vimentin="" wurde="" als="" marker="" für="" hauptfortsätze="" und="" nephrin="" als="" marker="" für="" fußfortsätze="" von="" podozyten="" verwendet.="" cd31="" wurde="" als="" marker="" für="" endothelzellen="" verwendet,="" und="" ⍺-actin="" der="" glatten="" muskulatur="" (⍺sma)="" wurde="" als="" mesangialzellmarker="" verwendet.="" stangen="50/10 mm." die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" der="" student's="" t-test="" wurde="" für="" vergleiche="" zwischen="" 2="" gruppen="" verwendet.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

METHODEN

RNA-Extraktion und Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

Glomeruli wurden wie zuvor beschrieben isoliert.15 RNA wurde unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen) und RNeasy-Kit (Qiagen Inc.) extrahiert. Zur Generierung von cDNA wurde das iScript cDNA Synthesis Kit verwendet. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion wurde mit dem CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System mit SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) durchgeführt. Die verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Die relativen Expressionsniveaus wurden unter Verwendung der 2-DDCT-Methode berechnet.

Zellkultur

Human podocytes were cultured as described.16 JetPEI transfection reagent (Polyplus-transfection SA) was used for stable transfection of pRP[Exp]-CMV>hRARRES1[ORF011242]:T2A: Bsd – Plasmid (VectorBuilder Inc. Klone haben unter Puromycin (Merck KGaA) Selektion expandiert. Die Transfektion von short interfering RNA (siRNA) für Axl/Rarres1 wurde unter Verwendung von siRNA von Origene durchgeführt. Zellen wurden mit 30 nM transfiziert siRNA gefolgt von Komplexierung mit JetPEI-Transfektionsreagenz (Polyplus-transfection SA) mit oder ohne TGF-b1-Stimuli (10 ng/ml in Kulturmedium) Der Axl-Inhibitor R428 (Selleck Chemicals) wurde 1 Stunde vor der Behandlung hinzugefügt (3 mmol/ l).

Warum Retinsäurerezeptor-Responder1 die Entwicklung fördern kannGlomeruläre Erkrankungen?

westlicher Fleck

Die Zellen wurden mit RIPA-Lysepuffer, ergänzt durch Protease/Phosphatase-Hemmcocktails (Roche), lysiert. Proteine ​​aus Kernfraktionen wurden unter Verwendung des Nuclear Extract Kit (Active Motif Europe) isoliert. Lysate wurden auf 4 % – 12 % Tris-Glycin-Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel (Invitrogen) getrennt und auf Polyvinylidendifluorid-Membranen (Bio-Rad) übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % Rinderserumalbumin (Merck) blockiert. Die Inkubation mit primären Antikörpern wurde über Nacht durchgeführt (Antikörper in Ergänzungstabelle S2). Meerrettichperoxidase-konjugierte Sekundärantikörper und Clarity Western ECL-Substrat (Bio-Rad) wurden verwendet, um Signale nachzuweisen. Western-Blot-Analysen wurden mindestens zweimal durchgeführt.

RNA-in-situ-Hybridisierung

Die RNAscope-Analysen wurden in in Paraffin eingebetteten menschlichen Nieren gemäß dem Herstellerprotokoll (ACD) durchgeführt. Die verwendeten Sonden waren NPHS1 - Kat. Nr. 416071-C2, PECAM1 - Kat. Nr. 487381-C3 und RARRES1 - angepasste Sonde, die auf die Nukleotide {{8 }}.

Beurteilung einer Nierenschädigung

Das Albumin- und Kreatininverhältnis im Urin wurde mit dem Mausalbumin-ELISA-Kit (Allbuwell M; Ethos Biosciences) und dem QuantiChrom Creatinine Assay Kit (BioAssay Systems) bewertet. Nierengewebe wurden in 10 % neutral gepufferter Formalinlösung fixiert und in Paraffin eingebettet, gefolgt von Schneiden und Periodsäure-Schiff-Färbung. Elektronenmikroskopie wurde an Proben durchgeführt, die in 2,5 Prozent Glutaraldehyd fixiert waren.

Immunfärbungen

In Paraffin eingebettete Gewebe wurden für 24 Stunden in Formalin fixiert. 5-Mikrometer-Schnitte wurden entparaffiniert und entweder in Tris-Ethylendiamintetraessigsäure-Puffer (10 mM Tris-Base, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure-Pufferlösung, 0.05 Prozent Tween) mikrowellenbehandelt 20, pH 9,0) oder Natriumcitratpuffer (10 mM Natriumcitrat, 0,05 % Tween 20, pH 6,0), gefolgt von Permeabilisierung mit 0,3 % Triton X-100 und Blockierung mit 10 Prozent normalem Ziegenserum, 3 Prozent Wasserstoffperoxidase und dem Vector Blocking Kit (Vector Laboratories). Objektträger wurden unter Verwendung des DAB-Peroxidase (Meerrettichperoxidase)-Substratkits, 3,30 -Diaminobenzidin (Vector Laboratories), entwickelt.

Für gefrorene Schnitte wurden Aceton-fixierte Schnitte mit 0,1 Prozent Tween 20 permeabilisiert und mit 10 Prozent normalem Ziegenserum blockiert. Die verwendeten primären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle S1 aufgeführt. Sekundäre Alexa-Fluor-Antikörper für die Immunfluoreszenz wurden von Molecular Probes (Life Technologies) bezogen. Bilder wurden unter Verwendung des Konfokalmikroskops Leica SP8 (Leica Microsystems) erhalten.

Menschliche Proben

Nierenbiopsien wurden vom Karolinska University Hospital (Stockholm, Schweden) erhalten. Kontrollproben wurden von den gesunden Nierenpolen von Individuen erhalten, die sich einer Tumornephrektomie unterzogen hatten. Die lokale Ethikkommission genehmigte die Studie (Genehmigung Nr. 2010/579-31/1, Stockholm, Schweden).

versus Kontrolle (Ctrl.) oder ***P < {{0}}.001="" versus="" si-negative="" kontrolle="" (scramble)="" (rarres1,="" n="6" ;="" sirarres1,="" n="4)." (c)="" repräsentative="" western-blot-dokumente="" und="" zusammengefasste="" daten,="" die="" die="" relativen="" proteinspiegel="" von="" pp65="" in="" isolierten="" kernfraktionen="" von="" podozyten="" zeigen,="" die="" mit="" 1="" 0="" ng/ml="" tgf-b1="" behandelt="" wurden.="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< {{40}}.001="" versus="" kontrollpodozyten="" (ctrl.="" )="" (n="3)." (d)="" repräsentative="" western-blot-dokumente="" und="" zusammengefasste="" daten,="" die="" die="" relativen="" proteinspiegel="" von="" pp65="" in="" isolierten="" kernfraktionen="" von="" podozyten="" zeigen,="" die="" mit="" 10="" ng/ml="" tgf-b1="" ±="" 3="" mmol/l="" r428="" behandelt="" wurden,="" n="2." (e)="" repräsentativer="" western="" blot,="" der="" zeigt,="" dass="" eine="" überexpression="" von="" rarres1="" axl="" konstitutiv="" aktiviert.="" *p="">< 0,05="" (n="2)." (f)="" relative="" mrna-spiegel="" von="" emt-bezogenen="" genen="" in="" podozyten,="" die="" rarres1="" überexprimieren="" (rarres1)="" oder="" kontrollpodozyten="" (ctrl.),="" transfiziert="" mit="" sirna="" für="" axl="" (siaxl),="" si-negative="" kontrolle="" (scramble),="" ##p="">< 0,01,="" ##="" #p="">< 0,001="" versus="" scramble,="" n="3," oder="" behandelt="" mit="" 3="" mmol/l="" r428.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" versus="" strg.,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" versus="" rarres1,="" *p="">< 0,05="" versus="" rarres1,="" n="4." die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sd="" ausgedrückt.="" der="" student-t-test="" wurde="" für="" vergleiche="" zwischen="" 2="" gruppen="" verwendet.="" ut,="">

Abbildung 3|Etablierung von Podozyten-spezifischen Rarres1-Knockout-Mäusen (CreD/Rarres1flfl/flfl). (a) Erzeugung von bedingten Knockout-Mäusen, bei denen Rarres1 spezifisch in Podozyten ablatiert wird, indem das Cre-LoxP-Rekombinationssystem verwendet wird. Exon 3 wird bei NPHS2-Cre-vermittelter Rekombination gelöscht. (b) Die Genotypisierung wurde durch Schwanzpräparation und Polymerase-Kettenreaktion im Alter von 4 Wochen bestätigt. (Fortsetzung)

Abbildung 3|(Fortsetzung) (c) Repräsentativer Western Blot, der die verringerte Expression von Rarres1 in isolierten Glomeruli von podozytenspezifischen Rarres1-Knockout-Mäusen (Creþ/Rarres1flfl/flfl) zeigt. (d) Podozyten-spezifischer Verlust von Rarres1 beeinflusst nicht die Albuminurie-Spiegel bei Mäusen, die mit nephrotoxischem Serum (NTS) behandelt wurden, wie anhand des Albumin-zu-Kreatinin-Verhältnisses im Urin in verschiedenen Gruppen von Mäusen (NTS-ctrl., n {{1{{ 15}}}}–7; NTS-Rarres1_cKO, n - 7). (e) Mikrofotografien und Quantifizierungen, die typische Veränderungen der glomerulären Struktur in verschiedenen Gruppen von Mäusen zeigen. Glomeruläre Läsionen wurden in Periodsäure-Schiff-gefärbten Schnitten identifiziert. #P < 0.0001="" versus="" unbehandelte="" kontrolle="" (ctrl.)="" (ctrl.,="" n="" -="" 6;="" nts-ctrl.,="" n="" -="" 9;="" nts-rarres1_cko,="" n="9)." (f)="" repräsentative="" mikrofotografien="" und="" quantifizierungen="" der="" mittleren="" dicke="" der="" glomerulären="" basalmembran="" (gbm)="" und="" der="" anzahl="" der="" schlitze="" pro="" mm="" gbm="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" durch="" transmissionselektronenmikroskopie-analysen.="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001,="" ####p="">< 0,0001="" versus="" unbehandelte="" kontrolle="" (ctrl.,="" n="3;" nts-ctrl.,="" n="4;" nts-rarres{="" {33}}cko,="" n="6)." die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" eine="" einweg-varianzanalyse="" gefolgt="" von="" tukey's="" post-test="" für="" multiple="" vergleiche="" wurde="" für="" gruppen="" von="" 3="" oder="" mehr="" verwendet.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Mauslinien

Befloxte Rarres1-Mäuse mit C57Bl/6J-Hintergrund (Rarres1flfl/flfl; Cyagen) waren Podocin- (B6.Cg-Tg [NPHS2-cre] 295Lbh/J; Jackson Laboratory) und Tie2-Cre-Mäuse (B6.Cg-Tg( Tek-cre)12Flv/J), um zellspezifische Knockout-Mäuse zu erzeugen. Die GT(ROSA)26Sortm1(CAG-Rarres1-T2A EGFP)/J-Mäuse wurden mit einer Tie2-cre-Linie gekreuzt, um die Rarres1-Expression speziell in ECs zu aktivieren.17 Züchtung und Genotypisierung erfolgten gemäß Standard Verfahren. Alle Tierversuche wurden im vorklinischen Labor (Karolinska Institutet) gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt und von der Ethikkommission für die Pflege von Forschungstieren (Linköpings djurförsöksestiska nämd; DNR 1336) genehmigt.

Nephrotoxisches Serum (NTS)-induzierte Nephropathie bei Mäusen

Sieben bis 9- Wochen alte Mäuse erhielten 50 ml komplettes Freund-Adjuvans (Merck) sc, gefolgt von einer NTS-Injektion (iv; 6 ml/kg Körpergewicht; Probetex Inc.) an Tag 4.18 Urin wurde gesammelt 3, 7 , 10 und 14 Tage nach der Injektion, und die Mäuse wurden am Tag 14 getötet.

statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit der Software Prism 9.0 (GraphPad) durchgeführt.

Die Daten wurden zunächst auf Normalität untersucht (Shapiro-Wilk-Test). Wenn die Verteilung Gauß war, wurden die Daten unter Verwendung eines parametrischen Tests analysiert (Student's t-Test für 2 Gruppen und Varianzanalyse mit Tukey's Post-Test für mehr als 2 Gruppen). Wenn die Verteilung nicht gaußförmig war, wurden nichtparametrische Tests (Friedman-Test mit Dunn-Post-Test für mehr als 2 Gruppen und der Mann-Whitney-U-Test für 2 Gruppen) verwendet. Die Unterschiede wurden als signifikant betrachtet, wenn P <>

ERGEBNISSE

Rarres1 wird von Podozyten exprimiert

Wir untersuchten zunächst das Expressionsmuster von Rarres1 in murinem und menschlichem Nierengewebe. Polymerase-Kettenreaktionsanalysen zeigten, dass Rarres1 signifikant höher in der glomerulären als in der tubulointerstitiellen Fraktion der Nierenrinde der Maus exprimiert wird ( 1a und b6 ). Einzelzell-RNA-Sequenzierungsanalysen von murinem Nierengewebe zeigten, dass Rarres1 ausschließlich von Podozyten exprimiert wird (Abbildung 1c). Beim Menschen war Rarres1 auch im glomerulären Gewebe angereichert (Abbildung 1d). Bei der Immunfluoreszenz von normalem menschlichem Nierengewebe zeigte Rarres1 ein hohes Signal in den Glomeruli (Abbildung 1e). Doppelfärbungen zeigten, dass Rarres1 „außerhalb“ der Nephrinreaktivität in den Kapillarschleifen lokalisiert war, was auf Podozytenexpression hindeutet (Abbildung 1f). Die Kolokalisierung mit Vimentin zeigte eine Lokalisierung an Hauptprozessen an. Es wurde keine überlappende Reaktivität für den EC-Marker CD31 oder den mesangialen Marker – Aktin der glatten Muskulatur (Abbildung 1f) – beobachtet.

Rarres1 fördert die NF-kB- und TGF-b1-Signalgebung über die Rezeptortyrosinkinase Axl

Um die Rolle von Rarres1 in Podozyten aufzuklären, manipulierten wir seine Expressionsniveaus in immortalisierten menschlichen Podozyten.16 Rarres1-Spiegel wurden in Podozyten, die stabil mit menschlicher Rarres1-cDNA transfiziert waren, signifikant hochreguliert und nach Transfektion mit Rarres1--gerichteter siRNA herunterreguliert (Abbildung 2a). Die Überexpression von Rarres1 regulierte die Expression von epithelial-mesenchymalen Übergangsgenen hoch, während die Herunterregulierung des endogenen Rarres1 den gegenteiligen Effekt hatte (Abbildung 2b). Da die NF-kB-Signaltransduktion eine wichtige Rolle beim epithelial-mesenchymalen Übergang spielt, der zu Fifibrose und Entzündung bei GN führt,19 haben wir die TGF-b1-induzierte Aktivierung der NF-kB-Signaltransduktion in vitro gemessen. Die Rarres1-Überexpression verursachte eine erhöhte Aktivierung des NF-kB-Signalwegs zu Studienbeginn und nach der TGF-b1-Stimulation (Abbildung 2c). Da berichtet wurde, dass Rarres1 die Rezeptortyrosinkinase Axl aktiviert und auf diese Weise den NF-kB-Signalweg bei entzündlichem Brustkrebs fördert,20 untersuchten wir, ob Axl ein potenzieller funktioneller Partner von Rarres1 im Nierengewebe ist. Die TGF-b1-induzierte NF-kB-Aktivierung konnte durch R428, einen selektiven niedermolekularen Inhibitor der Axl-Kinase21,22 (Abbildung 2d), gehemmt werden, und die Überexpression von Rarres1 korrelierte positiv mit der konstitutiven Aktivierung der Axl-Kinase (Abbildung 2e). Die Erschöpfung der Axl-Aktivität mit R428, aber nicht die Gen-Silencing von Axl durch siRNA, könnte die Rarres1--induzierte Expression von epithelial-mesenchymalen Übergangs-bezogenen Genen verringern, wie durch reduzierte mRNA-Spiegel belegt wird (Abbildung 2f). Bemerkenswert ist, dass keine Aktivierung von nichtkanonischen NF-kB-Wegen festgestellt wurde (ergänzende Abbildung S1). Somit förderte Rarres1 die NF-kB-Signalübertragung in kultivierten Podozyten über die Aktivierung der Axl-Kinase.

Warum kann der Retinsäurerezeptor-Responder1 die Entwicklung glomerulärer Erkrankungen fördern?

Die Inaktivierung von Rarres1 in Podozyten führt nicht zu glomerulären Anomalien oder moduliert das Ergebnis einer Nephropathie in einem GN-Modell mit antiglomerulärer Basalmembran (GBM).

Um die Rolle von Rarres1 in Podozyten in vivo zu analysieren, haben wir eine neuartige Rarres1flfl/flfl (gefloxte) Mauslinie erzeugt und sie mit Podocin-Cre-Mäusen gekreuzt, um Podocin-Cre Rarres1flfl/flfl-Mäuse (Creþ/Rarres1flfl/flfl) zu produzieren (Abbildung 3a ). Genotypen für Floxed/Cre-Allele wurden durch Ohr-Genotypisierung identifiziert (Abbildung 3b). Die Polymerase-Kettenreaktionsanalyse von tubulointerstitiellen und glomerulären Fraktionen sowie von Lebergewebe bestätigte die Deletion von Exon 3 speziell im Glomerulus (ergänzende Abbildung S2A), und die Rarres1-Proteinspiegel waren in Glomeruli von Creþ/Rarres1flfl/flfl-Mäusen reduziert (Abbildung 3c).

Abbildung 4|Hochregulierung von Rarres1 in glomerulären und peritubulären Kapillarendothelzellen bei Patienten mit chronischer Nierenerkrankung. (a) Analysen der Genexpression von Rarres1, Collagen1a2 (COL1A2) und Nephrin (NPHS1) in Microarray-Daten von Glomeruli, die von Patienten mit diabetischer Nephropathie (DN), Vaskulitis, IgA-Nephropathie (IgAN) und Kontrollpersonen (Ctrl.) isoliert wurden. 4,6,24–26 *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0="" .001="" gegenüber="" kontrollpersonen.="" (b)="" quantitative="" polymerase-kettenreaktionsanalyse="" für="" rarres1-,="" col1a2-="" und="" nphs1-gene="" in="" isolierten="" glomeruli="" von="" patienten="" mit="" dn="" (n="5)" und="" kontrollen="" (n="5)." **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" gegenüber="" kontrollpersonen.="" (c)="" analysen="" der="" rarres1-="" und="" col1a2-genexpression="" in="" microarray-daten="" der="" tubulären="" fraktion,="" die="" aus="" dn-,="" vaskulitis-,="" igan-="" und="" kontrollpatienten="" isoliert="" wurde.="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" gegenüber="" kontrollpersonen.="" (d)="" repräsentative="" mikrofotografien="" der="" immunhistochemischen="" rarres1-färbung="" in="" menschlichem="" nierenkortikalgewebe="" von="" kontrollen="" und="" patienten="" mit="" dn="" (n="5)," vaskulitis="" mit="" zytoplasmatischem="" autoantikörper="" (anca)="" gegen="" neutrophile="" granulozyten="" (n="4)" und="" igan="" (="" n="5)." die="" pfeile="" zeigen="" rarres1--positive="" podozyten="" (kontrolle)="" und="" endothelzellen="" (ecs)="" (dn,="" igan="" und="" vaskulitis).="">

Abbildung 4|(Fortsetzung) (e) Repräsentative konfokale mikroskopische Bilder, die die Expression von Rarres1 in Glomeruli von Patienten mit DN zeigen. CD31 wurde als Marker für ECs verwendet. Stangen=50/10 mm. (f) Repräsentative konfokale FL-Fluoreszenzbilder des RNAscope, die die Rarres1-Genexpression in PECAM1--koexprimierenden Zellen in der tubulären Fraktion von Patienten mit DN zeigen. Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für Vergleiche zwischen 2 Gruppen verwendet. Stangen=50/10 mm. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

Creþ/Rarres1flfl/flfl-Mäuse wurden mit einem erwarteten Mendelschen Vererbungsverhältnis geboren und sie waren lebensfähig und fruchtbar (Daten nicht gezeigt). Die Nieren waren nicht von Kontroll-Wurfgeschwistern (Cre-/Rarres1flfl/flfl) zu unterscheiden, wie durch routinemäßige licht- und elektronenmikroskopische Untersuchung analysiert wurde (ergänzende Abbildung S2B und C). Auch die Verteilung der Podozytenproteine ​​Nephrin und Synaptopodin blieb bei Creþ/Rarres1flfl/flfl-Mäusen unbeeinflusst (ergänzende Abbildung S2D).

Um die Rolle von Rarres1 bei Nierenschäden in vivo aufzuklären, wurden Creþ/Rarres1flfl/flfl mit NTS behandelt, das zu IgG-Ablagerungen im GBM, Albuminurie und progressivem GN führt.23 Die Albuminuriespiegel waren sowohl bei Creþ/Rarres1flfl/flfl als auch bei der Kontrolle ähnlich Mäuse (Abbildung 3d). Die lichtmikroskopische Untersuchung ergab keine signifikanten Unterschiede im Anteil der betroffenen Glomeruli (Abbildung 3e). Die Elektronenmikroskopie zeigte keinen Unterschied in der Dicke des GBM oder der Auslöschung des Fußfortsatzes, und GECs schienen in beiden Gruppen ähnlich betroffen zu sein (Abbildung 3f). Die Podozytenmarker Nephrin, Wt1 und Synaptopodin waren in beiden Gruppen in ähnlicher Weise betroffen (ergänzende Abbildung S3A). Auch die Färbung für ECs mit CD31 zeigte keine Unterschiede in den Glomeruli oder peritubulären Kapillaren zwischen den Gruppen (ergänzende Abbildung S3B und C). Darüber hinaus war die Expression von Fifibrose- und entzündungsbezogenen Genen in beiden mit NTS behandelten Gruppen ähnlich erhöht (ergänzende Abbildung S4).

Rarres1-Expression wird in glomerulären und peritubulären Kapillar-ECs bei chronischer Nierenerkrankung (CKD) induziert

Um die Rolle von Rarres1 bei CKD zu untersuchen, analysierten wir seine Expression in öffentlich zugänglichen RNA-Datensätzen. Wir beobachteten signifikant erhöhte Rarres1-Spiegel in Glomeruli, die von Patienten mit DN, ANCA-assoziierter Vaskulitis und IgAN isoliert wurden (Abbildung 4a),4,6,24–26, während andere Podozyten-assoziierte Gene, z. B. Nephrin, signifikant herunterreguliert oder unverändert waren . Unsere quantitative Polymerase-Kettenreaktionsanalyse von Glomeruli, die aus Patienten mit DN (n=5) isoliert wurden, bestätigte die Induktion der Rarres1-Expression (Abbildung 4b). Aufgrund des Verlustes von Podozyten nimmt die Expression von Podozyten-Genen normalerweise fortschreitend abglomeruläre Erkrankungen,6 und das Verhältnis von glomerulärer Rarres1- zu Nephrin-Expression war bei DN im Vergleich zu gesunden Glomeruli etwa 20--fach erhöht (Abbildung 4b). Die Expression von Rarres1 war auch in tubulointerstitiellen Gewebedatensätzen bei DN, ANCA-assoziierter Vaskulitis und IgAN hochreguliert (Abbildung 4c).8–11

Als nächstes analysierten wir die Rarres1-Expression immunhistochemisch in Nierenbiopsien von Patienten mit DN (n ¼ 5), IgAN (n ¼ 5) und ANCA-assoziierter Vaskulitis (n ¼ 4). In erkrankten Glomeruli schien die Rarres1-Färbung auf GECs lokalisiert zu sein, wie durch die Immunreaktivität auf der Innenseite der Kapillarwände gezeigt wurde (Abbildung 4d, Einschübe), während das Signal von Podozyten schwächer erschien. Im tubulointerstitiellen Raum wurde die Färbung in peritubulären Kapillaren nachgewiesen (Abbildung 4d, Einschübe), was auf EC-Expression hindeutet. Die doppelte Immunkennzeichnung mit CD31 validierte die Lokalisierung an ECs sowohl in den Glomeruli als auch in den peritubulären Kapillaren (Abbildung 4e). In ähnlicher Weise zeigten Doppel-RNAscope-Experimente die Kolokalisierung von Rarres1-mRNA mit PECAM1-mRNA in DN (Abbildung 4f). Zusammengenommen war die Induktion der Rarres1-Expression in glomerulären und peritubulären Kapillar-ECs ein häufiges Phänomen bei CKD.

Generierung und Charakterisierung einer Mauslinie, die Rarres1 in ECs überexprimiert

Da Rarres1 bei menschlicher CKD induziert wird, haben wir eine neue transgene Mauslinie generiert, in der Rarres1-cDNA in den Rosa26-Locus unter dem CAG-Promotor eingeführt wurde,27 mit einer lox-STOP-lox-Kassette zwischen den Spleißakzeptorstellen (Abbildung 5a). Die Linie wurde mit einer Tie2-cre-Linie gekreuzt, um Rarres1_Tie2_KI-Mäuse zu erzeugen, und Mäuse wurden durch Ohr-Genotypisierung für Knockin- und Cre-Allele identifiziert (Abbildung 5a). Rarres1_Tie2_KI-Mäuse zeigten signifikant erhöhte Konzentrationen von Rarres1-Protein im Nierengewebe (Abbildung 5b), und die erfolgreiche Knock-in-Strategie wurde durch die Analyse der Rarres1-mRNA-Expression in FACS-sortiertem GFP-positiv weiter validiert GECs (Abbildung 5c).

Wir phänotypisierten die Nieren von Rarres1_Tie2_KI-Mäusen und Kontrollmäusen in altersangepassten Gruppen. Bei der lichtmikroskopischen Untersuchung war die Nierenmorphologie bei Rarres1_Tie2_KI-Mäusen nicht von Kontroll-Wurfgeschwistern zu unterscheiden (Abbildung 5d). In ähnlicher Weise zeigte die Elektronenmikroskopie eine unveränderte GBM-Dicke und Podozytenfußfortsatzbreite (Abbildung 5e). Darüber hinaus schien die Expression der Podozytenmarker Nephrin und Synaptopodin in Rarres1-überexprimierenden Glomeruli unbeeinflusst zu sein (Abbildung 5f). Bemerkenswerterweise zeigten andere Hauptorgane makroskopisch oder mikroskopisch keine offensichtlichen Anomalien (Daten nicht gezeigt).

Abbildung 5|Etablierung endothelialzellspezifischer Rarres1-Knockin-Mäuse (Rarres1_Tie2_KI). (a) Eine Generation konditionaler Knockin-Mäuse, bei denen die Rarres1-Expression mithilfe des Cre-LoxP-Rekombinationssystems spezifisch in Endothelzellen (ECs) induziert wird. Tie2-Cre-Mäuse wurden mit Mäusen gekreuzt, die den Targeting-Vektor (Rarres1_casetteþ) exprimierten, der eine lox-STOP-lox-Kassette zwischen den Spleißungen enthielt (Fortsetzung)

Abbildung 5|(Fortsetzung) Akzeptorstellen und Rarres1-cDNA unter dem CAG-Promotor, der in den Rosa26-Locus eingeführt wurde, wurden durch Ohr-Genotypisierung identifiziert. Die Genotypisierung wurde durch Ohrpräparation und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) im Alter von 4 Wochen bestätigt. (b) Repräsentativer Western Blot, der die erhöhte Expression von Rarres1 in der Nierenrinde von EC-spezifischen Rarres1-Knockin-Mäusen (Rarres1_Tie2_KI) zeigt. **P < 0.01="" versus="" kontrolle="" (ctrl.;="" cre-="" arres1_tie2_ki,="" n="5," mann-whitney="" u="" prüfung).="" (c)="" quantitative="" pcr="" für="" rarres1="" in="" isolierten="" ecs.="" **p="">< 0,01="" gegenüber="" der="" kontrolle="" (cre-/rarres1_tie2_ki,="" n="3," student's="" t-test).="" (d)="" repräsentative="" mikrofotografien="" von="" periodsäure-schiff-gefärbten="" schnitten,="" die="" typische="" glomeruläre="" strukturen="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" zeigen.="" (e)="" repräsentative="" mikrofotografien="" und="" quantifizierungen="" der="" mittleren="" dicke="" der="" glomerulären="" basalmembran="" (gbm)="" und="" der="" anzahl="" der="" schlitze="" pro="" mm="" gbm="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" durch="" transmissionselektronenmikroskopie-analysen="" (student's="" t-test).="" (f)="" repräsentative="" konfokalmikroskopische="" bilder,="" die="" die="" expression="" der="" podozyten-spezifischen="" marker="" synaptopodin="" und="" nephrin="" in="" ec-spezifischen="" rarres1-knock-in-mäusen="" (rarre1_tie2_ki)="" und="" ctrl="" zeigen.="" mäuse.="" stangen="10" mm.="" die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Die Induktion von Rarres1 in ECs moduliert den NF-kB-Signalweg und das Ergebnis der Nephropathie durch Regulierung der Axl-Aktivierung

Um zu beurteilen, ob die Rarres1-Expression in ECs den Krankheitsverlauf moduliert, induzierten wir GN in transgenen Mäusen und ihren Wurfgeschwistern mit einer einzigen Injektion von NTS. Rarres1_- Tie2_KI-Mäuse entwickelten nach 3 Tagen signifikant höhere Albuminurie-Werte als Kontrollen, wohingegen nach 7, 10 und 14 Tagen kein signifikanter Unterschied in der Albuminurie zu sehen war (Abbildung 6a). Die histologische Analyse 14 Tage nach der Induktion zeigte, dass Rarres1_Tie2_KI-Mäuse keine weiteren glomerulären Veränderungen wie sklerotische und sichelförmige Läsionen aufwiesen (Abbildung 6b). Die elektronenmikroskopische Auswertung zeigte jedoch bei Rarres1_Tie2_KI-Mäusen eine signifikant dickere GBM und eine stärkere Auslöschung des Fußfortsatzes (Abbildung 6c). Darüber hinaus zeigten Rarres1_Tie2_KI-Mäuse erhöhte Werte von Aktin der glatten Muskulatur in der Nierenrinde (Abbildung 6d). Die Analyse der Podozytenmarker Nephrin, Synaptopodin und WT1 zeigte eine deutliche Reduktion, was auf eine Dedifferenzierung und einen signifikanten Verlust an Podozyten hindeutet (Abbildung 6d). Wichtig ist, dass Rarres1_Tie2_KI-Glomeruli im Vergleich zu Kontrolltieren weniger WT1--positive Podozyten zeigten, was darauf hindeutet, dass EC-exprimiertes Rarres1 die Podozytenschädigung förderte. Außerdem wurden mehr Fibrinthromben in Rarres1_Tie2_KI-Glomeruli nachgewiesen (Abbildung 6e). In Übereinstimmung damit war die Expression verschiedener Gene, die mit Entzündungen, Fibrosen und renalen tubulären Verletzungen in Zusammenhang stehen, in Rarres1_- Tie2_KI-Mäusen signifikant hochreguliert, wie durch Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse für Il gezeigt wurde -1Beta-, Col1a1-, TGF-b1- und Nierenverletzungsmolekül-128 in Nierenrindengewebe (Abbildung 6f). Es wurden jedoch keine Unterschiede in den Blut-Harnstoff-Stickstoff- und S-Kreatinin-Werten zwischen den Gruppen festgestellt (Abbildung 6g). Auch die Färbung für ECs mit CD31 zeigte keine Unterschiede in den Glomeruli oder peritubulären Kapillaren zwischen den Gruppen (ergänzende Abbildung S5A und B). Zusammengenommen verschlimmerte die EC-spezifische Induktion der Rarres1-Expression die glomeruläre Pathologie bei NTS-induzierter Nephropathie.

Mechanistisch analysierten wir, ob die Überexpression von Rarres1 in ECs die Aktivierung der Axl- und NF-kB-Signalgebung in vivo förderte, ähnlich wie bei unseren In-vitro-Beobachtungen (Abbildung 2). Sowohl Rarres1_Tie2_KI- als auch Kontrollmäuse, die mit NTS behandelt wurden, zeigten eine Aktivierung des Axl-Signalwegs, wie durch eine erhöhte Axl-Phosphorylierung gezeigt wurde (Abbildung 6h). Diese Aktivierung war jedoch bei Rarres1_- Tie2_KI-Mäusen signifikanter (Abbildung 6h). Dementsprechend wurde die Aktivierung des NF-kB-Signalwegs in diesen Mäusen gefördert, wie durch die Anzahl der pP65--positiven Kerne in den Glomeruli gezeigt wird (Abbildung 6i). Als die pP65-Spiegel durch Western Blotting gemessen wurden, stellten wir einen ähnlichen Trend für die Aktivierung des NF-kB-Signalwegs fest, obwohl dies nicht signifikant war, möglicherweise aufgrund eines Ausreißers (ergänzende Abbildung S5C).

Die Inaktivierung von Rarres1 in ECs verringert den glomerulären Schaden im Anti-GBM-Glomerulonephritis-Modell

Um die pathogene Rolle von EC-abgeleitetem Rarres1 bei CNI zu validieren, haben wir eine Mauslinie generiert, in der Rarres1 in ECs unter Verwendung von Tie2-Cre deletiert war (Abbildung 7a). Genotypen für Floxed- und Cre-Allele wurden durch Ohr-Genotypisierung identifiziert (Abbildung 7b). Es gab einen Trend zur Hochregulierung von Rarres1 in NTS-behandelten Mäusen, die in Rarres1_Tie2_KO-Mäusen aufgehoben wurde (Abbildung 7c). Die Mäuse zeigten keine offensichtlichen Nierenanomalien (Daten nicht gezeigt). Die Injektion von NTS induzierte eine ähnliche Albuminurie bei Rarres1_Tie2_KO und Kontrollen (Abbildung 7d). Die histologische Analyse 14 Tage nach der Induktion zeigte jedoch weniger glomeruläre Veränderungen bei Rarres1_- Tie2_KO-Mäusen (Abbildung 7e). In der Elektronenmikroskopie zeigten Rarres1_Tie2_KO-Mäuse eine geringere Auslöschung des Fußfortsatzes und eine Verdickung des GBM (Abbildung 7f). Die Immunfärbung zeigte keine signifikanten Unterschiede für aSMA, Nephrin oder Synaptopodin (Abbildung 7g). Die Anzahl der WT1--positiven Podozyten war jedoch bei Rarres1_Tie2_KO-Mäusen signifikant höher (Abbildung 7g). Die Färbung für pP65 zeigte eine verringerte Anzahl positiver Kerne in Rarres1_Tie2_KO-Glomeruli, was auf eine Beteiligung des NF-kB-Signalwegs hindeutet (Abbildung 7h).

Abbildung 6|(Fortsetzung) Quantifizierung der mittleren Dicke der glomerulären Basalmembran (GBM) und der Anzahl der Schlitze pro mm GBM in verschiedenen Gruppen von Mäusen durch Transmissionselektronenmikroskopie analysiert Schnitte (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n { {3}}; NTS-Rarres1_Unentschieden2_KI, n=12). (d) Repräsentative konfokale mikroskopische Bilder, die die Expression von Nephrin, Synaptopodin, Aktin der ⍺-glatten Muskulatur (⍺Sma) und WT1 in der Niere von verschiedenen Gruppen von Mäusen zeigen. Stangen {{10}}/10 mm. Der ⍺Sma-positive Bereich wurde pro kortikalem Querschnitt gezählt, und WT1 wurde pro Glomerulus gezählt (Ctrl., n=2; NTS-ctrl., n=3; NTS-Rarres{{18} }Unentschieden2_KI, n {{20}}). (e) Vorhandensein von Fibrinthromben in Glomeruli, nachgewiesen durch Trichomfärbung (gezählt pro glomerulärem Querschnitt) (Ctrl., n=3; NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres{{ 26}}Unentschieden2_KI, n=5). (f) Relative mRNA-Spiegel verschiedener Gene im Zusammenhang mit Entzündungen, Fibrosen und renalen tubulären Verletzungen in der Nierenrinde von NTS-behandelten Mäusen (Ctrl., n=4; NTS-ctrl., n=6 –10; NTS-Rarres1_Unentschieden2_KI, n=6–10). (g) Serum-Kreatinin- und Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN)-Spiegel in NTS-ctrl. (n=3) und NTS-Rarres1_Tie2_KI (n=3)-Mäuse. (h) Repräsentative Western-Blot-Dokumente und zusammengefasste Daten, die die relativen Proteinspiegel von Paxil in der Nierenrinde in verschiedenen Gruppen von NTS-behandelten Mäusen zeigen (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres 1_ Unentschieden2_KI, n=5). (i) Repräsentative Mikrofotografien der immunhistochemischen pP65-Färbung in Nierenrindengewebe von verschiedenen Gruppen von NTS-behandelten Mäusen. pP65-positive Kerne pro Glomeruli wurden in den verschiedenen Gruppen von Mäusen quantifiziert (Ctrl., n=7; NTS-ctrl., n=8; NTS-Rarres1_Tie 2_KI, n=14). EC-spezifische Rarres1-Knock-in-Mäuse (Rarres1_Tie2_KI-Mäuse); Als Kontrolle wurden Mäuse mit Rarres1-Kassette und ohne Cre-Expression (Ctrl.) verwendet. #P < 0,05,="" ##p="">< 0,01,="" ###p="">< 0,001="" gegenüber="" unbehandelter="" kontrolle="" (ctrl.),="" *p="">< 0,05="" gegenüber="" nts-behandelter="" kontrolle="" (nts-ctrl.).="" die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" der="" student's="" t-test="" wurde="" für="" vergleiche="" zwischen="" 2="" gruppen="" verwendet.="" eine="" einweg-varianzanalyse="" gefolgt="" von="" tukey's="" post-test="" für="" multiple="" vergleiche="" wurde="" für="" gruppen="" von="" 3="" oder="" mehr="" verwendet.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

DISKUSSION

Rarres1 wurde erstmals in mit Tazaroten29 behandelten Hautfloßkulturen identifiziert und wirkte nachweislich als Invasionsrepressor in Prostatakrebszelllinien.30 Bei entzündlichem Brustkrebs reguliert Rarres1 in vitro die Invasion von Krebszellen durch Vermittlung des Axl-Signalwegs . Im Detail stabilisiert Rarres1 Axl durch Hemmung des Proteasom-abhängigen Abbaus von Axl. Darüber hinaus reguliert die Depletion von Rarres1 in SUM149-Zellen die Axl-Expression herunter und inaktiviert NF-kB, was zu einer verringerten Invasion von entzündlichen Brustkrebszellen führt.20 Darüber hinaus wird die Rarres1-Expression bei Patienten mit fortgeschrittener Fibrose induziert, und Rarres1 hat eine profibrotische Rolle vorgeschlagen in einem Rattenlungen-Fibrose-Modell und während der fibrogenen Aktivierung von hepatischen Sternzellen.31 Zusammenfassend deuten frühere In-vitro-Studien auf eine Rolle von Rarres1 bei Fifibrose, Entzündung und Krebsinvasion hin.

Zunächst weckte Rarres1 unser Interesse, da es in Podozytenzellen stark angereichert war. Wir konnten zeigen, dass Rarres1 die entzündliche und profibrotische Signalübertragung in Podozyten über die Aktivierung des Axl-vermittelten NF-kB-Signalwegs förderte. Andererseits zeigten Podozyten-spezifische Knockout-Tiere keinen offensichtlichen Unterschied im Vergleich zu Kontrollen unter gesunden Bedingungen sowie in einem Mausmodell von GN. Dies könnte auf kompensatorische Mechanismen zurückzuführen sein, da der NF-kB-Signalweg durch eine Reihe von Molekülen und biologischen Prozessen reguliert wird.

Molekulare Profile von Patienten mit Diabetes zeigten, dass Rarres1 in glomerulären und peritubulären Kapillar-ECs in DN induziert wurde. Wichtig ist, dass die Rarres1-Expression in ECs bei Diabetikern ohne Nephropathie nicht nachgewiesen wurde. Daher spekulieren wir, dass Rarres1 ein neuer Marker für diabetische mikrovaskuläre Erkrankungen sein könnte, und Studien an Plasma- und Urinproben sind angezeigt, um die Machbarkeit von Rarres1 als nicht-invasiver Biomarker zu untersuchen. Wir identifizierten die Induktion von Rarres1 auch bei Patienten mit IgAN und Vaskulitis. Es ist verlockend zu spekulieren, dass Rarres1 eine pathogene Rolle bei diesen Glomerulopathien spielt und zum Fortschreiten der Krankheit beiträgt. Funktionell zeigten wir, dass die Induktion von Rarres1 in den ECs die Nierenschädigung in einem Mausmodell von GN verstärkte, während die Inaktivierung von Rarres1 in ECs die Schädigung verbesserte. Die phänotypische Analyse zeigte, dass Podozyten bei Mäusen betroffen waren, die Rarres1 in ECs überexprimierten. Dies kann eine direkte Wirkung von Rarres1 auf Podozyten sein, da eine lösliche Form von Rares beschrieben wurde.32 Alternativ kann eine Podozytenschädigung sekundär zur Schädigung der Filtrationsbarriere des Glomerulus sein.

Zuvor wurde gezeigt, dass die endotheliale NF-kB-Aktivierung eine pathogene Rolle bei der Entwicklung von Nierenerkrankungen bei Vaskulitis spielt.13 Bemerkenswert ist, dass die Hemmung des endothelialen NF-kB-Signalwegs in einem Modell der sichelförmigen GN das Fortschreiten aufhob. Axl-Inhibitoren haben sich bei experimenteller Anti-GBM-Nephritis als vorteilhaft erwiesen. Mäuse, die mit dem selektivsten niedermolekularen Inhibitor, R428, behandelt wurden, zeigten eine signifikante Aufrechterhaltung der Nierenfunktion und eine verringerte Produktion entzündlicher Zytokine.33 Dies weist darauf hin, dass der Weg eine therapeutische Option für sein könnteglomeruläre ErkrankungProzesse. Da jedoch sowohl Axl als auch NF-kB eine Reihe unterschiedlicher zellulärer Prozesse im ganzen Körper modulieren, ist es unwahrscheinlich, dass es ein guter Kandidat für ein pharmazeutisches Targeting bei CKD ist. Rarres1 kann ein eher nierenassoziiertes Ziel bieten.

Es wurde gezeigt, dass Tie2-Cre die Expression in einer Subpopulation hämatopoetischer Zellen antreibt.34 Einige dieser Zellen können die Entzündungsreaktion im NTS-induzierten Modell modulieren, und daher können wir nicht ausschließen, dass von hämatopoetischen Zellen stammendes Rarres1 dazu beiträgt Krankheitsverlauf in Tie2-Cre-Linien. Da wir jedoch keine offensichtliche Rarres1-Expression in infiltrierenden Immunzellen feststellen konnten, halten wir dies für weniger wahrscheinlich.

Während dieses Manuskript vorbereitet wurde, berichteten Chen et al.32 über eine lösliche Form von Rarres1, die fördertglomeruläre ErkrankungFortschreiten. Sie identifizierten, ähnlich wie wir, die Hochregulation von Rarres1 bei häufigen menschlichen glomerulären Erkrankungen. Die Studie unterstützt unsere Erkenntnis, dass eine erhöhte Rarres1-Expression mit einer Abnahme der Nierenfunktion korreliertmenschliche glomeruläre Erkrankung. Im Gegensatz zu unseren Ergebnissen kamen sie jedoch zu dem Schluss, dass die Hochregulierung von Rarres1 auf eine Überexpression in Podozyten zurückzuführen war. Wir können diese Möglichkeit nicht ausschließen, aber wir haben bei menschlichen Erkrankungen eine deutliche Induktion der Rarres1-Expression in ECs festgestellt. Ein Mechanismus, der unsere Ergebnisse erklärt, könnte sein, dass die von Podozyten produzierte lösliche Form von Rarres1 von GECs aufgenommen wird. Die Ergebnisse, dass wir Rarres1-mRNA in ECs durch In-situ-Hybridisierung nachgewiesen haben und dass Rarres1 auch in peritubulären Kapillar-ECs induziert wurde, stützen stark die Vorstellung, dass die Expression von Rarres1 bei Nierenerkrankungen hauptsächlich endothelialen Ursprungs ist.

Abbildung 7|Endothelspezifische Ablation von Rarres1 dämpft die Nierenschädigung bei mit nephrotoxischem Serum (NTS) behandelten Mäusen. (a) Erzeugung von bedingten Knockout-Mäusen, in denen Rarres1 unter Verwendung des Cre-LoxP-Rekombinationssystems spezifisch in Endothelzellen ablatiert wird. Exon 3 wird bei Tie2-Cre-vermittelter Rekombination gelöscht. (b) Die Genotypisierung wurde durch Schwanzpräparation und Polymerase-Kettenreaktion bestätigt bei (Fortsetzung)

Abbildung 7|(Fortsetzung) 4 Wochen alt. (c) Repräsentative Western-Blot-Dokumente und zusammengefasste Daten, die die relativen Proteinspiegel von Rarres1 in der Nierenrinde in verschiedenen Gruppen von NTS-behandelten Mäusen zeigen (NTS-ctrl., n=4; NTS-Rarres1_ Tie2_KO, n=4) und unbehandelte Mäuse (Kontrolle [Ctrl.], n {{10}}). **P < 0.01.="" (d)="" uacr="" (urin-albumin-zu-kreatinin-verhältnis)="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" unter="" nts-behandlung="" (ctrl.,="" n="7–11;" rarres1_tie2_ko,="" n="" {="" {19}}–8).="" (e)="" mikrofotografien="" und="" quantifizierungen,="" die="" typische="" veränderungen="" der="" glomerulären="" struktur="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" zeigen.="" glomeruläre="" läsionen="" wurden="" in="" periodsäure-schiff-gefärbten="" schnitten="" identifiziert="" (ctrl.,="" n="3;" nts-behandelte="" kontrolle="" [nts-ctrl.],="" n="12;" nts="" rarres1_tie{="" {27}}ko,="" n="8)." (f)="" repräsentative="" mikrofotografien="" und="" quantifizierungen="" der="" mittleren="" dicke="" der="" glomerulären="" basalmembran="" (gbm)="" und="" der="" anzahl="" der="" schlitze="" pro="" mm="" gbm="" in="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" durch="" transmissionselektronenmikroskopie-analyseschnitte="" (ctrl.,="" n="6;" nts-ctrl.="" ,="" n="13;" nts-rarres1_unentschieden2_ko,="" n="16)." (g)="" repräsentative="" konfokale="" mikroskopische="" bilder,="" die="" die="" expression="" von="" nephrin,="" synaptopodin,="" aktin="" der="" glatten="" muskulatur="" (sma)="" und="" wt1="" in="" der="" niere="" von="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" zeigen.="" stangen="50/10" mm.="" der="" sma-positive="" bereich="" wurde="" pro="" kortikalem="" querschnitt="" gezählt="" (nts-ctrl.,="" n="8;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="4)." (h)="" repräsentative="" mikrofotografien="" der="" immunhistochemischen="" pp65-färbung="" in="" nierenrindengewebe="" von="" verschiedenen="" gruppen="" von="" nts-behandelten="" mäusen.="" pp65--positive="" kerne="" pro="" glomeruli="" wurden="" in="" den="" verschiedenen="" gruppen="" von="" mäusen="" quantifiziert="" (nts-ctrl.,="" n="7;" nts-rarres1_tie2_ko,="" n="" {{="" 56}}).="" ####p="">< 0,001="" vs.="" unbehandelte="" ctrl.,="" *p="">< 0,05="" vs.="" nts-ctrl.="" die="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" der="" student's="" t-test="" wurde="" für="" vergleiche="" zwischen="" 2="" gruppen="" verwendet.="" eine="" einweg-varianzanalyse="" gefolgt="" von="" tukey's="" post-test="" für="" multiple="" vergleiche="" wurde="" für="" gruppen="" von="" 3="" oder="" mehr="" verwendet.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Es gibt einige Einschränkungen in dieser Studie, die anerkannt werden sollten. Zunächst wurden In-vitro-Studien in Podozyten durchgeführt, während wir in vivo die Expression in ECs manipulierten. Daher können wir Rarres1 nicht direkt mit der Axl-Aktivierung in ECs verknüpfen. Zweitens konnten wir zwar eine Rarres1--induzierte (Axl-abhängige) Aktivierung der NF-kB-Signalgebung in Podozyten identifizieren, aber wir untersuchten nicht den molekularen Mechanismus hinter diesem Prozess. Weitere Studien sind erforderlich, um die frühere Erkenntnis zu untersuchen, dass Rarres1 die Axl-Aktivierung fördert, indem es seinen Proteasom-abhängigen Abbau hemmt. Schließlich forderten wir unsere Knockout/-in-Tiere nur mit dem NTS-induzierten Nephropathiemodell heraus. Daher sind weitere Studien in den Tiermodellen angezeigt, um zu sehen, ob Rarres1 auch bei anderen Krankheitsprozessen eine pathogene Rolle spielt.

Zusammenfassend zeigt unsere Studie, dass bei häufigen menschlichen Glomerulopathien das mit Podozyten angereicherte Protein Rarres1 in ECs induziert wird, was zu Entzündungen, Podozytenverletzungen und Fibrose führt. Dies wird möglicherweise durch die Verstärkung des NF-kB-Signalwegs über die Aktivierung der Rezeptortyrosinkinase Axl vermittelt (Abbildung 7). Rarres1 ist ein neuer Biomarker für mikrovaskuläre Verletzungen und könnte möglicherweise ein neuartiges therapeutisches Ziel zur Unterdrückung von Entzündungen und Fibrose bei CKD sein

OFFENLEGUNG

ML ist Mitarbeiter von AstraZeneca, Göteborg, Schweden. Die Forschung von JP wird von AstraZeneca unterstützt. Alle anderen Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

DANKSAGUNGEN

Diese Studie wurde von KM-H vom Diabetes Wellness Sverige und von JP vom KI/AZ Integrated Metabolic Center, der Marianne och Marcus Wallenberg Foundation, der Swedish Diabetes Foundation, der Swedish Kidney Foundation und dem Center for Innovative Medicine unterstützt.

AUTORENBEITRÄGE

KM-H, ML und JP gestalteten die Forschung; KM-H, DD, EC, SZ und GG führten die Forschung durch; KM-H und XL analysierten die Daten; AW stellte menschliche Proben zur Verfügung; und KM-H und JP haben das Papier geschrieben.

Warum kann der Retinsäurerezeptor-Responder1 die Entwicklung glomerulärer Erkrankungen fördern?

ERGÄNZUNGSMATERIAL

Ergänzende Datei (PDF)

Tabelle S1. Primerpaare von Zielgenen wurden in dieser Studie für Echtzeit-RT-PCR verwendet.

Tabelle S2. In dieser Studie wurden Antikörper verwendet. Ergänzende Datei (PowerPoint)

Abbildung S1. Rarres1-Überexpression aktiviert nicht den nicht-kanonischen NF-kB-Signalweg. Repräsentatives Western-Blot-Dokument und zusammengefasste Daten, die zeigen, dass eine Überexpression von Rarres1 p100/p52 in Podozyten, die mit 10 ng/ml TGF-b1 (n=2) behandelt wurden, nicht aktiviert. Die Daten sind als Mittelwerte ± SD ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für Vergleiche zwischen zwei Gruppen verwendet. UT, unbehandelt.

Abbildung S2. Etablierung von Podozyten-spezifischen Rarres1-Knockout-Mäusen (Creþ/Rarres1flfl/flfl). (A) Konventionelle PCR-Analyse in tubulären und glomerulären Fraktionen sowie in Lebergewebe. (B) Histologische Untersuchung (PAS-Färbung) der Nierenpathologie bei Cre– /Rarres1flfl/flfl- und Creþ/Rarres1flfl/flfl-Mäusen. (C) Repräsentative Transmissionselektronenmikroskopaufnahmen (TEM) und Quantifizierung der mittleren Dicke der glomerulären Basalmembran (GBM) und der Anzahl der Schlitze pro mm GBM in verschiedenen Gruppen von Mäusen (n=3). (D) Repräsentative konfokalmikroskopische Bilder, die die Expression von Podozyten-spezifischen Markern, Synaptopodin und Nephrin, in Podozyten-spezifischen Rarres1-Knockout- (Creþ/Rarres1flfl/flfl ) und Kontrollmäusen (Cre– /Rarres1flfl/flfl ) zeigen. Balken=10 mm.

Abbildung S3. Die Expressionsniveaus von Podozytenmarkern und CD31 in den Nieren von NTS-behandelten Mäusen. (A) Repräsentative konfokalmikroskopische Bilder, die die Expression von Nephrin, WT-1 und Synaptopodin in Podozyten von NTS-behandelten Rarres1 Podozyten-spezifischen Knockout-Mäusen (Creþ/Rarres1flfl/flfl) und Kontroll-Wurfgeschwistern (Cre– /Rarres1flfl/) zeigen flfl ). Balken=10 mm (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=5). (B) Anteil CD31--positiver Kapillaren in peritubulären Bereichen. Pro Maus wurden 30 peritubulare Bereiche ausgewertet. (NTS Cre– /Rarres1flfl/flfl , n= 4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Student's t-Test. (C) Semiquantitative Bewertung des CD31-Signals in Glomeruli: 0=kein Signal, 1=schwaches Signal, 2=mäßiges Signal, 3=starkes Signal. Zehn Glomeruli wurden von jeder Maus ausgewertet (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl , n=4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl , n=4). Student's t-Test.

Abbildung S4. Die Expressionsniveaus für Marker von Fifibrose, Entzündung und tubulärer Verletzung in den Nieren von NTS-behandelten Mäusen. (A) Repräsentative konfokalmikroskopische Bilder, die die Expression von -Sma in der Niere von NTS-behandelten Rarres1-Podozyten-spezifischen Knockout-Mäusen (Creþ/Rarres1flfl/flfl) und Kontroll-Wurfgeschwistern (Cre– /Rarres1flfl/flfl) zeigen. Balken=100 mm. (B) Relative mRNA-Spiegel verschiedener Entzündungs-, Fibrose- und Nierentubulusverletzungs-bezogener Gene in der Nierenrinde von mit NTS behandelten Mäusen. #P < 0.05,="" ##p="">< 0,01="" versus="" kontrolle="" (strg.);="" daten="" sind="" als="" mittelwerte="" ±="" sem="" ausgedrückt.="" student's="" t-test="" wurde="" für="" vergleiche="" zwischen="" 2="" gruppen="" verwendet="" (schein="" n="2;" nts–="" cre–="" arres1flfl/flfl,="" n="3;" nts-creþ/rarres1flfl/flfl="" ,="" n="3">

Abbildung S5. Die Expression von C31 und aktiviertem P65 in NTS-behandelten Nieren. (A) Der Anteil an CD31--positiven Kapillaren in peritubulären Bereichen. Pro Maus wurden 30 peritubuläre Bereiche ausgewertet (NTS Cre–/ Rarres1flfl/flfl, n=4; NTS Creþ/Rarres1flfl/flfl, n=4). Student's t-Test. (B) Semiquantitative Bewertung des CD31-Signals in Glomeruli: 0=kein Signal, 1=schwaches Signal, 2=mäßiges Signal, 3=starkes Signal. Von jeder Maus wurden zehn Glomeruli ausgewertet (NTS Cre –/Rarres1flfl/flfl, n =4; NTS-Creþ/Rarres1flfl/flfl, n= 4). Student's t-Test. (C) Repräsentative Western-Blot-Dokumente und zusammengefasste Daten, die die relativen Proteinspiegel von pP65 in der Nierenrinde in verschiedenen Gruppen von NTS-behandelten Mäusen und unbehandelten Kontrollen (ctrl.) zeigen (ctrl., n=3; NTS-ctrl. , n=9; NTS-Rarres1_Unentschieden2_KI, n=10). Die Daten sind als Mittelwerte ± SEM ausgedrückt. Der Student's t-Test wurde für Vergleiche zwischen 2 Gruppen verwendet.

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