Oxidativer Stress, gestörter Energiestoffwechsel und destabilisierende Neurotransmitter veränderten das zerebrale Stoffwechselprofil in einem Rattenmodell mit simuliertem Heliox-Sättigungsabfall auf 4,0 MPa

Abstrakt

Das Hauptziel der vorliegenden Studie bestand darin, Veränderungen des Stoffwechselprofils im Gehirn von Ratten nach simuliertem Heliox-gesättigtem Tauchen (HSD) in 400 Meter Meerwasser im Vergleich zu den Blindkontrollen zu bestimmen. Veränderungen im polaren Metabolom im Gehirn von Ratten aufgrund von HSD wurden im untersuchtKortex, Hippocampus, UndStriatumgewebeProben durch Anwendung eines NMR-basierten metabolomischen Ansatzes in Verbindung mit biochemischer Detektion im Kortex. DerReduzierung des Glutathion- und Taurinspiegelsmöglicherweise hypothetischstärken die antioxidative Abwehrbeim Sättigungstauchen, was auch durch die nachgewiesen wurdeerhöhter Malondialdehydspiegel, Dieverminderte Superoxiddismutase, und dasverminderte Glutathionperoxidaseim Kortex. Die damit einhergehende Abnahme der aeroben und anaeroben Stoffwechselwege führte zu einem herunterregulierten Energiestoffwechsel, was auch durch die biochemische Quantifizierung der Stoffwechselenzyme Na-K-ATPase und LDH im Gewebe der Großhirnrinde nachgewiesen wurde. Dererhebliche Stoffwechselanomalien von Aminosäure-Neurotransmittern, wie GABA, Glycin und Aspartat, verminderte aromatische Aminosäuren, einschließlichTyrosinund Phenylalanin, die beide daran beteiligt sindStoffwechsel von Dopaminund Noradrenalin, die im Kortex herunterreguliert werden. Insbesondere ist ein Rückgang von N-Acetylaspartat mit neuronalen Schäden verbunden. Zusammenfassend wirkte sich die hyperbare Dekompression eines 400-msw-HSD auf das ausMetabolom des Gehirnsin einem Rattenmodell, möglicherweise einschließlich einer breiten Palette störender Aminosäurehomöostase, Metaboliten im Zusammenhang mit oxidativem Stress und Energiestoffwechsel sowie destabilisierenden Neurotransmitterkomponenten. DieseStörungenkann dazu beitragenneurochemischUndneurologische Phänotypen von HSD.

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Einführung

Bei Menschen und Säugetieren, bei denen das Risiko von Veränderungen des Zentralnervensystems (ZNS) besteht, wird ein hoher Druck über 1,3 MPa (bei etwa 120-Metern Meerwasser) induziert [1, 2]. Das ZNS ist möglicherweise eines der empfindlichsten Ziele bei übermäßigem Luftdruck, Gasblasen im Körper und der Dekompressionskrankheit (DCS), die durch Tiefseetauchen verursacht wird. Unter solchen Bedingungen ist eine Reihe psychomotorischer und kognitiver Manifestationen sehr komplex, mit distalem und proximalem Zittern, elektroenzephalographischen Anomalien, Faszikulationen, Myoklonus, Schlafstörungen, Übelkeit, Kopfschmerzen, Schwindel und verminderter Leistung bei kognitiven Tests [2–4]. Moen et al. maß regionale neurologische Anomalien mittels diffusions- und perfusionsgewichteter Magnetresonanztomographie (MRT). Bei Nordseetauchern wurden Perfusionsdefizite in der zerebralen Mikrogefäßfunktion mit arteriellen Mikroembolien festgestellt [5], die durch eine verkürzte mittlere Übergangszeit aufgrund einer verringerten Komplexität des Mikrogefäß- oder Kapillarsystems nachgewiesen wurden. Alvhild Alette Bjørkum et al. fanden in einem Rattenmodell eine störende Proteinhomöostase, z. B. in synaptischen Vesikeln, und destabilisierende Zytoskelettkomponenten nach Heliox-Sättigungstauchen. Arvid Hope et al. berichteten, dass bei Ratten mit massiven neurologischen Symptomen einer Dekompressionskrankheit nach Heliox-Sättigungsdekompression keine sichtbaren ZNS-Schäden oder morphologischen Veränderungen im MRT-Scan beobachtet wurden [6]. Daher gehen wir davon aus, dass nach einem Heliox-Sättigungstauchgang potenzielle Veränderungen des molekularen Profils hinter solch signifikanten, aber mehrdeutigen physiologischen Anomalien im ZNS-Gewebe beobachtet werden könnten.

Die Identifizierung von Biomarkern zur Überwachung des Status zellulärer physiologischer Mechanismen ist wichtig für das Verständnis biochemischer Ereignisse. Angesichts der Komplexität und Vielfalt der molekularen Wege, die an der Reaktion biologischer Systeme auf verschiedene Faktoren in einem bestimmten Moment oder Zustand beteiligt sind, ist dies immer eine Herausforderung. Frühere Versuche, einzelne Biomarker mit funktionellen ZNS-Störungen zu verknüpfen, haben einige Einblicke in oxidative Schäden und den Nachsättigungstauchgang des Energiestoffwechsels geliefert [3, 4, 7]. In ähnlicher Weise haben mehrere Studien die Aminosäure-Neurotransmitter-Profile von Ratten mit neurologischem Hochdrucksyndrom mit denen gesunder Personen verglichen [2]. Die Veranschaulichung des neurologischen metabolischen Fingerabdrucks der ZNS-Freizeit könnte ätiologische Hypothesen [8, 9], Prävention [10] und therapeutische Ansätze [11] begünstigen. Allerdings wurde die integrierte neurologische Stoffwechselstörung, die durch eine große Tiefe des Heliox-Sättigungstauchens hervorgerufen wird, nicht untersucht. Derartige Informationsausgaben komplexer biologischer Systeme können aufgrund der Fortschritte bei den technischen Mitteln schnell erfasst werden [12]. Die Anwendung der hochauflösenden Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) kann extreme Mengen hochkomplexer, aber interpretierbarer und robuster Stoffwechselprofildaten liefern. Die Spektraldaten von Bioflüssigkeiten und Gewebemetabolitenextrakten können mithilfe chemometrischer und bioinformatischer Methoden gewonnen werden, um physiologische oder pathologische Statusinformationen aufzudecken. Die NMR-Spektroskopie liefert unmittelbar qualitative und quantitative Informationen über etwa 102 verschiedene kleine Moleküle, die in einer biologischen Probe vorhanden sind. Die NMR-Detektion ermöglicht einen breiten, unvoreingenommenen Ansatz ohne vorherige Auswahl spezifischer biochemischer Wege. Darüber hinaus ermöglicht die NMR eine Hochdurchsatzanalyse und eine hohe Reproduzierbarkeit und ist aufgrund der linearen Reaktion der NMR-Signale innerhalb einer Konzentration eine intrinsisch quantitative Technik über einen weiten Dynamikbereich. Diese Technologie wurde sowohl in präklinischen als auch in klinischen Studien erfolgreich auf neurologische Erkrankungen wie Kleinhirnataxie [13], Huntington-Krankheit [14, 15] und Alzheimer-Krankheit [16, 17] angewendet

Trotz der vielversprechenden Anwendbarkeit der NMR-basierten Metabolomik wurde nicht über deren Anwendung zur Bewertung der zentralnervösen Stoffwechselstörungseffekte des Heliox-Sättigungstauchens berichtet. Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, metabolische Veränderungen in verschiedenen anatomischen Kompartimenten des Gehirns (Kortex, Hippocampus und Striatum) und Veränderungen des biochemischen Indexniveaus im Kortex in einem Rattenmodell nach simuliertem 400-Meter-Heliox-Sättigungstauchen im Meerwasser (MSW) zu untersuchen , wie der schematische Versuchsaufbau der vorliegenden Forschung in Abb. 1 zeigt. Die Darstellung des metabolischen Fingerabdrucks des Zielorgans könnte eine Reihe von Biomarkern zur Verfügung stellen, die zu Verbesserungen bei Tauchverfahren beitragen könnten.

Abb. 1. Schematischer Versuchsaufbau der vorliegenden Forschung

Experimentelle Verfahren

Wir bestätigen, dass wir die Position des Journals zu Fragen im Zusammenhang mit ethischen Veröffentlichungen gelesen haben und bestätigen, dass dieser Bericht mit diesen Richtlinien übereinstimmt.

Reagenzien und Materialien Natriumchlorid in Analysequalität, DMSO, NaN3, NaH2PO4·2H2O und Na2HPO4·12H2O wurden von Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd. (Shanghai, China) bezogen. CHCl3 und CH3OH in HPLC-Qualität wurden von Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. D2O (99,9 Prozent in D), das Natrium 3-(trimethylsilyl)propionat-2, 2, 3, 3, d4 (TSP) enthält, als interner Standard für die chemische Verschiebungsreferenz wurde von Sigma-Aldrich bereitgestellt (MO, USA). Ein Puffersystem mit 0,2 M Na2HPO4/NaH2PO4 in D2O bei pH 7,4 wurde hergestellt, um den pH-Effekt auf die chemischen Verschiebungen von Metaboliten bei unterschiedlichen Konzentrationen zu verhindern. Die Testkits zur Bestimmung von Natrium-Kalium-ATPase (Na-K-ATPase), Cholinesterase (AChE) und Laktatdehydrogenase (LDH) wurden von Abcam (USA) bezogen. Die Testkits für Dopamin (DA) wurden von RD, USA, gekauft, die Testkits für Adrenalin (E) und Noradrenalin (NE) stammten von Abnova, Taiwan, die Testkits für 5-Hydroxytryptamin (5HT) stammten von BioSource und Gamma-Aminobuttersäure (GABA)-Testkits stammten aus Santa Cruz, USA. Die Testkits für Superoxiddismutase (SOD), Malondialdehyd (MDA) und Glutathionperoxidase (GPx) wurden von Cayman, USA, bezogen.

Ethikgenehmigung

Alle Versuchsprotokolle wurden von der Tierethikkommission des Naval Medical Center der PLA der Naval Medical University genehmigt (Genehmigungsnummer: SYXK(Shanghai)2017-0019, Genehmigungsjahr: 2020). Alle Tiere erhielten eine gute Pflege gemäß dem Guide of the Care and Use of Laboratory Animals der Naval Medical University. Wir bestätigen, dass alle Methoden gemäß den ARRIVE-Richtlinien (https://arriveguidelines.org) für die Berichterstattung über Tierversuche gemeldet werden. Die in dieser Studie untersuchten Teilnehmer waren Ratten, keine Menschen; Somit lag keine Zustimmung zur Teilnahme vor.

Tiere und Gruppierungsdesign

In diese Untersuchung wurden erwachsene männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Durchschnittsalter von 8 Wochen und einem Gewicht von 2{14}}0–220 g einbezogen. Die Tiere wurden von Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, China) gekauft. Es wurden größtmögliche Anstrengungen unternommen, um das Leiden der Tiere zu minimieren und die Anzahl der Tiere zu minimieren, die für die Erfassung zuverlässiger Daten erforderlich sind. Standard-Rattenfutter und Trinkwasser standen allen Tieren nach Belieben zur Verfügung. Tiere mit 3 Ratten pro Käfig wurden in einem spezifischen pathogenfreien (SPF) Tierraum (Temperatur 22–24 °C, Luftfeuchtigkeit 45–55 Prozent) und kontrollierten Lichtbedingungen (12/12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus) gehalten. eine Woche vor dem Experiment. Vor Beginn der Tauchexperimente wurden die Ratten fünf Tage lang in der Laborumgebung, einschließlich einer Überdruckkammer, akklimatisiert. Sechzehn Ratten wurden gewogen, beschriftet und nach dem Zufallsprinzip einer Kontrollgruppe (Aussetzung normobarer Luft, aber ähnlichem Licht und Lärm ausgesetzt, genannt CON-Gruppe, n=8) und einer Versuchsgruppe (unterworfen einem simulierten Heliox-Sättigungstauchgang) zugeteilt 4,0 MPa (400 msw), HSD-Gruppe genannt, n=8).

Stimuliertes Sättigungstauchen von 400 msw

Ratten in der HSD-Gruppe wurden in einer Überdruckkammer mit Helium-Sauerstoff-Gas unter Druck gesetzt. Kurz gesagt, es waren vier Phasen der Kompression, Lagerung, Dekompression und Biegeüberwachung enthalten

die Sättigungszeit. Die Kompressionsrate der Ratte betrug 1 msw/min bis 10 msw mit 20-prozentigen HeO-Gasmischungen und 3,54 msw/min von 10 msw bis 400 msw mit reinem He. Die Zeitkomprimierung von der Oberfläche auf 400 msw dauerte etwa 120 Minuten. Die untere Phase bei 400 msw dauerte 120 Minuten. Die Sauerstoffkonzentration wurde mit reinem Sauerstoff ergänzt, um den Sauerstoffpartialdruck während des Kompressionsprozesses und der Lagertiefe bei 35–50 kPa zu halten. Der Zeitraum der Dekompressionskurvenbeobachtung betrug 40 Minuten bei 300 msw, 45 min bei 200 msw, 50 min bei 105 msw, 60 min bei 45 msw, 75 min bei 10 msw, 75 min bei 3 msw und dann an der Oberfläche. Die in diesem Dekompressionsmodell verwendete Aufstiegsgeschwindigkeit beträgt etwa 10 Meter (33 Fuß) pro Minute. Der Sauerstoffpartialdruck wurde während der Dekompressionsphase bei 38–67 kPa gehalten. Nach der Dekompression auf 10 m wurde die Sauerstoffkonzentration bei 20–24 Prozent gehalten. Die Übersicht über den Zeitverlauf des Sättigungstauchens ist in Abb. 2 dargestellt. Ratten in der Luftkontrollgruppe (Gruppe CON, Kontrollgruppe genannt, mit acht Ratten) wurden in der atmosphärischen Umgebung im selben Versuchslabor mit derselben Kammer wie die HSD-Gruppen gezüchtet. Die Kontrollgruppe erhielt keine Komprimierungs- oder Dekomprimierungsprozeduren, musste jedoch ähnliche Geräusche und Lichteinwirkungen ertragen wie die HSD-Gruppe.

Beispielsammlung

Nach der Dekompressionsphase wurden die Ratten intraperitoneal mit Pentobarbitalnatrium ({{0}},3 Prozent, 1,0 ml/kg Rattengewicht) anästhesiert, gefolgt von der Entfernung des Gehirns. Die linken Gehirnhälften wurden schnell präpariert. In zwei Tiergruppen wurden die Cortex-, Hippocampus- und Striatum-Gewebe präpariert und jeweils mit HSDC, HSDH, HSDS, CONC, CONH und CONS abgekürzt. Als größtes Gewebe unter den drei Kompartimenten wurde jede Kortexprobe dann in zwei Stücke mit ungefähr gleichem Gewicht geschnitten (ein Teil der Probe für die Metabolomik-Analyse, die anderen Probenstücke für biochemische Bewertungen). Alle Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur weiteren Analyse bei –80 °C gelagert.

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E-Mail:wallence.suen@wecistanche.com

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