Teil 1: Antifibrotische Wirkung von 6-Brom-indirubin-3 ′ -oxim (6-BIO) über die Regulierung des Aktivatorproteins-1 (AP-1) Und Spezifität Protein-1 (SP-1) Transkriptionsfaktoren in Nierenzellen

Antifibrotische Wirkung von 6-Brom-indirubin-3 ′ -oxim (6-BIO) über die Regulierung des Aktivatorproteins-1 (AP-1) und des Spezifitätsproteins -1 (SP-1) Transkriptionsfaktoren in Nierenzellen

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Schlüsselwörter:Niere, Fibrose,SMAD,Antifibrotisch

ABSTRAKT

PAI-1 und CTGF werden überexprimiertNiereKrankheitenund verursachenFibroseder Lunge, Leber uNieren. Wir haben ein Rattenmodell der einseitigen Harnleiterobstruktion (UUO) verwendet, um zu untersuchen, ob6-BIO, ein Glykogensynthasekinase-3-Inhibitor, abgeschwächtFibrosedurch Hemmung von PAI-1 und CTGF in vivo. Zusätzlich TGF-induzierte zelluläreFibrosewurde in vitro am Menschen beobachtetNiereproximale tubuläre Epithelzellen (HK-2) und interstitielle Rattenfibroblasten (NRK49F). Ausdruck vonFibrose-verwandte Proteine ​​und Signalmoleküle wie PAI-1, CTGF, TGF , SMA,SMADund MAPK wurden in HK-2- und NRK49F-Zellen mittels Immunoblotting bestimmt. Um die Transkriptionsfaktoren zu identifizieren, die die Expression von PAI-1 und CTGF regulieren, wurden die Promotoraktivitäten von AP-1 und SP-1 unter Verwendung von Luciferase-Assays analysiert. Konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die Co-Lokalisierung von AP-1 und SP-1 zu PAI-1 und CTGF zu beobachten. Die Expression von PAI-1, CTGF, TGF und -SMA nahm im UUO-Modell sowie in TGF-behandelten HK-2- und NRK49F-Zellen zu. Darüber hinaus induzierte die UUO- und TGF-Behandlung die Aktivierung von P-SMAD2/3, SMAD4, P-ERK 1/2, P-P38 und P-JNK MAPK-Signalwege. Die PAI-1-, CTGF-, AP-1- und SP-1-Promotoraktivität nahm als Reaktion auf die TGF-Behandlung zu. Allerdings Behandlung mit6-BIOverringerte die Expression von Proteinen und damit verbundenen SignalwegenFibroseim UUO-Modell sowie in TGF-behandelten HK-2- und NRK49F-Zellen. Darüber hinaus schwächte die 6-BIO-Behandlung die Expression von PAI-1 und CTGF sowie die Promotoraktivitäten von AP-1 und SP-1 ab und regulierte dadurch dieSMADund MAPK-Signalwege und anschließendes AusübenantifibrotischEffekte anNiereZellen.

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1. Einleitung

NiereFibrose wird durch verschiedene Faktoren verursacht, darunter Diabetes, Bluthochdruck, Glomerulonephritis und altersbedingte chronische ErkrankungenNiereKrankheit [1–3]. Glomeruli-Sklerose und tubulointerstitielleFibrosesind die letzten pathologischen Merkmale vonNiereKrankheiten [4,5]. Übermäßige Produktion und Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix (ECM) verursachen strukturelle und funktionelle Schäden an derNieren, was zu einem allmählichen Verlust seiner Funktion führt, der im Endstadium gipfeltNiereKrankheit [5]. DasNierenhaben eine komplexe Struktur, die in Glomeruli, tubulointerstitielle und Gefäßsysteme unterteilt ist; Jedes Kompartiment hat eine andere Art von extrazellulärer Matrix und kann davon beeinflusst werdenFibrose[6,7]. Die ECM der interstitiellen Tubuluszellen enthält verschiedene Komponenten, einschließlich Kollagen, Glykosaminoglykan, Elastin, Laminin und Glykoproteine. Aktivierte proximale Tubuluszellen können das Tubulointerstitial aktivieren [6–10]. Glykogen-Synthase-Kinase (GSK3) fördertNiereFibrosedurch Aktivierung des TGF-Signalwegs in proximalen tubulären und tubulointerstitiellen Zellen [11]. In dieser Studie wollten wir die Wirkungen des GSK3-Inhibitors bestimmen,6-BIO, auf proximale tubuläre und interstitielle Fibroblastenzellen, indem sie auf den Plasminogen-Aktivator-Inhibitor -1 (PAI-1) und den Bindegewebe-Wachstumsfaktor (CTGF) abzielen, die eine entscheidende Rolle bei der Progression spielenNiereSchäden und tubulointerstitialFibrose.

6-BIOist ein zellgängiges Derivat eines Indirubin-Analogons, 6-bro-Indirubin, das aus Meeresmollusken isoliert wird und eine hohe Spezifität und Selektivität für GSK-3 aufweist [12,13].6-BIOist ein kompetitiver Inhibitor von ATP und weist Ähnlichkeit mit der ATP-Bindungsdomäne der Cyclin-abhängigen Proteinkinase (CDK) auf, die die Antitumoraktivität reguliert [14–16]. Abnormale GSK3-Aktivität wird mit mehreren menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht, darunter Diabetes, Entzündungen, neurodegenerative Erkrankungen und Psychosen [17,18]. In früheren Studien wurde gezeigt, dass GSK3-Inhibitoren beschädigte Tubuli reparieren und Entzündungsreaktionen, den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) im Zusammenhang mit der TGF-1-Signalübertragung und die Akkumulation von Fibronektin in kultivierten glomerulären Zwischenzellen reduzieren können [11,19–21]. Zusätzlich,6-BIOkann bei mehreren Krankheiten, einschließlich Diabetes, neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, potenzielle therapeutische Wirkungen entfalten, indem es Entzündungen, oxidativen Stress, das Zellüberleben sowie die Proliferation und den Zelltod reguliert [22–24]. Allerdings sind die möglichen therapeutischen Wirkungen von6-BIOanNiereFibroseim Zusammenhang mit dem proximalen tubulären und tubulären interstitiellen Schaden sind noch unbekannt.

PAI-1, ein multifunktionales Glykoprotein in derNieren, ist ein Serinprotease-Inhibitor, der den Urokinase-Plasminogen-Aktivator (uPA) und den Gewebe-Plasminogen-Aktivator (tPA) hemmt, der Plasminogen zu Plasmin abbaut [25,26]. Die Überexpression von PAI-1 hemmt die Fibrinolyse und den Abbau von ECM, wodurch die ECM-Akkumulation erhöht wird [27]. Darüber hinaus reguliert PAI-1 die MAPK (Mitogen-aktivierte Proteinkinasen) hoch,SMAD, und RhoA/ROCK (Rho-assoziierte Proteinkinase) Signalwege bei Diabetes und chronischNiereKrankheit [28–30]. Transkriptionsfaktoren wie AP-1, SP-1,SMAD3/4, USF2 (Upstream-Transkriptionsfaktor 2) und CTF/NF (Familie der ortsspezifischen DNA-Bindung

Proteine), werden ebenfalls durch MAPK aktiviert undSMADSignalisierung [30,31]. Die kombinierte Aktivierung dieser Signalwege und Transkriptionsfaktoren erhöht die Expression von PAI-1 und führt zur Akkumulation von ECM. CTGF ist ein ECM-verwandtes Heparin-bindendes Protein und umfasst Domänen wie Insulin-like Growth Factor Binding Protein (IGFBP), die von-Willebrand-Typ-C-Wiederholungen (VWC), Thrombospondin-Typ-1-Wiederholungen (TSR) und einen C-Terminus Domäne (CT) mit einem Cysteinknotenmotiv. Von diesen vier Domänen interagiert die CT-Domäne mit der TGF-Superfamilie, Fibronectin und Perlecan [32–34]. Folglich erhöht CTGF MAPK,SMAD, PI3K- und YAP-Signalgebung durch Induktion von TGF , und diese Signalwege aktivieren Transkriptionsfaktoren wie AP-1, SP-1, NF-kB undSMAD2/3. Somit induziert die Hochregulierung von CTGF die Migration, Proliferation und Entzündung von Zellen, wodurch eine ECM-Akkumulation verursacht wird [35–37].

Basierend auf diesen Ergebnissen früherer Studien spekulierten wir, dass MAPK undSMADSignalisierung, sowie AP-1- und SP-1-Transkriptionsfaktoren, möglicherweise die gemeinsamen Verbindungen zwischen PAI-1 und CTGF-induzierter ECM-Akkumulation bei progressiverNiereKrankheit und tubulointerstitiellenFibrose. Daher haben wir untersucht, ob6-BIOkönnte chronische Progression verhindernNiereKrankheit durch Regulierung von PAI-1 und CTGF.

2. Material und Methoden

2.1. Antikörper und Reagenzien

Die primär verwendeten Antikörper waren Anti-Kaninchen-Antikörper gegen PAI-1 (11907), TGF (3711), phosphoryliertSMAD2/3 (8828), SMAD4 (38454), phosphoryliertes ERK (P-ERK) (9101), phosphoryliertes P38 (P-P38) (4631), phosphoryliertes JNK (P-JNK) (9251), phosphoryliertes C-JUN (PC-JUN) (3270) , phosphoryliertes C-FOS (PC-FOS) (5348) und Histon H3 (9715), die alle von Cell Signaling Technology bezogen wurden. CTGF (sc-365970), SP-1 (sc-17824),SMAD6 (sc-25321) wurden von Santa Cruz Biotechnology erhalten. Maus-Aktin-Antikörper (a5316) und (2'Z,3'E)-6-Bromindirubin-3-oxim (6-BIO) (B1686) wurden von Sigma-Aldrich erhalten.

2.2. Tierversuche

Alle Tierversuche wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care Regulations (ACR) Committee der Chonnam National University Medical School (CNUH IACUC-18010, 19. April 2019) genehmigt. Experimente wurden mit männlichen Sprague-Dawley-Ratten (180–200 g, Samtako, Korea) durchgeführt [38]. Die Ratten wurden unter kontrollierter Temperatur (21 ± 2 °C) in einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Ratten wurden in drei Gruppen eingeteilt: Kontrolle (n=6), einseitige Harnleiterobstruktion (UUO, n=6) und UUO mit6-BIOBehandlung (n=6).6-BIO({{0}},2 mg/kg/Tag) wurde 6 Tage lang intraperitoneal (ip) injiziert. Um ein obstruktives Nephropathie-Rattenmodell zu entwickeln, wurde die Operation wie folgt durchgeführt: UUO wurde durch Unterbinden des linken Harnleiters für sieben Tage induziert. Die Bauchhöhle wurde geöffnet und eine 2–0-Seidenligatur wurde am linken proximalen Ureter platziert. Die Kontrollgruppe erhielt sieben Tage lang die gleiche Behandlung, mit Ausnahme der Ligatur. Die Ratten hatten freien Zugang zu Standard-Rattenfutter und Leitungswasser und wurden am Tag 7 nach der Operation getötet. DasNierenwurden schnell entfernt und für Immunhistochemie und Western-Blotting verarbeitet.

2.3. Histologie

NiereGewebe wurden mit 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 5 um dicke Schnitte geschnitten. Hämatoxylin und Eosin (H&E), Perjodsäure-Schiff (PAS), Siriusrot und Masson's Trichrom (MT)-Färbungsverfahren wurden durchgeführt, um die histologische Morphologie zu beurteilen. Die H&E-, PAS-, Siriusrot-Färbung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Für die MT-Färbung wurden die Schnitte nach der Entparaffinierung mit Xylol mit Bouin-Lösung bei 56 ◦ C für 30 min behandelt und unter fließendem Leitungswasser gewaschen, bis die Schnitte klar waren. Die Schnitte wurden anschließend mit Weigerts Hämatoxylin (A: B=1:1) gefärbt, gefolgt von einer 10-minütigen Färbung mit Biebrich Scarlet/Acid Fuchsin-Lösung und Waschen mit destilliertem Wasser. Die Schnitte wurden 10 min mit Phosphorwolframsäure/Phosphomolybdänsäure-Lösung inkubiert und 15 min mit Anilinblau-Lösung behandelt. Anschließend wurden die Schnitte für 1 min mit Essigsäure inkubiert und mit Ethanol und Xylol dehydriert. Kollagenablagerungen, Zellkerne und Muskelfasern wurden blau, schwarz bzw. rot gefärbt. Die quantitative Analyse des gefärbten Schnitts wurde mit der ImageJ-Software durchgeführt.

2.4. Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden geerntet, zweimal mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, in Lysepuffer resuspendiert und kurz beschallt. Proteinextraktionspuffer bestand aus 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 % Nonidet P-40, 0,1 % SDS, Protease-Inhibitor-Cocktail (GenDEPOT, P3100– 001) und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail

(GenDEPOT, P3200–001). Nach der Zentrifugation wurden Überstände, die die Proteinextrakte enthielten, gesammelt und die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Pierce® BCA Protein Assay Kits (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, USA) gemessen. Proteine ​​wurden auf 12-prozentigen Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelen getrennt und auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Blots wurden bei Raumtemperatur für 1 h mit 5 % Magermilch in PBS, enthaltend 0,1 % Tween-20 (PBST), blockiert. Der Blot wurde dann über Nacht mit dem primären Antikörper (1:2000) bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit dem sekundären Antikörper (1:2500) und schließlich mit Anti-Kaninchen-Meerrettich-Peroxidase-konjugierten Antikörpern, wie zuvor beschrieben [39 ]. Spezifische Proteinbanden wurden unter Verwendung eines verbesserten Chemilumineszenzsystems sichtbar gemacht. Quantitative Analyse von

Die Bandenintensität wurde unter Verwendung der ImageJ-Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) bestimmt.

2.5. siRNA-Knockdown

Für den Knock-down von SP-1 wurden SP-1-siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-29487) und Kontroll-siRNA (Santa Cruz, sc-37007) transfiziert für 24 h in HK-2- und NRK49F-Zellen bei 60 Prozent Konfluenz unter Verwendung von Dhar-maFECT 1-Transfektionsreagenz (Dharmacon, T-2001–02) bei einer Endkonzentration von 30 nM. Die Zellen wurden einen Tag lang in serumfreiem Medium in einem 37^◦ C-Inkubator unter einer befeuchteten 5-prozentigen CO 2 -Atmosphäre, vorbehandelt mit 6-BIO für 1 h und stimuliert mit TGF – für 24 h. Die Wirksamkeit des Niederschlags wurde durch Western-Blot-Analyse bestimmt.

2.6. Transiente Transfektion des Plasmids und des Reporterkonstrukts

Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 60–70 % gezüchtet, mit DMEM-F-12- (HK-2-Zellen) oder DMEM- (NRK49F-Zellen) Medien gewaschen und dann für 24 h in den jeweiligen Medien ohne Serum und Antibiotika inkubiert . Die Zellen wurden dann mit dem dominant-negativen C-JUN-Konstrukt sowie PAI-1-, CTGF-, AP-1- und SP-1-Reporter, die den pGL3-Vektor tragen, unter Verwendung von FuGene HD-Reagens transfiziert. Die Konzentration des bei der transienten Transfektion verwendeten Reporterplasmids betrug 2 μg (1 μg/μl). Reporter-transfizierte Zellen wurden mit 6-BIO für 1 h vorbehandelt und mit 10 ng/ml TGF für 16 h inkubiert.

2.7. Promotor-Reporter-Assay

Die Reporterkonstrukte PAI-1 und CTGF wurden von BIO FACT (Yuseong-gu, Daejeon, Republik Korea) hergestellt. Die Reporterkonstrukte pGL3-AP-1 und pGL3-SP-1 wurden freundlicherweise von Professor Young Do Jung (Chonnam National University) zur Verfügung gestellt. Die Transkriptionsregulation von PAI-1, CTGF, AP-1 und SP-1 wurde durch transiente Transfektion ihrer jeweiligen pGL3-Promotor-Luciferase-Reporterkonstrukte untersucht. HK-2- und NRK49F-Zellen (5 × 10 5) wurden ausgesät und gezüchtet, bis eine Konfluenz von 60–70 % erreicht war. Dann wurden die Promotorkonstrukte und pGL3-leeren Vektoren in die Zellen unter Verwendung von FuGene HD gemäß dem Protokoll des Herstellers transfiziert. Das für Renilla-Luciferase codierende pRL-Null-Plasmid wurde in alle Proben eingeschlossen, um die Transfektionseffizienz zu überwachen. 24 h nach der Transfektion wurden die Niveaus der Glühwürmchen- und Renilla-Luciferase-Aktivitäten sequentiell aus einer einzigen Probe unter Verwendung des Dual-Glo-Luciferase-Testsystems (Promega) gemessen. Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde auf die Renilla-Aktivität und die relative Menge an Luciferase-Aktivität in den unbehandelten Zellen normalisiert.

2.8. Konfokale Lasermikroskopie

RatteNiereProben wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet und in 3- μm dicke Schnitte geschnitten.NiereSchnitte wurden entparaffiniert und rehydriert, blockiert, mit PBS gewaschen und mit Anti-PAI-1, Anti-CTGF, Anti-PC-JUN, Anti-PC-FOS, Anti-SP-1 und inkubiert Anti-AQP1-Antikörper, verdünnt in Blockierungspuffer, für 24 h at

4 ^◦C. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit einem Alexa Fluor 488 (grüne Fluoreszenz) Ziegen-Anti-Kaninchen (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), Cy3 (rote Fluoreszenz) Ziegen-Anti-Maus oder Ziegen-Anti-Kaninchen (Invitrogen , Oregon) Antikörper für 2 h. HK-2- und NRK49F-Zellen (3 × 10 5) wurden in {{10}}-Well-Kammern ausgesät und für 24 h bei 37 ◦ C inkubiert. Die Zellen wurden mit 5 μM vorbehandelt 6-BIO für 1 h und dann für 16 h 10 ng/ml TGF ausgesetzt. Nach dem Waschen mit 1X PBS wurden die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 15 min fixiert und für 2 h bei Raumtemperatur mit 1X PBS, enthaltend 1 % BSA und 0,2 % Triton X-100, blockiert. Die Zellen wurden dann mit monoklonalen Kaninchen- oder Maus-Antikörpern gegen PAI-1, CTGF, PC-JUN, PC-FOS und SP-1 (1:200 verdünnt in Blockierungspuffer) bei 4 Grad für 24 inkubiert h. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit entsprechenden sekundären Antikörpern (Cy3-Ziege-Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper, Alexa Fluor 488 Ziege-Anti-Kaninchen- und Anti-Maus-Antikörper, verdünnt 1:200) für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden Deckgläser unter Verwendung von ProLong Gold Antifade Reagenz mit DAPI (Life Technologies Corporation) auf Mikroobjektträger montiert. Die Bilder wurden unter dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop Leica TCS SP8 (Leica Microsystems, Mannheim, Deutschland) analysiert.

2.9. statistische Analyse

Die Ergebnisse wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Mehrere Vergleiche zwischen den Gruppen wurden durch einfache ANOVA und Tukey's Honourly Significant Difference (HSD) Post-Hoc-Test durchgeführt. Ergebnisse mit p < 0,05="" wurden="" als="" statistisch="" signifikant="">

3. Ergebnisse

3.1. 6-BIO dämpft morphologische Veränderungen und die Expression von Fibrose-assoziierten Markern im UUO-Rattenmodell

Wir haben die Auswirkungen von 6-BIO auf bewertetFibrosein demNiereneines UUO-Rattenmodells. Wie in Fig. 1A gezeigt, zeigte das UUO-Modell eine deutliche ZunahmeNieretubulointerstitieller Schaden, glomeruläre Sklerose, interstitielle Infiltration von mononukleären Zellen, Ablagerung von interstitiellem Kollagen undFibroseverglichen mit den Kontrollen, bestimmt durch H&E-, PAS-, Siriusrot- und MT-Färbung. Darüber hinaus induzieren die EMT-verwandten ProteineNiereFibrosesowie Kollagen I und -IV, die die ECM-Akkumulation erhöhen, waren in UUO im Vergleich zu den Kontrollen erhöht (Abb. S1A und C). Diese Veränderungen wurden jedoch durch die 6-BIO-Behandlung abgeschwächt. 1B zeigt, dass nach 7 Tagen Obstruktion die Expression von PAI-1-, CTGF-, -SMA- und TGF-Proteinen in den Nieren von UUO-Modellratten im Vergleich zu der von Kontrollen zunahm, und diese Zunahme wurde durch abgeschwächt Behandlung mit 6-BIO. Der Ausdruck vonfibrotischMarker erhöhten sich deutlich in UUO im Vergleich zu Kontrollen, was durch die entgegengewirkt wurde6-BIOBehandlung (Abb. 1C). Die Immunfluoreszenzfärbung (Fig. 1D) zeigte, dass die Expression von PAI-1 und CTGF (rote Fluoreszenz) in den Obstruktionen zunahmNierenam Tag-7 im Vergleich zu den Kontrollen. Die Expression von PAI-1 und CTGF nahm jedoch nach 6-BIO-Behandlung ab (Fig. 1D). Insgesamt legen diese Befunde nahe, dass 6-BIO den tubulointerstitiellen Schaden durch Hemmung der PAI-1- und CTGF-Expression abschwächt.

3.2. 6-BIO dämpft die Expression von PC-JUN, PC-FOS, SP-1 und hemmt Fibrose-assoziierte Signalwege im UUO-Rattenmodell

Als nächstes haben wir festgestellt, ob6-BIObeeinflusst die damit verbundenen SignalwegeNiereFibrose. Das haben wir erstmal bestätigt6-BIO, das ein bekannter Inhibitor von GSK3 ist, hemmt die GSK3-Phosphorylierung. Abb. S1A und B zeigen die Reduktion von GSK3 durch 6-BIO. Abb. 2A zeigt die TGF/SMADSignalweg. Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von phosphoryliertenSMAD2/3 undSMAD4 Proteine ​​in UUO erhöhtNieren, die durch die 6-BIO-Behandlung abgeschwächt wurde (Abb. 2A). Jedoch,SMAD6, das die Phosphorylierung von SMAD 2 und die Aktivität von hemmtSMAD4 [40], hatte gegensätzliche Ergebnisse. Darüber hinaus spielt die MAPK-Signalisierung eine Schlüsselrolle beiNiereFibrose [41,42]. Wir haben eine Western-Blot-Analyse durchgeführt, um festzustellen, ob 6-BIO die MAPK-Signalisierung beeinflusst. Die Spiegel von phosphoryliertem ERK, JNK und P38 stiegen bei UUO anNierenim Vergleich zu denen, die die Kontrolle habenNieren(Abb. 2B). Die Expression von phosphoryliertem ERK und JNK wurde durch die 6-BIO-Behandlung signifikant verringert, während die Abnahme des phosphorylierten p38-Spiegels vernachlässigbar war (Fig. 2B).SMADund MAPK-Signalwege wurden in der UUO-Gruppe hochreguliert, was durch die umgekehrt wurde6-BIOBehandlung (Abb. 2C). Daran sind viele Transkriptionsfaktoren beteiligtNiereFibroseund spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der nachgelagerten Genexpression. Fig. 2D zeigt, dass nach 7 Tagen Obstruktion die Expression von PC-JUN-, PC-FOS- und SP-1-Proteinen in den erhöht warNierenvon Ratten mit UUO im Vergleich zu Kontrollen, und dieser Anstieg wurde durch 6-BIO-Behandlung abgeschwächt. Ebenso die Expression von AP-1 und SP-1, den wichtigen regulierenden TranskriptionsfaktorenNiereFibrose-assoziierte Gene, war deutlich erhöhtNierenvon Ratten mit UUO, wurde jedoch bei Behandlung mit 6-BIO abgeschwächt (Fig. 2E). Fig. 2F zeigt die Immunfluoreszenzfärbung von PC-JUN, PC-FOS. und SP-1. Die rote Fluoreszenz der PC-JUN-, PC-FOS- und SP-1-Färbung war bei den Obstruktionen signifikant erhöhtNieren, verglichen mit den Kontrollen, und wurde durch die 6-BIO-Behandlung verringert. Diese Ergebnisse bestätigen, dass AP-1 und SP-1 wichtige Transkriptionsfaktoren sind, die daran beteiligt sindNiereFibrose und6-BIOkann abnehmenNiereFibrose, indem sie ihre transkriptionelle Aktivität abschwächen.

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