Teil 1: Etablierung des gleichzeitigen experimentellen Modells von Osteoporose in Kombination mit der Alzheimer-Krankheit bei Ratten und die dualen Wirkungen von Echinacosid und Acteosid aus Cistanche Tubulosa
Mar 24, 2022
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Yi Chen, Ying-Qi Li, Jia-Yi Fang, Ping Li, Fei Li
ABSTRAKT
Ethnopharmakologische Relevanz: Cistanche tubulosaist eine wertvolle traditionelle chinesische Medizin, die bei der Behandlung von Osteoporose und Osteoporose weit verbreitet istAlzheimer-Krankheit. Echinacosidund Acteosid sind die wichtigsten aktiven Bestandteile in Cistanche tubulosa, die pharmakologische Aktivitäten mit Forschungswert haben. Es wurde berichtet, dass Echinacosid undActeosidkönnte die Lern- und Gedächtnisfähigkeit verbessern, die Proliferation und Differenzierung von Osteoblasten fördern. Ziel der Studie: Echinacosid und Acteosid ausCistanche tubulosahaben signifikante Aktivitäten gegen Osteoporose und Alzheimer-Krankheit gezeigt, während diese Wirkungen nicht gleichzeitig in einem Rattenmodell untersucht wurden. Das Ziel dieser Studie war es, das Modell der Osteoporose in Verbindung mit zu etablieren und zu verifizierenAlzheimer-Krankheitbei Ratten und um die Doppelwirkung von zu untersuchenEchinacosidund Acteosid auf diesem gleichzeitigen Modell.
Materialen und Methoden:Drei Modellgruppen Ovariektomie (OVX), Scheinoperation mit D-Galactose und AlCl3 (D), Ovariektomie mit D-Galactose und AlCl3 (OVX plus D) wurden gleichzeitig gesetzt. Den Ratten in den Arzneimittelbehandlungsgruppen wurden die Eierstöcke entfernt. Während die intraperitoneale Injektion von D-Galactose und die intragastrale Verabreichung von AlCl 3 bei den Ratten der Arzneimittelbehandlungsgruppen durchgeführt wurden, wurde den Ratten oral verabreichtEchinacosid(90 mg/kg/Tag),Acteosid(90 mg/kg/Tag) und die Positivkontrollen Östradiolvalerat (0,6 mg/kg/Tag) bzw. Donepezil-HCl (0,8 mg/kg/Tag). Nach der medikamentösen Behandlung von 8 Wochen wurde zuerst ein Morris Water Maze (MWM) Test für 6 Tage durchgeführt. Die Ratten wurden dann geopfert, um Blut, Uteri, Femora, Tibiae und Hirngewebe zu gewinnen. Das Serum wurde für biochemische Tests verwendet. Die Uteri wurden für die Histomorphometrie verwendet. Die rechten Femora wurden für Mikro-CTbzw. Histomorphometrie. Für den biomechanischen Test wurden die rechten Schienbeine verwendet. Der auf der Eisbox gesammelte Hippocampus wurde für biochemische Tests verwendet. Das durch Perfusion gesammelte Gehirn 41 wurde für die Histomorphometrie verwendet.
Ergebnisse:Im Vergleich zur Sham-Gruppe konnte die OVX plus D-Gruppe die Lern- und Gedächtnisfähigkeit signifikant reduzieren, indem sie oxidative Schäden verursachte, Neuronen im Hippocampus beeinträchtigte und die Hydrolyse und Synthese von Acetylcholin beeinflusste. Inzwischen nahmen die Aktivitäten von BALP und TRAP in der OVX plus D-Gruppe deutlich zu (P<0.001) as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" in="" addition,="" compared="" with="" the="" sham="" group,="" the="" mean="" bone="" mineral="" density="" obviously="" decreased=""><0.05), the="" trabecular="" bone="" mass="" and="" microarchitecture="" were="" also="" destroyed="" significantly="" in="" the="" ovx+d="" group.="" furthermore,="" the="" maximum="" load="" and="" maximum="" stress="" significantly="" reduced=""><0.01) and="" the="" energy="" 50="" absorption="" also="" decreased="" greatly="" as="" compared="" to="" the="" sham="" group.="" after="" being="" administrated="" with="">EchinacosidundActeosid, die typischen pathologischen Merkmale der Osteoporose undAlzheimer-Krankheitwurden gebessert.
Schlussfolgerungen:Das Modell der Osteoporose kombiniert mitAlzheimer-Krankheitbei Ratten durchführbar und erfolgreich etabliert.Echinacosidund Acteosid zeigten ebenfalls einige signifikante Wirkungen auf dieses gleichzeitige Modell, und sie könnten potenzielle Kandidaten von 56 seinCistanche tubulosamit doppelter Wirkung für weitere Studien.
Schlüsselwörter:Osteoporose; Alzheimer-Krankheit; Dual-Effekte; Echinacosid; Acteosid; Cistanche tubulosa
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1. Einleitung
Osteoporose ist eine degenerative Knochenerkrankung, die durch einen fortschreitenden Verlust an Knochenmasse und Zerstörung der Mikroarchitektur gekennzeichnet ist, was das Risiko einer Fragilitätsfraktur erhöhen kann (Rachner et al., 2011).Alzheimer-Krankheit(AD) ist eine häufige neurodegenerative Erkrankung bei älteren Menschen, die klinisch durch kontinuierlichen geistigen Verfall, kognitive Beeinträchtigung und Verlust der unabhängigen Lebensfähigkeit gekennzeichnet ist (Reitz 76 et al., 2011). Die durch -Amyloid-Ablagerung induzierte Bildung von seniler Plaque, durch Tau-Hyperphosphorylierung verursachte neurofibrilläre Verwicklungen und neuronale Degeneration im Gehirn sind die typischen pathologischen Merkmale von AD (Serrano-Pozo et al., 2011). Oberflächlich betrachtet sind OP und AD völlig unabhängige Krankheiten mit unterschiedlicher Pathologie und klinischen Merkmalen. In der klinischen Praxis wird jedoch häufig beobachtet, dass OP und AD gemeinsam auftreten (Zhang et al., 2001; Lui et al., 2003; Luckhaus et al., 2009). Die Prävalenz beider Erkrankungen nahm mit dem Alter zu, insbesondere bei postmenopausalen Frauen (Li et al., 2017; Stern, 2012). Immer mehr Beweise deuten darauf hin, dass Menschen, bei denen AD diagnostiziert wurde, ein erhöhtes OP-Risiko haben (Zhou et al., 2014).
Es ist notwendig, die Beziehungen zwischen Osteoporose und zu untersuchen und zu klärenAlzheimer-Krankheitin vitro und in vivo. Bevor die Studien in vivo durchgeführt werden, ist es wichtig, geeignete Tiermodelle für Osteoporose oder Alzheimer-Krankheit auszuwählen. Das Osteoporose-Modell könnte durch verschiedene Arten von Methoden wie intragastrische Verabreichung von Retinsäure, Eierstockentfernung und intramuskuläre Injektion von Glukokortikoiden etabliert werden (Wei et al., 2007; Komori, 2015). Insbesondere das postmenopausale Osteoporosemodell, das durch Ovarektomie bei Ratten induziert wurde, war klassisch undwurde in den meisten Studien häufig verwendet (Miao et al., 2012; Liu et al., 2017).Die sporadische Alzheimer-Krankheit ist die Hauptform der Alzheimer-Krankheit. Das TierModelle von SporadischAlzheimer-Krankheitkönnte durch verschiedene Methoden induziert werden, wie zInjektion von D-Galactose bzw -Amyloid, intragastrische Verabreichung von AlCl3,usw(Bagheri et al., 2011; Gao et al., 2015; Justin Thenmozhi et al., 2017). zusätzlichKonjunktionsmodell der Alzheimer-Krankheit, induziert durch langfristige intraperitonealeInjektion von D-Galactose kombiniert mit Ovariektomie wurde ebenfalls viel untersucht (Liuet al., 2010; Zhao et al., 2012). Um die Relevanz von Osteoporose aufzuzeigen undAlzheimer-Krankheit, ist es notwendig, das Modell der kombinierten Osteoporose zu etablierenmit Alzheimer-Krankheit, um die gemeinsamen Mechanismen von Arzneimitteln zu untersuchenOsteoporose uAlzheimer-Krankheitass.
Cistanche tubulosa(Schenk) Wight ist eine parasitäre Pflanze, die hauptsächlich in den Wüsten Nordwestchinas verbreitet ist. Die getrockneten saftigen Stängel vonCistanche tubulosa(CT) werden als berühmte Tonika namens Cistanches Herba mit dem chinesischen Namen Roucongrong im Chinesischen Arzneibuch (2015) verwendet. Es wurde als "Ginseng der Wüsten" geehrt und wird in der traditionellen chinesischen Medizin häufig zur Behandlung von Hüft- und Knieschmerzen, weiblicher Sterilität und Verstopfung eingesetzt (Jiang und Tu, 2009). Die wichtigsten aktiven Bestandteile von CT sind Phenylethanoidglykoside (PhGs), Echinacosid (ECH) undActeosid(ACT) sind die repräsentativen Verbindungen in PhGs (Morikawa et al., 2014). Insbesondere ECH und ACT werden typischerweise als Marker für die Qualitätskontrolle in der CT aufgrund ihres hohen Gehalts und verschiedener pharmakologischer Aktivitäten ausgewählt, wie z.
Antioxidantien, Anti-Aging und Verbesserung der Lern- und Gedächtnisfähigkeit (Wang et al.,2012; Li et al., 2016). Allerdings sind die Auswirkungen von ECH und ACT auf Osteoporosekombiniert mitAlzheimer-Krankheitwurden noch nicht zusammen in einem Rattenmodell untersucht.Daher war der Zweck dieser Studie, ein kombiniertes Rattenmodell für Osteoporose zu etablierenmit Alzheimer-Krankheit und erforschen Sie die Auswirkungen vonEchinacosidund Acteosid dazusimultanes Modell, um experimentelle Beweise für weitere Studien zu liefernmolekularer Mechanismus von Echinacosid oder Acteosid in der folgenden Forschung.
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2. Materialien und Methoden
2.1. Tiere
Achtzig 8- Wochen alte weibliche Wistar-Ratten (Zertifikatsnummer: SCXK 2018-0006) mit einem Gewicht von 180 bis 200 g wurden vom Sino-British SIPPR/BK Lab erworben. Animal Ltd (Shanghai, China) und ist im Experimental Center of Pharmaceutical Animals der China Pharmaceutical University aufgewachsen.
2.2. Chemikalien und Reagenzien
Chloralhydrat, Penicillin G-Natrium, D-Galactose, Aluminiumchloridhexahydrat, Östradiolvalerat, Donepezil-HCl wurden von Aladdin Industrial Corporation (Shanghai, China) bezogen.Echinacosid(HPLC 94 Prozent) wurde von Chengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China) erhalten.Acteosid(HPLC 98 Prozent) wurde von Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, China) erworben. Knochenspezifische alkalische Phosphatase (BALP), tartratresistente saure Phosphatase (TRAP), Superoxiddismutase (SOD), Malonaldehyd (MDA), Acetylcholinesterase (AChE) und Cholin-Acetyltransferase (ChAT)-Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-Kits waren bezogen von Shanghai Enzyme-linked Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China). Universelles Gewebefixiermittel wurde bezogen vonChengdu Wecistanche Bio-Technology Co., Ltd. (Chengdu, China).
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2.3. Tiermodelle und Behandlungen
Alle Tierversuche wurden vom Animal Ethics Committee der China Pharmaceutical University genehmigt und überwacht. Die Ratten wurden mit einem 12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus in einem temperaturgeregelten Raum (22 ± 2 Grad) gehalten und mit Standardfutterpellets und Leitungswasser gefüttert.
Nach der Anpassung von einer Woche wurde das Osteoporose-Modell durch die Durchführung einer Ovarektomie erreicht (French et al., 2008). Nach Abschluss der Operation wurde das Penicillin G-Natrium einmal auf die Wundnaht gesprüht, um eine Infektion zu verhindern. Die Ratten wurden dann drei Wochen lang normal gefüttert. Laut der Referenz (Hua et al., 2007; Alawdi et al., 2017) ist das Modell vonAlzheimer-Krankheitkönnte durch langfristige intraperitoneale Injektion von D-Galactose in Kombination mit Ovariektomie oder langfristige intragastrische Verabreichung von AlCl3 induziert werden. Um die Durchführbarkeit des Osteoporose-Modells in Kombination mit der Alzheimer-Krankheit zu untersuchen, wurden drei Modellgruppen mit Ovarektomie (OVX-Gruppe), Scheinoperation mit intraperitonealer Injektion von 150 mg/kg/Tag D-Galactose und intragastrischer Verabreichung von 30 mg/kg/Tag AlCl3 untersucht (D-Gruppe), Ovarektomie mit intraperitonealer Injektion von 150 mg/kg/d D-Galactose und intragastraler Verabreichung von 30 mg/kg/d AlCl3 (OVX plus D-Gruppe) wurden in dieser Studie festgelegt.
Daher wurden die Ratten nach 3 Wochen zufällig in acht Gruppen (n{{0}} für jede Gruppe) eingeteilt und 8 Wochen lang oral mit Arzneimitteln behandelt: Schein-Gruppe; OVX-Gruppe; D-Gruppe; OVX plus D-Gruppe; Estradiolvalerat-Behandlungsgruppe (EV-Gruppe, OVX plus D plus 0,6 mg/kg/d Estradiolvalerat); Donepezil-HCl-Behandlungsgruppe (DPZ-Gruppe, OVX plus D plus 0,8 mg/kg/d Donepezil-HCl);EchinacosidBehandlungsgruppe (ECH-Gruppe, OVX plus D plus 90 mg/kg/d Echinacosid);ActeosidBehandlungsgruppe (ACT-Gruppe, OVX plus D plus 90 mg/kg/d Acteosid). Gemäß dem Human-Rat Equivalent Dose Conversion Principle und der Dosis aus verwandten Referenzen (Li et al., 2013; Gao et al., 2014) wurden die Dosierungen der Arzneimittelbehandlungsgruppen in dieser Studie übernommen.
Das Körpergewicht jeder Ratte wurde jede Woche gemessen. Nach der gesamten 8-wöchigen Behandlung mit Medikamenten wurde zunächst ein 6-tägiger Morris Water Maze (MWM)-Test durchgeführt. Danach wurden 6 Ratten aus jeder Gruppe getötet, um die Materialien zu ernten. Die Ratten wurden mit intraperitonealer Injektion von 3,0 ml/kg 10-prozentigem Chloralhydrat anästhesiert, und Blut wurde aus der Bauchschlagader entnommen. Das Blut wurde zur Gerinnung auf Raumtemperatur gebracht und 10 min bei 3500 U/min zentrifugiert. Das Serum wurde in einem 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen (NEST Biotechnology) geerntet und bei -80 Grad gelagert, bis es für biochemische Tests verwendet wurde. Die Uteri, Femora, Tibiae und Gehirngewebe wurden dann gesammelt. Die Uteri wurden für die Histomorphometrie verwendet. Die rechten Femora wurden jeweils für Mikro-CT und Histomorphometrie verwendet. Für den biomechanischen Test wurden die rechten Schienbeine verwendet. Der auf der Eisbox gesammelte Hippocampus wurde für biochemische Tests verwendet. Danach wurde das Herz der anderen drei Ratten jeder Gruppe mit Kochsalzlösung und universellem Gewebefixiermittel perfundiert, um das Gehirn für die Histomorphometrie zu entnehmen.
2.4. Morris Water Maze (MWM)-Test
Ratten wurden nach 8-wöchiger Intervention einem Raumbezugslernen und Gedächtnistests im MWM-Test unterzogen. Der MWM-Test wurde nach den zuvor beschriebenen Methoden durchgeführt (Morris, 1984; Gao et al., 2016). Kurz gesagt, an 5 aufeinanderfolgenden Tagen mit vier Versuchen pro Tag wurden Ratten darauf trainiert, eine Vielzahl von visuellen Hinweisen an der Beckenwand zu verwenden, um eine versteckte untergetauchte Plattform (Durchmesser 11 cm, Höhe 29 cm) in einem kreisförmigen Becken (Durchmesser 130 cm, Höhe 50 cm) gefüllt mit ungiftigem, mit Kohletinte getöntem Wasser. Der Pool wurde imaginär in vier Quadranten unterteilt, und vier Startpositionen befanden sich an den Schnittpunkten der Quadranten. Die Plattform befand sich in der Mitte eines der Quadranten und die Position war während der Versuche konstant. In jedem Versuch wurden Ratten zufällig an ausgewählten Orten platziert, mit Blick auf die Wand des Beckens. Jeder Versuch wurde beendet, wenn die Ratte die Plattform erreichte oder nach 60 s, und die verstrichene Zeit wurde als Fluchtlatenz aufgezeichnet. Ratten, die die Plattform nicht erreichten, wurden darauf geführt. Nach jedem Versuch mit versteckter Plattform blieb die Ratte 10 s auf der Plattform. Als Trainingsergebnisse wurde die durchschnittliche Latenzzeit von vier Versuchen pro Tag berechnet. Am Tag 6 wurden alle Ratten einem Sondenversuch unterzogen, bei dem sie 60 s im Becken ohne Plattform schwammen. Als Endergebnisse wurden die Überfahrtszeiten am Standort des Bahnsteigs und die Fahrzeit im Zielquadranten erfasst. Die Ratten wurden von einer Kamera überwacht, die direkt über dem Pool an der Decke montiert war, und alle Versuche wurden aufgezeichnet und mit dem MORRIS MAZE-Programm analysiert, das von Beijing Zhongshidichuang Science and Technology Development Co., Ltd. (Peking, China) geliefert wurde.
2.5. Biochemischer Test durch ELISA
Gemäß den Anweisungen des Herstellers von ELISA-Kits wurden die knochenspezifische alkalische Phosphatase (BALP)-Aktivität, die tartratresistente saure Phosphatase (TRAP)-Aktivität, die Superoxid-Dismutase (SOD)-Aktivität und der Malondialdehyd (MDA)-Gehalt im Serum von BioTek Synergy getestet 2 Multimode-Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA). Die Hippocampus-Gewebe jeder Gruppe wurden mit PBS (0,01 M, pH 7,4) gewaschen, um das auf der Gewebeoberfläche verbleibende Blut oder Verunreinigungen zu entfernen. Die Hippocampus-Gewebe auf einer Seite wurden gewogen und dann in möglichst kleine Stücke geschnitten. Die Hippocampus-Gewebe wurden gemäß dem Verhältnis 1:9 (Gewebegewicht:PBS-Volumen) homogenisiert. Das Homogenat wurde bei 4 Grad, 3000 U/min für 15 min zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und verdünnt, um die Proteinkonzentration durch das BCA-Verfahren zu messen. Die Acetylcholinesterase (AChE)-Aktivität, Cholinacetyltransferase (ChAT)-Aktivität, Superoxiddismutase (SOD)-Aktivität und Malondialdehyd (MDA)-Gehalt im Hippocampus-Gewebe wurden dann durch ELISA-Verfahren getestet.
2.6. Hippocampus-Histomorphometrie
Die Hirngewebe (n=3/Gruppe) wurden in universellem Gewebefixativ fixiert. Die Gehirngewebeproben wurden dann gewaschen, mit Gradienten-Ethanol dehydriert, in Paraffinwachs eingebettet und in koronale Schnitte von 5 &mgr;m geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Danach wurden die Koronalschnitte des Hirngewebes mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop (Nikon, Japan) fotografiert. Besonders beobachtet wurden die morphologischen Veränderungen von CA1, CA2, CA3 und DG im Hippocampus.
2.7. Uterus-Histomorphometrie und Morphometrie
Die ausgewählten Uteri (n{{0}}/Gruppe) wurden in universellem Gewebefixativ fixiert. Die Uterusgewebeproben wurden dann gewaschen, mit Gradienten-Ethanol dehydriert, in Paraffinwachs eingebettet und in Querschnitte von 5 &mgr;m geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Die Querschnitte der Uteri wurden beobachtet und fotografiert. Fünf Sichtfelder wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt, der Durchmesser des Uterus-Querschnitts und die Epitheldicke der Uterusschleimhaut wurden dann mit der Software Image-Pro Plus 6.0 gemessen. Die Anzahl der Uterusdrüsen in der Lamina propria wurde ebenfalls gezählt.
2.8. Mikro-CT
Die ausgewählten rechten Femora (n=3/Gruppe) wurden in einer Position mit einem Abstand des Objekts von der Quelle von 121 mm und dem Abstand der Kamera von der Quelle von 171 mm mit einem SkyScan 1176 micro X- gescannt. Strahlencomputertomographie (Mikro-CT) Scanner (Bruker, Deutschland). Als Referenzfläche wurde die distale Wachstumsfuge gewählt. Mit einem Abstand von 1 mm unterhalb der Referenzfläche wurde als interessierendes Volumen (VOI, 100 Schichten) ein 1,8 mm dicker Bereich ausgewählt. Die resultierenden Graustufenbilder hatten eine Pixelgröße von 17,76 μm von der Knochenrekonstruktion (65 kV, 385 μA). Ein halbautomatisches Konturierungsverfahren wurde verwendet, um Trabekel aus kortikalem Knochen auszuwählen. Direkte 3D-Messmethoden wurden verwendet, um den Prozentsatz des Knochenvolumens (BV/TV), die Knochenoberflächendichte (BS/TV), die Trabekeltrennung (Tb. Sp), die Trabekelzahl (Tb. N), die Trabekeldicke (Tb. Th) zu bestimmen. , Strukturmodellindex (SMI), Trabekelmusterfaktor (Tb. Pd) und mittlere Knochenmineraldichte (mittlere BMD) für denselben VOI unter Verwendung vonCTAnalyseprogramm (Bruker, Deutschland). Die 3D-Visualisierung des VOI unter Verwendung eines adaptiven Rendering-Algorithmus wurde mit der CTvol-Software (Bruker, Deutschland) durchgeführt.
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2.9. Knochenhistomorphometrie
Die ausgewählten rechten Femora (n=3/Gruppe) wurden in universellem Gewebefixativ fixiert und dann 3 Wochen lang in einer Lösung aus 10 % EDTA-2Na entkalkt. Die entkalkten Proben wurden gewaschen, mit Gradienten-Ethanol dehydriert, in Paraffinwachs eingebettet und in Längsschnitte von 5 &mgr;m geschnitten. Die Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (HE) gefärbt. Die Längsschnitte der Femora wurden fotografiert. Die Knochengewebestrukturen jeder Gruppe, insbesondere die trabekulären Knochenstrukturen, wurden beobachtet.
2.10. Biomechanischer Test
Die zufällig ausgewählten rechten Schienbeine (n=4/Gruppe) wurden für den Dreipunkt-Biegetest mit einer Universalprüfmaschine (SHIMADZU, Japan) bewertet. Die Durchmesser dieser Proben wurden mit einem Messschieber im Bereich von 2,16-2,38 mm (d) gemessen. Die Probe wurde dann auf zwei tragende Querstangen mit einem Abstand von 25 mm (L) zwischen den beiden Schienen gelegt und die physiologische Krümmung der Probe war nach oben gerichtet. Der Belastungsstab der Last befand sich in der Mitte der Probe und fiel mit einer konstanten Geschwindigkeit von 1,5 mm/min, bis die Probe brach. Die Kraft- (F) und Verschiebungsdaten wurden automatisch in einem Computer aufgezeichnet, der an die Testmaschine angeschlossen war, und gleichzeitig wurde die Last-Verformungs-Kurve aufgetragen. Gleichzeitig wurden die Werte der maximalen Belastung (N) und der Energieaufnahme (mJ) von der Materialprüfsoftware TRAPEZIUM X aufgezeichnet. Die Werte der maximalen Spannung (MPa) wurden nach folgender Formel berechnet: Spannung (σ)=Biegemoment (M) / Querschnittsfaktor (Z)=(8×L×F) / ( π×d3 )
2.11. statistische Analyse
Die Ergebnisse der Modellgruppen wurden mit der Scheingruppe verglichen, und die der medikamentös behandelten Gruppen wurden mit der OVX plus D-Gruppe verglichen. Die Daten wurden mit einfacher ANOVA analysiert, gefolgt von Bonferronis multiplem Vergleichstest unter Verwendung der Software Graph Pad Prism 5.0. Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt, und P-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.
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