Teil 2: Dereplikationsgeführte Isolierung neuer Phenylpropanoid-substituierter Diglycoside aus Cistanche-Salsa und ihre inhibitorische Aktivität auf die NO-Produktion in Makrophagen
Mar 04, 2022
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Eine 3--Methylbutenylgruppe, eine Aglycon-Substruktur, wurde durch die COSY-Korrelationen von H-2 mit H-1a und H-1b und die HMBC-Korrelationen zwischen H{{ 4}} und H-5 und die olefinischen Kohlenstoffe bei kC 120,7 (C-2) und 136,4 (C-3). Zwei Zuckereinheiten wurden durch NMR-Spektrenanalyse und HPLC-Spektrenanalyse des Säurehydrolysats mit MS-Fragmentmuster festgestellt. Ihre absolute Konfiguration wurde mittels HPLC-Analyse des Säurehydrolysats als D-Glucose und L-Rhamnose bestimmt [17]. Diese Zuckereinheiten wurden durch Kopplungskonstanten der anomeren Protonen als a-Glucose und a-Rhamnose definiert. Das 1H-1H COSY-Spektrum zeigte sequentielle Korrelationen von H-13 zu H-63 und von H-133 zu H-633 (Abbildung 4).
Ein nach unten verschobenes Glucoseproton bei kH 4,70 (H-43) deutete auf einen Acylsubstituenten an Glucose hin. Aus dem HMBC-Spektrum bestätigte die Korrelation zwischen H-43 und C-9333 die Position des Caffeoyl-Substituenten. Die HMBC-Korrelationen zwischen H-13 und C-1 (kC 64,5) und zwischen H-33 (kH 3,68) und C-133 (kC 101,2) legten die Positionen der einzelnen Substituenten nahe . Dementsprechend wurde die Struktur von 6 als 3-Methylbutenyl-O- -L-Rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-Caffeoyl- -D- Glucose-Pyranosid und genannt Cistansalsid B.
Für Cistansalsid C (12), ein braunes amorphes Pulver, wurde durch ( plus )-HR-ESI-QTOF-MS bestimmt, dass es die Summenformel C26H38O13 hat, die einen Peak bei m/z 581,2213 [M plus Na] plus (ber für C26H38O13Na, 581.2205). Ein charakteristisches Ion bei m/z 163 legte nahe, dass ein Caffeoyl-Substituent in der Struktur existierte. Die Fragment-Ionen bei m/z 325 und m/z 471 legten die Existenz einer Rhamnose-Einheit und einer Glucose-Einheit nahe.
Ein Vergleich der NMR-Spektren von 12 mit denen von 6 zeigte, dass sie bis auf die Aglyconstruktur ähnlich waren. In den NMR-Spektren von 12 wurden zwei paraffinische Kohlenstoffe bei kC 38.0 (C-2) und 24.4 (C-3) anstelle von zwei olefinischen Kohlenstoffen bei kC 12{{16) beobachtet }}.7 (C-2) und 136.4 (C-3) im Aglycon von 6. Die Keimmethylgruppen (kH 0.88) im Aglycon von 12 waren nach oben verschoben relativ zu H-4 und H-5 (kH 1.71 und 1.63) im Aglykon von 6 (Tabelle 2). Es wurde vorgeschlagen, dass das Aglycon von 12 eine 3--Methylbutylgruppe ist, was durch die 1H- und COSY-NMR-Spektren bestätigt wurde. Peaks der 3-Methylbutylgruppe wurden bei a 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) und 0,88 (H-4, 5).
Zwei Zuckereinheiten wurden durch die HPLC-Analyse des Säurehydrolysats und die NMR-Spektrenanalyse sowie das MS-Fragmentmuster bestätigt. Die absoluten Konfigurationen der Zucker wurden mittels HPLC-Analyse des Säurehydrolysats als D-Glucose und L-Rhamnose identifiziert [17]. Eine a-Glucose-Einheit und eine a-Rhamnose-Einheit wurden durch Kopplungskonstanten der anomeren Protonen bestätigt. Das 1H-1H COSY-Spektrum zeigte sequentielle Korrelationen von H-13 bis H-53, von H-133 bis H-333 und von H{{11} } zu H-433 (Abbildung 4).
Die Stellung der Substituenten wurde mittels HMBC-Analyse bestätigt. Im HMBC-Spektrum die Korrelationen zwischen H-13 und C-1 (kC 67,2), zwischen H-33 (kH 3,68) und C-133 (kC 101,2) und dazwischen H-43 (kH 4,70) und C-9333 (kC 165,7) wurden nachgewiesen. Folglich wurde die Struktur von 12 als 3-Methylbutyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranosid bestimmt und mit dem Namen Cistansalsid C.
Für Cistansalsid D (17), ein amorphes braunes Pulver, wurde durch hochauflösendes ESI-QTOF-MS im positiven Modus bestimmt, dass es die Summenformel C31H38O14 hat, die einen Adduktionenpeak bei m/z 657,2147 [M plus Na] plus zeigte (berechnet für C31H38O14Na, 657,2154). Fragment-Ionen, darunter ein [M plus H x Aglycon x Rha x Acetyl Glc] plus Ion bei m/z 147, ein [M plus H x Aglycon x Rha] plus Ion bei m/z 351 und ein [M plus H x Aglycon] Plus-Ionen bei m/z 497 wurden ebenfalls nachgewiesen. Ein charakteristisches Ion bei m/z 147 legte nahe, dass ein Cumaroyl-Substituent in seiner Struktur vorhanden war. Die Fragment-Ionen bei m/z 351 und m/z 497 legten die Existenz einer Rhamnose-Einheit und einer Acetyl-substituierten Glucose-Einheit nahe.
Cistansalside ausCistanche-Kraut
Das 13C-NMR-Spektrum zeigte das Vorhandensein von 31 Kohlenstoffatomen. In den 1H- und HSQC-Spektren wurden zwei anomere Protonen bei kH 4,61 (1H, m, H-13) und 4,60 (1H, s, H{{10}}) beobachtet . Das 1H-NMR-Spektrum zeigte das Vorhandensein einer Methylgruppe bei 1,97 (3H, s, Acetyl-CH3), eines trans-Olefins bei kH 7,55 (1H, d, J=15,9 Hz, H{{ 25}}) und 6,34 (1H, d, J=15,9 Hz, H-8333) und zwei para-substituierte Benzolringe bei kH 7,53 (2H, d, J=6). 9 Hz, H-3333, 5333) und 6,79 (2H, d, J=6,9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, d, J {{5 0}},0 Hz, H-2, 6) und 6,65 (2H, d, J=8,0 Hz, H-3, 5) (Tabelle 2) . Aus dem HMBC-NMR-Spektrum sind die Korrelationen zwischen einem Carbonylkohlenstoff bei kc 165,5 (C-9333) und H-8333 und zwischen H-2333, 6333, und C-7333 (kc 145.4) schlug eine (E)-Cumaroylgruppe vor. Die HMBC-Korrelation zwischen einem Methylprotonenpeak und einem Carbonylkohlenstoff bei kc 169,0 bestätigte das Vorhandensein einer Acetylgruppe.
Eine 4--Hydroxyphenylgruppe wurde basierend auf den HMBC-Korrelationen zwischen H-3, 5 und quartären aromatischen Kohlenstoffen bei kC 155,6 (C-4) und 128,6 (C-1) vorgeschlagen. . Eine hydroxylierte Ethylgruppe wurde durch die COSY-NMR-Signale bei kH 2,66 (2H, t, J=6,1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a) bestätigt ) und 3,54 (1H, m, H-8b). Die HMBC-Korrelationen zwischen H-7 und C-1 (kC 128,6) und C-2, 6 (kC 129,7) legten eine 4--Hydroxyphenylethylgruppe als Aglycon-Unterstruktur nahe.
Zwei Zuckerreste, die aus dem MS-Fragmentmuster vorgeschlagen wurden, wurden durch die HPLC-Analyse des Säurehydrolysats und die NMR-Spektren erneut bestätigt. D-Glucose und L-Rhamnose wurden mittels HPLC-Analyse des Säurehydrolysats aufgeklärt [17]. Eine -Glucose-Einheit und eine a-Rhamnose-Einheit wurden durch Kopplungskonstanten der anomeren Protonen etabliert. Das 1H-1H COSY-Spektrum zeigte sequentielle Korrelationen von H-13 zu H-53 und von H-133 zu H-633 (Abbildung 4).
Aus dem 1H-NMR-Spektrum deutete die Tieffeldverschiebung von H-23 (kH 4,69) und H-43 (kH 4,80) auf die Acyl-substituierte Position an Glucose hin. Die Verbindungen zwischen Glucose und zwei Acylgruppen wurden durch die HMBC-Korrelationen zwischen H-43 (kH 4,80) und C-9333 und zwischen H-23 und dem Carbonylkohlenstoff einer Acetylgruppe (kC 169,0) bestätigt ). Die Positionen eines Aglykons und einer Rhamnose wurden durch die HMBC-Korrelationen zwischen H-33 (kH 3,95) und C-1333 und zwischen H-8 und C-13 angegeben. Dementsprechend wurde die Struktur von 17 als 4-Hydroxyphenylethyl-2-O-acetyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- Cumaroyl- -D-Glucopyranosid und Cistansalsid D genannt.
Cistansalsid E (18) wurde als amorphes braunes Pulver isoliert. Seine Molekularformel wurde durch 13C-NMR-Daten und den hochauflösenden ESI-QTOF-MS-Peak im positiven Modus bei m/z 657,2166 [M plus Na] plus (berechnet für C31H38O14Na, 657,2154) als C31H38O14 bestimmt. Zusätzlich wurden auch Fragmentionen einschließlich eines Caffeoyl-Ions bei m/z 163, eines [M plus H x Aglycon x Rha] plus-Ions bei m/z 367 und eines [M plus H x Aglycon]-Ions bei m/z 513 nachgewiesen. Die Fragment-Ionen legten die Existenz einer Rhamnose-Einheit und einer Acetyl-substituierten Glucose-Einheit nahe.
Das 1H-NMR-Spektrum deutete auf die Anwesenheit von zwei anomeren Protonen bei kH 4,63 (1H, d, J=8,2 Hz, H-13) und 4,60 (1H, s, H-133) hin. ) und zwei Acyl-substituierte Glucoseprotonen bei kH 4,71 (1H, dd, J=8,9, 8,2 Hz, H-23) und 4,81 (1H, dd, J=9,7 , 9,5 Hz, H-43). Die 1H- und HMBC-Spektren deuteten auf die Existenz einer Acetylgruppe bei kH 1,94 (3H, s, Acetyl-CH3), einer (E)-Caffeoyl-Einheit bei kH 7,48 (1H, d, J=15,9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1,6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8,1, 1,6 Hz, H-6333), 6.76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) und 6.21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) und einem monosubstituierten Benzolring bei kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) und 7,20 (1H, m, H-4) (Tabelle 2). Eine Phenylmethylgruppe, eine Aglycon-Substruktur, wurde durch die HMBC-Korrelationen zwischen H-7 (2H, kH 2,80, m) und C-1 (kC 138,8) sowie zwischen H-7 und C nahegelegt -2, 6 (kC 128,9) und die COSY-NMR-Signale von H-7 mit H-8a (1H, kH 3,99, m) und H-8b (1H, kH 3,63, m).
Zwei Zuckereinheiten wurden durch die HPLC-Analyse des Säurehydrolysats und die NMR-Spektrenanalyse bestätigt. Die absoluten Konfigurationen der Zucker wurden durch HPLC-Analyse des Säurehydrolysats aufgeklärt, das als D-Glucose und L-Rhamnose bestätigt wurde [17]. Eine -Glucose-Gruppierung und eine -Rhamnose-Gruppierung wurden durch Kopplungskonstanten der anomeren Protonen etabliert. Das 1H-1H COSY-Spektrum zeigte sequentielle Korrelationen von H-13 bis H-53, von H-133 bis H-233 und von H{{11} } zu H-333 (Abbildung 4).
Aus dem HMBC-Spektrum sind die Korrelationen zwischen H{{0}} und C-8 (kC 69,4), zwischen H-23 und Carbonylkohlenstoff einer Acetylgruppe (kC 169,1), zwischen H-33 (kH 3,95) und C-133 (kC 102,0) und zwischen H-43 (kH 4,81) und C-9333 (kC 165,6) bestätigten die Position der Substituenten in die Struktur. Daher wurde die Struktur von 18 als Phenylethyl-2-O-acetyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranosid und bestimmt mit dem Namen Cistansalsid E.
Die meisten der trans-Cinnamoyl-Substituenten wurden in vitro zur cis-Isoform isomerisiert. Es wurde berichtet, dass Licht trans-Zimtsäurederivate in cis-Isoformen umwandelt [18,19]. Es wurde beobachtet, dass das Gleichgewicht der trans-cis-Umwandlung der Cinnamoyl-Substituenten etwa 70 % der Isolate in der trans-Isoform beibehielt. Für die Olefinprotonen der cis-Form Peaks bei ungefähr 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) und 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) waren in den 1H-NMR-Spektren zuordenbar, während Peaks bei etwa 7,55 ppm (d, J=15,8 Hz, H-7333) und 6,40 ppm (d, J { {28}},8 Hz, H-8333) wurden für die Transformation [20] beobachtet. Im 1H-NMR-Spektrum von trans-cis-Mischungen wurden Peaks für zwei olefinische Protonen (H-7333 und H-8333) im Verhältnis 7:3 (trans:cis) beobachtet. 13C-NMR-Peaks der cis-Form waren denen der Transformation ähnlich.
Wirksame Inhaltsstoffe von Cistanche: Akteoside
Alle Isolate wurden auf ihre inhibitorischen Wirkungen auf die LPS-induzierte NO-Produktion in RAW getestet
Alle Isolate wurden auf ihre inhibitorischen Wirkungen auf die LPS-induzierte NO-Produktion in RAW 264.7-Zellen getestet. Dexamethason wurde als positive Kontrolle verwendet und sein IC50 betrug 7,0 uM. Von den getesteten Verbindungen sind die Verbindungen 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4,0 uM) und 18 (IC50 27,9 o 0,8 uM) zeigten moderate inhibitorische Aktivitäten auf die induzierbare NO-Synthase, während die anderen Verbindungen in diesem Assay inaktiv waren (IC50 Werte > 100 µM). Um zu verifizieren, ob diese Verbindungen Zytotoxizität aufwiesen, wurde die Zelllebensfähigkeit unter Verwendung eines MTT-Assays gemessen. Als Ergebnis zeigte keiner von ihnen eine signifikante Zytotoxizität (ergänzende Abbildung S6-1). Diese vier Verbindungen wurden ausgewählt, um ihre inhibitorische Aktivität gegen den NF-&lgr;B-Weg in LPS-stimulierten RAW 264.7-Zellen zu bewerten. Die Stimulation von RAW 264.7-Zellen mit LPS induzierte die Phosphorylierung von I&bgr;B und NF-&bgr;B (p65) nach 0,5 h Inkubation. Die Phosphorylierung von NF-&bgr;B (p65) wurde durch die Vorbehandlung mit den Verbindungen 11, 13 und 18 signifikant verringert, wie durch Western-Blot-Analyse gezeigt wurde ( 5 ). Daher könnten die Verbindungen 11, 13 und 18 über die Hemmung von NF-&bgr;B in Makrophagen entzündungshemmende Wirkungen ausüben.
Abbildung 5.Wirkung von vier Verbindungen auf die Phosphorylierung von I&bgr;B und NF-&bgr;B (p65) in LPS-stimulierten RAW 264.7-Zellen. (A) Die Western Blots wurden in LPS und probenbehandelten RAW 264.7-Zellen durchgeführt; (B, C) Die Immunoblot-Signale wurden unter Verwendung von Molecular Analyst/PC-Densitometrie-Software (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) quantifiziert. Es wird über die densitometrische Analyse von phosphorylierten Isoformen berichtet. NF-&bgr;B in RAW 264.7-Zellen wurde auf den Gehalt an &bgr;-Aktin normalisiert.
3. Materialien u Methoden
3.1. Allgemeines Experiment Verfahren
Optische Drehungen wurden mit einem Jasco P-2000-Digitalpolarimeter (Jasco, Tokyo, Japan) gemessen. UV-Spektren wurden auf einem Chirascan plus Circular Dichroism-Spektrometer (Chirascan, APL, UK) aufgezeichnet. IR-Spektren wurden mit einem Jasco FT/IR-4200-Spektrophotometer aufgezeichnet. Hochauflösende Elektrospray-Ionisations-Quadrupol-Flugzeit-Massenspektrometrie (HR-ESI-qTOF-MS) wurde auf einem Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS durchgeführt, das mit Agilent 1260 Infinity-Serie (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), und die verwendete Säule war eine Jasco SFCpak Crest C18T-5-Säule (ID 150 4,6 mm, 5 um). MassHunter Workstation Software wurde für die Datenerfassung verwendet.
1D (1H und 13C) und 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) NMR-Spektren wurden mit einem Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japan), Bruker AVANCE-400, Bruker erhalten Spektrometer AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 und Bruker AVANCE 800 HD gekoppelt mit einer Kryosonde (Bruker, Ettlingen, Deutschland). DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA) wurde als NMR-Lösungsmittel und Referenzpeaks (kH 2,50 und kC 39,5) verwendet. Säulenchromatographie (CC) wurde mit Sephadex LH-20 (25–100 μm; Pharmacia, Uppsala, Schweden) oder Kieselgel 60 Kieselgel (40–63 μm, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt) durchgeführt , Deutschland). Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde auf vorbeschichteten Kieselgel 60 Kieselgel F254 Platten (Art. 5715; Merck) durchgeführt. Flecken auf TLC wurden unter Verwendung einer UV-Lampe bei 254 nm und 365 nm nachgewiesen (VL-4.LC, 365/254; Vilber Lourmat, Torcy, Frankreich). Mitteldruckflüssigkeitschromatographie (MPLC) wurde auf einer RediSep 120 g Silica Flash-Säule (Isco, Lincoln, NE, USA) und Kiesegel 60 Silicagel (40–63 μm, 230–400 Mesh, Art. 9385; Merck) unter Verwendung von a Combiflash Companion (Isco). Das Hochdruckflüssigkeitschromatographie(HPLC)-System war ein Gilson HPLC, ausgestattet mit einer Gilson 321-Pumpe und einem UV.VIS 151-Detektor (Gilson, Middleton, WI, USA), unter Verwendung von halbpräparativen ODS-Säulen (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Deutschland; Inno C18 Spalte 120 Å, id 250: 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Korea). Das analytische RP-HPLC-System war ein Waters 2695 Alliance-System mit einem 996 Photodiode Array (PDA)-Detektor (Waters Corp, Milford, MA, USA), und die verwendete Säule war eine Hypersil™ BDS C18-Säule (130 Å, id 150: 4,6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). Ameisensäure wurde von Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Seoul, Korea) bezogen. Lösungsmittel mit HPLC-Qualität wurden von Fisher Scientific Korea Ltd. (Seoul, Korea) bezogen. H2SO4, Na2CO3 und erstklassige Lösungsmittel für die Extraktion, Fraktionierung und Isolierung wurden von Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Seoul, Korea) bezogen. L- und D-Cysteinmethylesterhydrochlorid und o-Tolylisothiocyanat wurden von Tokyo Chemical Industry (Tokio, Japan) bezogen.
3.2. Anlage Material
Die ganzen Pflanzen vonCistanche-Salsa, die von den Shinjang-Uiguren gesammelt wurden, wurden über die Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Korea) importiert. Sie wurden von Prof. Dr. Jehyun Lee (Dongguk University, Seoul, Korea) identifiziert. Das Belegexemplar (SNUPH2016-03) wurde im Herbarium of Medicinal Plant Garden, College of Pharmacy, Seoul National University hinterlegt.
3.3. Extraktion u Isolation
Die getrockneten ganzen Pflanzen vonCistanche-Salsa(5,7 kg) wurden zerkleinert und dreimal mit MeOH (2 0 L) bei Raumtemperatur mit Beschallung für 99 min extrahiert. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rohextrakt (1,35 kg) in H 2 O (5 l) suspendiert und dann mit EtOAc (5 l) aufgetrennt. Der EtOAc-Rückstand (55,3 g) wurde in 16 Fraktionen (E01-16) durch Kieselgelchromatographie unter Elution mit CHCl3/MeOH (50:1–0:1, Stufengradientensystem) getrennt.
E08 (611,7 mg) wurde einer Kieselgel-Mitteldruckflüssigkeitschromatographie (25 g) unterzogen und mit CHCl3/MeOH (18:1–0:1, Stufengradientensystem) und eluiert ergab 11 Fraktionen (E08a-k). Aus E08g wurden die Verbindungen 13 (0,7 mg) und 18 (0,6 mg) unter Verwendung einer Luna-5-um-HPLC-Säule und isokratischer Elution mit 28-prozentiger wässr. MeCN. HPLC-Reinigung (Hypersil GOLD, 25 Prozent aq. MeCN) von E08h (138,5 mg) lieferte die Verbindungen 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) und 17 (4,9 mg).
E09 (1,15 g) wurde weiter auf einer Kieselgel-MPLC-Säule (20 g) unter Elution mit CHCl3/MeOH (10:1–0:1, Schritt- Gradientensystem), um 11 Unterfraktionen (E09a-k) zu ergeben. E09e (398,7 mg) wurde Sephadex LH-20 (MeOH) ausgesetzt und ergab acht Unterfraktionen (E09e1-8). E09e6 wurde anschließend unter Verwendung einer Hypersil GOLD HPLC-Säule (22 % aq. MeCN) gereinigt, um Verbindung 11 (0,4 mg) zu ergeben. Aus E09e7 wurde Verbindung 5 (0,6 mg) durch isokratische Elution von einer Luna 5 &mgr;m HPLC-Säule mit 40-prozentiger wässriger Lösung gereinigt. MeOH.
E10 (1,20 g) wurde in neun Fraktionen (E10ai) auf einer Sephadex LH-20-Säule getrennt, wobei mit MeOH eluiert wurde. Aus E10g (147,5 mg) wurden die Verbindungen 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) und 15 (5,0 mg) durch HPLC-Trennung isoliert (Inno, 23 % aq. MeCN). Die Fraktion E10h (470,0 mg) wurde auf einer Hypersil GOLD-Säule durch isokratische Elution (40 % aq. MeOH) gereinigt, um die Verbindungen 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) und 16 (3,0 mg) zu ergeben.
E11 (2,96 g) wurde Sephadex LH-20 unterzogen, wobei mit MeOH eluiert wurde, um neun Fraktionen (E11a-i) zu ergeben. E11e wurde durch Sep-Pak C18-Kartusche getrennt, wobei schrittweise mit 10 Prozent, 20 Prozent, 30 Prozent, 50 Prozent und 100 Prozent wässrig eluiert wurde. MeOH, um sieben Fraktionen (E11e1-7) zu ergeben, gefolgt von Luna 5 um HPLC (28 Prozent aq. MeCN), um die Verbindungen 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) und 12 (1,2 mg) zu ergeben.
E12 (19,0 g) wurde einer Kieselgel-MPLC (120 g) unter Verwendung eines CHCl3/MeOH-Stufengradientensystems unterzogen, um sechs Fraktionen (18:1–0:1) zu ergeben , E12a-f). E12f wurde auf einer Sephadex LH-20-Säule (MeOH) chromatographiert, was sieben Fraktionen (E12f1-7) ergab. HPLC-Reinigung (Hypersil GOLD, 25 % aq. MeCN) von E12f7 lieferte Verbindung 2 (3,3 mg). Alle für die HPLC verwendeten Lösungsmittel waren 0,05 % Ameisensäurepuffer. Die übliche Flussrate für die HPLC- und MPLC-Chromatographie betrug 3 bzw. 40 ml/min.
3.4.Charakterisierung
Cistansalsid A (5): braunes amorphes Pulver; [ |20 x 33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (rein) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; 1 H-NMR- (800 MHz) und 13 C-NMR- (200 MHz) Daten, siehe Tabelle 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (berechnet für C30H38O14Na, 645,2154).
Cistansalsid B (6): braunes amorphes Pulver; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (rein) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1; 1 H-NMR (500 MHz) und 13 C-NMR (125 MHz) Daten, siehe Tabelle 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (berechnet für C26H36O13Na, 579,2048).
Cistansalsid C (12): braunes amorphes Pulver; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (rein) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; 1 H-NMR (800 MHz) und 13 C-NMR (200 MHz) Daten, siehe Tabelle 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (berechnet für C26H38O13Na, 581,2205).
Cistansalsid D (17): braunes amorphes Pulver; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (rein) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; 1 H-NMR- (400 MHz) und 13 C-NMR- (75 MHz) Daten, siehe Tabelle 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (berechnet für C31H38O14Na, 657,2154).
Cistansalsid E (18): braunes amorphes Pulver; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (rein) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; 1 H-NMR- (800 MHz) und 13 C-NMR- (200 MHz) Daten, siehe Tabelle 2; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (berechnet für C31H38O14Na, 657,2154)
3.5.HPLC-QTOF-MS Analyse
Die chromatographische Massenspektrometrieanalyse wurde auf einem Agilent 1260 Infinity series LC-System (Agilent Technologies, Inc., USA) durchgeführt. Die analytische Säule war eine SFCpak Crest C18T-5-Säule (id 15{{10}}: 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japan). Die mobile Phase bestand aus 0,1 Prozent (v/v) Ameisensäure in MeCN (A) und Wasser (B) unter Verwendung einer Gradientenelution von 0–35 min (23 % A), 35–45 min ( 23–28 % A), 45–75 min (28 % A) und 75–80 min (90 % A). Die Flussrate wurde bei 0,3 ml/min gehalten. Die Extinktion wurde bei 320 nm gemessen. Die Bedingungen der ESI-Quelle waren wie folgt: Strömungsgeschwindigkeit des Trocknungsgases (N2), 10 l/min; Trocknungsgastemperatur, 350 Grad; Zerstäuber, 30 psig; Sheathgas-Flussrate 12,0 l/min; Mantelgastemperatur, 350 Grad; Kapillare, 4000 V; Skimmer, 60 V; Oktapol RF, 750 V; Splitterspannung 180 V; positiver Modus. Das System wurde unter Masshunter Workstation Software betrieben. Der Massenbereich wurde auf m/z 50–1000 eingestellt.
3.6.Säure Hydrolyse
Die Verbindungen wurden unter Verwendung von 1 N H2SO4 (100 μl) hydrolysiert, mit einem Wasserbad bei 90 Grad für 2 h erhitzt, dann mit gesättigter wässriger Na2CO3-Lösung neutralisiert. Nachdem die Lösungen unter einem Stickstoffstrom getrocknet worden waren, wurden die Produkte und Standardzucker (D-Glc, L-Glc, L-Rha) in Pyridin (100 ul) gelöst, das L-Cysteinmethylesterhydrochlorid (0,5 mg) enthielt. Eine L-Rhamnose-Probe wurde in Pyridin (100 ul) gelöst, das D-Cysteinmethylesterhydrochlorid (0,5 mg) enthielt. Danach wurden sie 1 h auf 60 Grad erhitzt. Die Lösungen wurden mit 1 &mgr;l (1,11 mg) o-Tolylisothiocyanat behandelt, die erneut 1 h auf 60 Grad erhitzt wurden. Jede endgültige Mischung wurde direkt durch analytische RP-HPLC (Hypersil™ BDS C18-Säule, 17 % aq. MeCN, 0,8 ml/min, 40 min, 35 Grad) analysiert. Das tR des Peaks bei 21,9 und 40,4 min stimmte mit dem des Thiocarbamoyl-Thiazolidin-Derivats von D-Glucose bzw. L-Rhamnose überein.
3.7. Zelle Kultur
Murine Makrophagen, RAW 264.7, wurden vom Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Korea) erhalten und in RPMI-Medium gezüchtet, das 10 % fötales Rinderserum und 100 U/ml Penicillin/Streptomycinsulfat enthielt. Die Zellen wurden in einer befeuchteten 5-prozentigen CO2-Atmosphäre bei 37 Grad inkubiert.
3.8.Drogen und Chemikalien
RPMI, Penicillin und Streptomycin wurden von HyClone (Logan, UT, USA) gekauft. Rinderserumalbumin und LPS wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) gekauft.
3.9.Messung der NO-Produktion
Als Indikator für die NO-Produktion wurde die Nitritkonzentration im Kulturmedium nach der Griess-Reaktion gemessen. Die Zellen wurden mit 2:105 Zellen/Well in 96-Well-Kulturplatten ausgesät. Nach Vorinkubation der RAW 264.7-Zellen für 18 h wurden die Zellen mit Verbindungen (5 0 uM, 10 uM, 5 uM oder 1 uM) vorbehandelt und mit LPS (500 ng/ml) für 24 stimuliert h. Testverbindungen gelöst in DMSO. Die Zellen wurden auch mit 0,05 Prozent DMSO als Vehikelkontrolle behandelt. RAW 264.7-Zellen (2: 105 Zellen/Vertiefung) wurden in Platten mit 96- Vertiefungen unter Verwendung von RPMI ohne Phenolrot kultiviert und 0,5 h mit Proben vorbehandelt. Die zelluläre NO-Produktion wurde durch die Zugabe von 500 ng/ml Endkonzentration LPS und eine 24-stündige Inkubation induziert. Nach der Inkubation wurden 100 ul konditioniertes Medium mit dem gleichen Volumen an Griess-Reagenz gemischt und 15 Minuten lang inkubiert. Die Extinktion der Mischung bei 540 nm wurde mit einem ELISA-Mikroplattenlesegerät (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA) gemessen. Die erhaltenen Werte wurden mit denen von Standardkonzentrationen von in RPMI gelöstem Natriumnitrit verglichen, und die Konzentrationen von Nitrit in den konditionierten Medien von mit Proben behandelten Zellen wurden berechnet.
3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay für die Zelllebensfähigkeit
Die Zellen wurden in Platten mit {{0}} Vertiefungen in einer Dichte von 5: 104 Zellen/Vertiefung ausgesät und mit serumfreiem Medium in Gegenwart von Proben inkubiert. Testverbindungen gelöst in DMSO. Die Zellen wurden auch mit 0,05 Prozent DMSO als Vehikelkontrolle behandelt. Nach 24-stündiger Inkubation wurden 10 ul MTT (5 mg/ml in Kochsalzlösung) zugegeben und die Inkubation weitere 4 h fortgesetzt. Mitochondriale Succinat-Dehydrogenase in lebenden Zellen wandelt MTT während der Inkubation in sichtbare Formazan-Kristalle um. Die Formazan-Kristalle wurden dann in Dimethylsulfoxid solubilisiert, und die Extinktion wurde bei 540 nm unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA)-Mikroplattenlesegeräts (Benchmark, Bio-Rad Laboratories) gemessen. Die relative Zelllebensfähigkeit wurde im Vergleich zur Extinktion der unbehandelten Kontrollgruppe berechnet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.
3.11.Immunoblot-Analyse
Die Proteinexpression wurde durch Western-Blotting gemäß Standardverfahren bewertet. Kurz gesagt, RAW264.7-Zellen wurden in 6{{20}}-mm-Kulturschalen (2: 106/ml) kultiviert, gefolgt von einer Vorbehandlung mit 50 µM der Verbindungen . Die Zellen wurden zweimal in eiskaltem PBS (pH 7,4) gewaschen, die Zellpellets wurden in Lysepuffer auf Eis für 15 min resuspendiert und die Zelltrümmer wurden dann durch Zentrifugation entfernt. Die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Bio-Rad Protein-Assay-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Protein (20–30 ug) wurde 1:1 mit 2:Probenpuffer (20 % Glycerin, 4 % SDS, 10 % 2-) gemischt. ME, 0,05 % Bromphenolblau und 1,25 M Tris [pH 6,8]), auf 8 oder 15 % SDS-PAGE-Gele geladen und 90 min bei 150 V laufen gelassen. Zellproteine wurden auf Immunoblot-Polyvinylidendifluorid-Membranen (Bio-Rad) unter Verwendung eines halbtrockenen Bio-Rad-Transfersystems gemäß den Anweisungen des Herstellers transferiert. Die Membranen wurden dann über Nacht mit den jeweiligen primären p-NF-&bgr;B-, NF-&bgr;B-, pI&bgr;B- und -Aktin-Primärantikörpern (Abcam, Cambridge, UK) in Tris-gepufferter Salzlösung, die 5 % Magermilch und 0,1 % Tween enthielt, inkubiert 20. Am folgenden Tag wurden die Blots dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (0,1 % Tween 20) gewaschen und für 1 h mit einem HRP-konjugierten sekundären Anti-IgG-Antikörper (1:2000–1 verdünnt) inkubiert :20.000). Die Blots wurden erneut dreimal mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung (0,1 Prozent Tween 20) gewaschen und immunreaktive Banden wurden unter Verwendung des chemilumineszenten Substrats ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA) entwickelt.
3.12.Statistische Analyse
Experimentelle Daten werden als Mittelwert SEM dargestellt. Das Niveau der statistischen Signifikanz wurde durch Varianzanalyse (ANOVA) bestimmt, gefolgt von Dunnetts t-Test für multiple Vergleiche.p Werte kleiner als 0,05 wurden als signifikant betrachtet.
Cistanche-Salsa-Extrakt
4. Schlussfolgerungen
In dieser Studie isolierten und klärten wir die Strukturen von fünf neuen Phenylpropanoid-substituierten Glykosiden, genannt Cistansalsid AE (5, 6, 12, 17 und 18), zusätzlich zur Isolierung und Identifizierung von 13 bekannten Verbindungen unter Verwendung einer Dereplikationsstrategie. Die bekannten Verbindungen wurden als Lipedosid AI (1) [21], 23-Acetylacteosid (2) [22], Isocistanosid C (3) [15], Osmanthusid B (4) [21], Epimeridinosid A ( 7) [15], Cistanosid D (8) [23], Salsasid B (9) [6], Tubulosid E (10) [16], Cistanosid M (11) [15], Isomartynosid (13) [24], Salsasid C (14) [6], Jionosid C (15) [25] und Salsasid F (16) [6]. Ihre Strukturen wurden durch die Analyse umfangreicher spektroskopischer Daten und durch Vergleich mit berichteten Daten in der Literatur ermittelt. Es wurde bestätigt, dass die vorläufig vorhergesagten Strukturen von Phenylpropanoid-substituierten Glycosiden korrekt mit ihren realen Strukturen übereinstimmten.
Nutzen von Cistanche-Salsa-Extrakt
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