Teil eins: DsbA-L interagiert mit VDAC1 bei der mitochondrienvermittelten tubulären Zellapoptose und trägt zum Fortschreiten einer akuten Nierenerkrankung bei

Zusammenfassung

1. Hintergrund

Wir haben gezeigt, dass das Disulfidbindungs-A-Oxidoreduktase-ähnliche Protein (DsbA-L) am Fortschreiten der Nierenfibrose beteiligt ist. Die genaue Funktion von DsbA-L bei akuter Nierenschädigung (AKI) und die beteiligten Mechanismen müssen jedoch noch geklärt werden.

2. Methoden

Wir veranschaulichen die Interaktion von DsbA-L mit VDAC1 durch Co-IP (Co-Immunpräzipitation) in vitro und Viv und fanden die Interaktionsteile davon durch Mutationsexperimente. Die oben genannten Ergebnisse wurden durch Co-Lokalisierung bestätigt. Darüber hinaus haben wir die beiden Modelle von PT-DsbA-L- und VDAC1-KO-Mäusen konstruiert, um die Funktion von DsbAL und VDAC1 in Modellen von VAN-, CL-, P- und I/R-induziertem AKI zu überprüfen.

3. Erkenntnisse

Die PT-DsbA-L-KO-Mäuse zeigten eine Verbesserung der I/R-, VAN- und CLP-induzierten AKI-Progression durch die Herunterregulierung von VDAC1. Schließlich bestätigten wir diese Veränderungen in Signalmolekülen durch die Untersuchung von HK-2-Zellen und Nierenbiopsien von Patienten mit ischämischer oder akuter interstitieller Nephritis (AIN)-induzierter AKI. Mechanistisch interagierte DsbA-L mit den Aminosäuren 9-13 und 22-27 von VDAC1 in den Mitochondrien von BUMPT-Zellen, um die Apoptose der Nierenzellen und eine Mitochondrienschädigung auszulösen.

4. Interpretation

Diese Arbeit legt nahe, dass DsbA-L, das sich in den proximalen Tubuluszellen befindet, das Fortschreiten von AKI vorantreibt, indem es die VDAC1-Spiegel direkt hochreguliert. Laufender Titel: Die Rolle von DsbA-L bei AKI.

5. Finanzierung

National Natural Science Foundation of China, ein Zuschuss vom Key Project of Hunan provincial science and technology innovation, Department of Science and Technology of Hunan Province Project of International Cooperation and Exchanges, Changsha Science and Technology Bureau project, Natural Science Foundation of Hunan Province, Fundamental Forschungsgelder für die Zentraluniversitäten der Central South University, Innovationsstiftung der Provinz Hunan für Postgraduierte der Wissenschafts- und Technologieabteilung der Provinz Hunan in China.

Schlüsselwörter

DsbA-L; VDAC_I; Bax; Cyt-c; AKI

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Einführung

Akute Nierenschädigung (AKI), eine verheerende klinische Komplikation mit hoher Morbiditäts- und Mortalitätsrate, betrifft Millionen von Patienten auf der ganzen Welt(1). AKI wird normalerweise durch Sepsis, nephrotoxische Substanzen und Ischämie-Reperfusionsschäden (Ischämie-Reperfusions-Verletzung, IRI) induziert (2). Bislang sind die molekularen Mechanismen, die AKI zugrunde liegen, noch nicht vollständig aufgeklärt. Folglich stehen für AKI keine wirksamen Behandlungsstrategien zur Verfügung.

Die Schädigung tubulärer Zellen ist seit Jahrzehnten als wichtiger Auslöser von AKI bekannt.3 Mit fortschreitender Forschung haben immer mehr Forscher herausgefunden, dass mitochondriale Schäden eine Schlüsselrolle bei der Schädigung tubulärer Zellen spielen und dass dieser anfängliche Schaden durch die Akkumulation von verursacht wird ROS, die Produktion von Zytokinen und Zelltod (einschließlich Nekrose und Apoptose); Zusammengenommen tragen diese Prozesse alle zur AKI bei.4-6 Obwohl sich eine wachsende Zahl von Forschungen auf die Mechanismen konzentriert, die der mitochondrialen Schädigung bei AKI zugrunde liegen,7- 12 muss der genaue Mechanismus, der für die mitochondriale Schädigung verantwortlich ist, noch identifiziert werden.

Disulfidbindung-A-Oxidoreduktase-ähnliches Protein (DsbAL) wurde erstmals als Mitochondrienprotein in Rattenleberzellen identifiziert.13 Frühere Studien haben gezeigt, dass DsbA-L durch Diät oder diabetische Nephropathie (DN) verursachte Fettleibigkeit, Entzündungen, Insulinresistenz usw. verhindert Nierenverletzung.14-18 Interessanterweise ergab unsere aktuelle Studie, dass DsbA-L eine durch eine einseitige Harnleiterobstruktion (UUO) verursachte Nierenfibrose verursacht. Die Rolle und der Mechanismus von tubulärem DsbA-L bei AKI sind jedoch noch völlig unbekannt.

In der vorliegenden Studie führte die proximale tubuläre Deletion von DsbA-L (PT-DsbA-L-KO) in einem Mausmodell zu einer deutlichen Abschwächung von I/R, zusammen mit Vancomycin (VAN) und Blinddarmligatur und -punktion (CLP). )-induziertes AKI. Konsistent vermittelte DsbA-L auch I/R-, VAN- und LPS-induzierte Apoptose in renalen proximalen tubulären Epithelzellen (BUMPT) der Maus. Interessanterweise fanden wir heraus, dass DsbA-L mit den Regionen 9-13 und 22 27 des spannungsabhängigen Anionenkanals 1 (VDAC1) interagierte, einem Schlüsselmitglied der VDAC-Proteinfamilie19 21; Diese Effekte wurden sowohl in in vivo als auch in vitro mitochondrialen Proben und menschlichen AKI-Proben beobachtet. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass PTVDAC1-KO auch die Apoptose von Nierenzellen sowohl in In-vitro- als auch in-vivo-Modellen von AKI verbessert. Gemeinsam haben wir gezeigt, dass DsbA-L mit VDAC1 bei der mitochondrienvermittelten Apoptose tubulärer Zellen interagiert und daher das Fortschreiten von AKI verursacht.

Cistanche tubulosa

Materialen und Methoden

1. Ethik-Erklärung

Die Studie wurde vom Prüfungsausschuss des Zweiten Xiangya-Krankenhauses der Volksrepublik China genehmigt (Nr. 2018065) ​​und für diese Studie wurden 18 Patienten rekrutiert. Alle Teilnehmer wurden vor der Aufnahme in die Studie mit schriftlicher Einverständniserklärung rekrutiert. Alle Tierversuche entsprachen den vom Animal Care Ethics Committee des Second Xiangya Hospital, Volksrepublik China, genehmigten Leitprinzipien (Nr. 2020310).

2. Antikörper und Reagenzien

Anti-COXIV (ab33985, RRID: AB_879754), VDAC1 (ab14734, RRID: AB_443084), and PGC-1a (ab191838, RRID: AB_2721267) antibodies were obtained from Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, UK). Anti-Caspase3 (9662, RRID: AB_331439) and cleavedcapase3 (9664, RRID: AB_2070042) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-Bax (50599-2-Ig, RRID: AB_2061561), Cyt-c (10993-1-AP, RRID: AB_2090467), NRF1 (12482- 1-AP, RRID: AB_2282876), GAPDH (60004-1-Ig, RRID: AB_2107436), and b-tubulin (10094-1-AP, RRID: AB_2210695) antibodies were obtained from Proteintech (Rosemont, IL, USA). The anti-DsbA-L antibody was provided by Dr. Feng Liu(14). All secondary antibodies (MitoTracker Green FM and MitoTracker Red CMXRos) were obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). The calcium ionophore was purchased from Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Antimycin A (>95 Prozent rein, ab141904) und ein Mitochondrien/Cytosol-Fraktionierungskit (ab65320) wurden von Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, UK) erworben. Die Zielsequenz für Maus-DsbAL wurde bereits beschrieben.22

3. Die Erstellung von AKI-Modellen durch ischämische Reperfusion, CLP und VAN

Männliche C57BL/6J-Mäuse (RRID: MGI:5657312) im Alter von 8-10 Wochen wurden von Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. gekauft. Mäuse, die eine proximale Tubulus-spezifische DsbA-L- oder VDAC1-Deletion aufwiesen, wurden durch Kreuzung von DsbA-L erzeugt (flox/flox) Mäuse (bereitgestellt von Dr. Feng Liu) oder VDAC1 (flox/flox) Mäuse (aus Shanghai-Modellorganismen erhalten) mit PEPCK-Cre-Mäusen (bereitgestellt von Dr. Volker Haase (Universität von Pennsylvania, Philadelphia, PA). ) wie zuvor beschrieben.22,23 Männliche Mäuse (8-10 Wochen alt) wurden wie zuvor beschrieben Ischämie, CLP und nephrotoxischem VAN-AKI ausgesetzt.23 27 Bei ischämischem AKI wurde die bilaterale Nierenarterie kontinuierlich abgeschnitten 28 Minuten, gefolgt von Reperfusion für 24 Stunden oder 48 Stunden. Die Körpertemperatur der Mäuse wurde bei etwa 37 Grad gehalten. Für CLP-induziertes AKI wurde der Blinddarm an einer Position 1,5 cm von der Spitze entfernt fest abgebunden. Dies wurde gefolgt von a Punktion für 18 Stunden. Bei VAN-Verletzungen wurde den Mäusen wie zuvor beschrieben an 7 aufeinanderfolgenden Tagen eine Einzeldosis VAN in einer Dosis von 600 mg/kg intraperitoneal injiziert.28,29 Zusätzlich wurde den C57BL/6-Mäusen Folgendes injiziert DsbA-L- oder VDAC1-Plasmide oder VDAC1-siRNA (in einer Dosis von 15 mg/kg) über die Schwanzvene zweimal pro Woche22; Als Kontrollinjektion wurde Kochsalzlösung verwendet. Für jede Studie analysierten wir die Stichproben gemeinsam, um Verzerrungen auf der Grundlage früherer Studien zu vermeiden, und verwendeten die PASS-Software, um die Stichprobengröße (n=6) zu bestimmen. Wir haben die Stichprobe ausgeschlossen, die vor dem Endpunkt gestorben ist oder die Modelleinrichtung nicht bestanden hat. Die Versuchsmäuse wurden nach Zufallszahlentabelle gruppiert. Die Forscher waren während des Experiments nicht verblindet, wohl aber während der Zuteilung, Probenentnahme und Datenanalyse. Alle Tierversuche entsprachen den Leitprinzipien, die von der Ethikkommission für Tierpflege des Zweiten Xiangya-Krankenhauses in der Volksrepublik China genehmigt wurden. Die Mäuse wurden in einer 12-stündigen hellen/dunklen Umgebung mit freiem Zugang zu einer Standardnahrung für Nagetiere und Wasser gehalten.

Herba Cistanche

4. Zellkultur und ein Ischämie-Reperfusionsmodell

BUMPT-Zellen von Dr. Wilfred Lieberthal (Boston University School of Medicine) oder HK{{0}}-Zellen von Shanghai Zhongqiaoxinzhou Biotech wurden mit DMEM (Gibco, 11965092) und 10 Prozent FBS (Gibco, 10100147) kultiviert. und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (Gibco, 15140163) bei 37 Grad in 5 Prozent CO2. Für das ischämische Zellmodell wurden BUMPTs-Zellen mit 10 mM Antimycin A (einem Inhibitor des Mitochondrienkomplexes III, Abcam, ab141904) und 1,5 mM Calciumionophor (Sigma, A23187) in Hanks' Balanced Salt Solution (Hyclone, SH30030.02) behandelt 2 Std. 30 Anschließend ersetzten wir HBSS durch DMEM-Medium für 0, 2 und 4 Stunden für die Reperfusionsphase. Zellapoptose wurde durch Morphologie und Immunblotting für apoptotische Indikatoren, einschließlich gespaltener Caspase3, Bax und Cyt-c, nachgewiesen. Mehrere Plasmide wurden erzeugt und durch Lipofektion in Zellen transfiziert: DsbA-L, HA-VDAC1-1-25, HA-VDAC1-26-366, HA-VDAC1-volle Länge, HA-VDAC{{33 }}D9-13,22-27, HAVDAC1-D39-45,55-57 und HA-VDAC1-D9-13, 22-27 D39-45,55-57 und siRNA für DsbA-L und VDAC1. Sechs bis acht Stunden nach der Transfektion wurde das Kulturmedium durch DMEM ersetzt. Die Sequenzen von DsbA-L-siRNA und VDAC1-siRNA für Mäuse waren 50 - GCAUGGAGCAACCAGAGAUTT -30 bzw. 50 - CCAGAGCAACTTCGCAGTT -30; Die Sequenzen für die durcheinandergemischte NC-siRNA waren 50 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-30. Die Sequenzen von DsbA-L-siRNA und VDAC1-siRNA für Menschen waren 50 -UCAUUUGCCAUGUAUAGUCCU-30 bzw. 50 -UAUUAAGCCAAAUCCAUAGCC -30; Die Sequenzen für die durcheinandergemischte NC-siRNA waren 50 -AACCACUCAACUUUUUCC CAA -30. Das IR-Modell wurde dann induziert, als die Zelldichte 90 Prozent erreichte.

5. Durchflusszytometrie

Die Durchflusszytometrie wurde gemäß den Anweisungen des FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD, 556547) durchgeführt. BUMPT- oder HK-2-Zellen mit unterschiedlichen Behandlungen wurden mit Trypsin ohne EDTA gesammelt und dreimal mit PBS, gefolgt von FITC für 15 Minuten und PI für 5 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen und schließlich durch Durchflusszytometrie untersucht.

6. AKI-Patienten und Probenentnahme

Das Protokoll wurde vom Prüfungsausschuss des Zweiten Xiangya-Krankenhauses in der Volksrepublik China genehmigt. Für diese Studie wurden 18 Patienten rekrutiert, darunter 12 Männer und 6 Frauen. Das Rekrutierungsprinzip basierte auf einer Nierenbiopsie. Die Patienteninformationen sind in Tabelle 1 ergänzt. Die Nierenbiopsieproben wurden von Patienten mit Minimal Change Diseases (MCD) (n=6) und ischämischer oder akuter interstitieller Nephritis (AIN) induzierter AKI (n{{6}) entnommen. }). Wir erklären, dass alle Studien allen relevanten ethischen Vorschriften für Forschung mit menschlichen Teilnehmern entsprechen und in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt wurden und dass die Studie den Richtlinien des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie für die Überprüfung und Genehmigung entspricht Humangenetische Ressourcen. Die Einschluss- und Ausschlusskriterien von MCD wurden in unserer vorherigen Studie beschrieben.23 Für IR: Einschlusskriterien:1 Biopsie für Ischämie-Reperfusionspatienten,2 Alter unter 75 Jahren; Ausschlusskriterien1: Ausschluss von Patienten mit Tumoren, die bei postoperativen medizinischen Untersuchungen festgestellt wurden,2 Ausschluss von Patienten mit Diabetes, Gicht, Bluthochdruck, Harntuberkulose bzw. Infektionen in der Vorgeschichte. Für AIN: Einschlusskriterien1: Klinisch diagnostiziert als akute interstitielle Nephritis2 Durch Biopsie bestätigte AIN-Patienten3 Alter unter 75 Jahren; Ausschlusskriterien1: Patienten mit abnormalem Blutkreatinin vor der Aufnahme ausschließen,2 Patienten mit Diabetes, Gicht, Bluthochdruck, Harntuberkulose oder Infektionen in der Vorgeschichte ausschließen. Diese Proben wurden dann zur Färbung von HE, TUNEL und Immunhistochemie sowie zur Immunpräzipitation (IP) und zum Immunblotting verwendet.

7. Immunpräzipitation

Das Zytoplasma und die Mitochondrien von BUMPT-Zellen sowie Nierengewebe von Mäusen und AKI-Patienten wurden mit dem Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit (Abcam, ab65320) getrennt. Das Kit wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Antikörper (DsbA-L, VDAC1, HA oder IgG) wurden an die Magnetkügelchen gebunden. Als nächstes fügten wir das Mitochondrien-/Zytoplasma-Lysat hinzu und inkubierten es drei Stunden lang. Anschließend wurde die Mischung eluiert und mittels Immunblotting auf die Expression assoziierter Marker untersucht.

8. Relative quantitative PCR (qPCR)

RNA wurde mit dem Trizol-Reagenz (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) aus BUMPT-Zellen oder Nierengewebe extrahiert. Anschließend wurde die RNA mit dem Prime Script RT Reagent Kit und dem gDNA Eraser (TaKaRa, RR037A) wie zuvor beschrieben in Erststrang-cDNA revers transkribiert.31'34 Als nächstes verwendeten wir die cDNA als Vorlage mit TB Green (TaKaRa, RR820A) und einem Light Cycler 96 (Roche) mit den folgenden Primerpaaren: DsbA-L: 5 – AAATATGGGGCCTT TGGGCT-3'(vorwärts) und 5'- TAGCAACTCCAAGCGTCA G-3'(umkehren); und GAPDH: 5'-GGTTCTCTCTGACTTCACA-3'(vorwärts) und 5'-GTGAGGGTC TCTCTCTTCCT-3'(umkehren); PGC- 1a: 5'-ATGTGTCGCCTTCTTGCTCTTCC-3 (vorwärts) und 5'-CTCCCGCTTCTCGTGCTCTTTG-3'(umkehren); NrF1:5'-TCTGCTGTGGCTGATGGAGA GG-3'(vorwärts) und NrF1:5'-GATGCTTGCGTCGTCTGGATGG-3 (rückwärts);

9. BUN- und Kreatinin-Nachweis

Der Nachweis von BUN und Kreatinin erfolgte gemäß dem Protokoll von BUN (Urea Nitrogen Content Assay Kit Beijing Boxbio Science & Technology Co, Ltd.) und Creatinine Assay Kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, China).

10. HE-Färbung, TUNEL-Färbung, Immunchemie, Immunfluoreszenz und Immunblotting

Nierengewebe wurde in Paraffin eingebettet und dann für verschiedene Arten der Färbung in Abschnitte geschnitten, wie zuvor beschrieben.26,35 Die Histologie wurde durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung beurteilt. Die zur Bewertung von Nierentubulusverletzungen verwendeten Kriterien wurden zuvor beschrieben.23 Die TUNEL-Färbung wurde zur Bewertung der Apoptose in den Nierenzellen verwendet. Der Anteil (Prozent) der TUNEL-positiven Zellen in 10-20 mikroskopischen Feldern pro Gewebeschnitt wurde als quantitativer Indikator für Apoptose verwendet.26 Für die immunchemische Färbung wurden Gewebeschnitte über Nacht bei 4 °C mit einem spezifischen Primärantikörper inkubiert ( DsbA-L 1:200 oder VDAC1 1:100). Am nächsten Morgen wurden die Schnitte 30 Minuten lang bei 37 Grad mit einem sekundären Antikörper inkubiert und dann 5-10 Minuten lang mit DAB umgesetzt. Zur Immunfluoreszenzfärbung wurden die Schnitte mit einem spezifischen Primärantikörper (DsbA-L 1:200, VDAC1 1:100) über Nacht bei 4 Grad inkubiert, gefolgt von einem sekundären Fluoreszenzantikörper für 1 Stunde bei 37 Grad im Dunkeln. Dann wurde DAPI für 3-5 Minuten zugegeben und die Schnitte wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Die mitochondriale Färbung wurde nach einem Standardprotokoll durchgeführt. Proteinlysate aus BUMPT-Zellen oder -Nieren wurden geerntet und dann zentrifugiert, um den Überstand mit den Proteinen zu sammeln. Der Überstand wurde einer SDS-PAGE unterzogen und dann auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Membranen wurden dann mit einem primären Antikörper über Nacht bei 4 Grad inkubiert, gefolgt von einem sekundären Antikörper für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Konzentration von AntiCOXIV, VDAC1, PGC-1a, Bax, Cyt-c, NRF1, GAPDH und b-Tubulin beträgt 1:1000. Die Konzentration von Anti-Caspase3 und gespaltener Capase3 beträgt 1:2000.

Cistanche-Ergänzung

11. Statistiken

Alle Daten wurden als Mittelwerte § SD dargestellt. Für den Vergleich zweier Gruppen wurden zweiseitige Student-T-Tests verwendet. Für mehrere Vergleiche wurde eine Einweg-ANOVA gefolgt von Tukeys Post-hoc-Analyse verwendet. Für die Daten mit nicht normaler Verteilung wurde der Kruskal-Walls-Test verwendet. Zur Analyse der Daten wurde die Graph Pad-Software 8.0 verwendet und P<0.05 was considered statistically significant.

12. Rolle der Finanzierungsquelle

Die Geldgeber waren nicht am Studiendesign, der Datenerfassung, Analyse, Interpretation oder dem Verfassen des Manuskripts beteiligt.

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Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h und Dongshan Zhang a,b *

eine Abteilung für Notfallmedizin, Volksrepublik China

b Institut für Notfallmedizin und schwierige Krankheiten, Zweites Xiangya-Krankenhaus, Central South University, Changsha, Hunan 410011, Volksrepublik China

c Abteilung für Augenheilkunde, Volksrepublik China

d Abteilung für Harnchirurgie, Volksrepublik China

e Abteilung für Brustchirurgie, Volksrepublik China

f Abteilung für Allgemeine Chirurgie, Zweites Xiangya-Krankenhaus, Volksrepublik China

g Abteilung für öffentliche Gesundheit, Central South University, Changsha, Hunan, Volksrepublik China

h Abteilung für Endokrinologie, Shenzhen People's Hospital, das zweite klinische medizinische College der Jinan-Universität, das erste angegliederte Krankenhaus der Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Volksrepublik China

1 Xiaozhou Li und Jian Pan haben gleichermaßen zu dieser Studie beigetragen