Teil 2: Wechselwirkungen von Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchinasäure und Quercetin-3-Rutinosid in Gegenwart und Abwesenheit von Eisen während der thermischen Verarbeitung und der Einfluss auf die antioxidative Aktivität

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3. Diskussion

3.1.Struktur-Aktivitäts-Beziehung von Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchinasäure und Quercetin-3-Rutinosid

Ein erster Indikator für die AOA, gemessen für verschiedene Substanzen in Abhängigkeit von der Struktur-Wirkungs-Beziehung, ergab sich aus der Anzahl der funktionellen Gruppen. Beim Vergleich aller drei analysierten Substanzen hatte Ascorbinsäure die niedrigste AOA, gefolgt von 5-Caffeoylchininsäure, währendQuercetin-3-rutinosiderreichte die höchste AOA. Csepregi et al. [14] fanden die gleiche Reihenfolge beim Vergleich der AOA dieser drei Verbindungen. Diese Rangordnung kann durch die Gesamtmenge an Hydroxygruppen erklärt werden: Quercetin-3-rutinosid hat zehn, 5-Caffeoylchinasäure hat fünf undAskorbinsäurehat vier. ZumFlavonoidewurde die Gesamtmenge an Hydroxygruppen und ihr Einfluss auf die Mechanismen der AOA zuvor von Burda und Oleszek[15] gezeigt. Hydroxygruppen sind besonders wertvoll in Endiolstrukturen, da sie leicht zu Diketonen oxidieren können [8]. Bei den analysierten Substanzen ist die Endiolstruktur auch wichtig für die Fähigkeit, mit Metallionen Komplexe zu bilden [16-18]. Die Endiolstruktur kommt in Quercetin-3-rutinosid- und 5-caffeoylchininsäuremolekülen im Phenylring vor, was auch die stärkere AOA dieser Verbindungen beeinflussen kann. Weitere Studien ergaben, dass die AOA auch durch andere Molekülstrukturen beeinflusst werden kann. Phenolsäuren sind möglicherweise von den Carbonsäuregruppen betroffen, z. B. Hydroxyphenylessigsäure (R-CH=CH-COOH) ist eine schwächere elektronenziehende Gruppe, verglichen mit Hydroxyzimtsäure (R-CH,-COOH), wie z als Kaffeesäure in 5-Caffeoylchinasäure [19]. In Flavonoiden hatten Aglykone eine höhere AOA als die entsprechenden Glykoside [20,21], im Fall von Quercetin-3-rutinosid, einem Glykosid, die AOA des AglykonsQuercetinist folglich höher [14]. Es gibt viele verschiedene funktionelle Gruppen, die die AOA beeinflussen können, und daher ist es wichtig, verschiedene Testassays mit unterschiedlichen Mechanismen zu verwenden, wie z. B. Einzelelektronentransfer (SET), Wasserstoffatomtransfer (HAT) und sequentielles Protonenverlustelektron Übertragung (SPLET) zur Erkennung. Jeder Mechanismus und sogar das verwendete Testreagenz können unterschiedliche Strukturen bioaktiver Verbindungen nachweisen [22].

3.2. Einfluss der thermischen Verarbeitung und Wechselwirkung von strukturell unterschiedlichen Antioxidantien auf die antioxidative Aktivität in Abwesenheit des Minerals Eisen

Stabile AOA über einen längeren Zeitraum von 40 min thermischer Verarbeitung zeigt, dass thermischer Abbau von geringerer Bedeutung ist als ursprünglich angenommen. Darüber hinaus zeigten HPLC-Daten, dass reine 5-Caffeoylchininsäure und Quercetin-3-rutinosid während der thermischen Verarbeitung mit einem maximalen Abbau von 20 % stabil waren. Frühere Studien bewiesen die Stabilität von 5--Caffeoylchinasäure bis zum normalen Siedepunkt von Wasser [23], während Dawidowicz und Typek[24] nach 5-stündigem Erhitzen von 5--Caffeoylchinasäure neun abgeleitete Verbindungen fanden Rückfluss. Für die Ascorbinsäurekonzentration wurde ein Abbau nach 40 min Kochen festgestellt. Einflussfaktoren, die zu einem Ascorbinsäureabbau ohne Eisen in wässriger Lösung führen, können pH-Werte, Lichteinwirkung, Oxidation, Temperatur und unterschiedliche Konzentrationen sein [25,26]. In dieser Studie spielten höchstwahrscheinlich die Faktoren Temperatur und Konzentration die Hauptrolle, da oxidative Prozesse aufgrund des minimalen Gasraums in den Mikroröhrchen auf ein Minimum reduziert wurden. Es ist möglich, dass die verbleibende Gasphase noch für den Abbau unter aeroben Bedingungen ausreicht. Die unterschiedlichen Bedingungen führen zu unterschiedlichen Produkten [27,28], sodass in dieser Studie nach 40-minütigem Kochen Produkte beider Bedingungen gefunden werden konnten. Yuan und Chen [28] berichteten, dass Furfural, 2-Furoesäure, 3-Hydroxy-2-pyrron und eine unbekannte Substanz abhängig vom pH-Wert Hauptabbauprodukte von Ascorbinsäure in einer wässrigen Lösung sind . Shinodaet al. [29,30] fanden in Orangensaft die Abbauprodukte Furfural, 2-Furoinsäure, 5-Hydroxymaltol, 3-Hydroxy-2-pyrron und 5-(Hydroxymethyl )furfural. Hsu et al. [31] analysierten Ascorbinsäure in ethanolischen Lösungen und detektierten 2-Furoesäure und 3-Hydroxy-2-pyrron. Je nach aeroben oder anaeroben Bedingungen können die nachgewiesenen Ascorbinsäurederivate (Peaks 3 und 4) Furfural, 2-Furoesäure oder 3-Hydroxy-2-pyrron oder Zwischenprodukte sein. Die Ascorbinsäure nahm in einer Dosis-Wirkungs-Beziehung ab, und höhere Ascorbinsäurekonzentrationen zeigten geringere Abbauraten während des Kochens. Ascorbinsäure scheint sich in höheren Konzentrationen selbst zu stabilisieren, vermutlich aufgrund von Wasserstoffbrückenbindungen und Van-de-Waals-Energie [32].

In binären und ternären Mischungen wurden hauptsächlich zusätzliche Effekte auf AOA gefunden. Wenn in binären Gemischen die Substanz mit höherem AOA in ihrer Konzentration zunahm, stieg auch das AOA ihrer Kombination. Andere Studien fanden auch additive Wirkungen zwischen (plus)-Catechin (200 um) mit Ascorbinsäure (50-200 mg/L)[33] und zwischen binären Mischungen verschiedener Monoterpene[34]. Nur im DPPH-Assay wurden antagonistische Effekte in 5-Caffeoylchinasäure in Kombination mit Quercetin-3-rutinosid und in ternären Mischungen mit doppelter Quercetin-3-rutinosid-Konzentration gefunden. Dies könnte durch die Orientierung der Moleküle im Raum, insbesondere Quercetin-3-rutinosid als ziemlich großes Molekül, und die sterische Zugänglichkeit des DPPH-Radikalmoleküls verursacht werden [35]. Im TPC-Assay führte die Kombination von Ascorbinsäure und 5--Caffeoylchinasäure zu starken antagonistischen Wirkungen in einem Verhältnis von 1:2, während umgekehrte Mischungen mit einem Verhältnis von 2:1 zu starken synergistischen Wirkungen führten, die die Summe der beiden überstiegen jeweiligen AOAs. Ascorbinsäure mit doppelter Konzentration kann unter diesen Bedingungen aufgrund der Selbststabilisierung, gefolgt von der Stabilisierung anderer Moleküle, einen zusätzlichen Schub für AOA geben, was in diesem Experiment durch 5--Caffeoylchinasäure gezeigt wurde. In Granatapfel-Nektarinensaft wurde zwischen den natürlichen Phenolen und Ascorbinsäure die gleiche Wechselwirkung gefunden, während in Traubensaft zunehmende antagonistische Effekte durch steigende Ascorbinsäurekonzentration beobachtet wurden [36]. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mischungen aus Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchininsäure und Quercetin-3-rutinosid das höchste AOA-Potenzial erreichen, wenn sie am wirksamsten sindAntioxidantiensind reichlich vorhanden.

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3.3. Einfluss des Minerals Eisen

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>Askorbinsäure. Die Zugabe von Eisen zu den Mischungen hatte jedoch einen Einfluss auf die TEAC- und DPPH-Testergebnisse, während TPC-Tests weitestgehend unbeeinflusst blieben. Aus diesem Grund ist es wichtig, beim Arbeiten mit eisenreichen Proben unterschiedliche Testassays mit unterschiedlichen Wirkungsmechanismen zu verwenden.

Nur im DPPH-Test hatte die AOA von reinem Quercetin-3-rutinosid und in Kombination mit Ascorbinsäure, äquimolar oder nicht-äquimolar mit doppelter Quercetin-3-rutinosid-Konzentration, niedrigere Werte in Gegenwart von Eisen. Boligonet al. [351 erklärten, dass der DPPH-Assay aufgrund der sterischen Zugänglichkeit dieser Radikale kleinere Antioxidantien besser nachweist. Vermutlich kann Quercetin-3-rutinosid mit den beiden Bindungsseiten recht große Komplexe mit Eisen bilden und ist somit für den Assay unzugänglich. Wie von Kejic et al. [8] könnte dies durch die Bildung supramolekularer Komplexe über die Koordination von Metallionen erklärt werden. In Kombination mit Ascorbinsäure, die gemischtvalente Komplexe im Verhältnis 1:2 bilden kann [12], können diese größeren gemischten Komplexe vermutlich nicht mit dem DPPH-Radikal wechselwirken. Im Gegensatz zu den Ergebnissen dieser Studie haben andere Studien [18,37,38] unter Verwendung des DPPH-Assays festgestellt, dass Quercetin-3-rutinosid-Komplexe wirksamere Antioxidantien sind als reines Quercetin-3-rutinosid. Es ist bekannt, dass Chelatkomplexe von Flavonoiden und Metallionen die radikalische Aktivität von komplexierten Metallionen aufheben können [39]. Der einzige Unterschied bestand darin, dass in dieser Studie Ammoniumeisen(II)-sulfat anstelle von Eisen(ⅡI)-chlorid oder -sulfat verwendet wurde, das in der Arbeit von Symonowics und Kolandek [39] verwendet wurde.

Es wurden synergistische Wirkungen zwischen Ascorbinsäure und 5--Caffeoylchininsäure in Gegenwart von Eisen im Verhältnis 2:1 und antagonistische Wirkungen im Verhältnis 1:2 gefunden. Die Kombination von 5-Caffeoylchininsäure mit Eisen wurde in vivo nicht empfohlen [6]. Diese Studie zeigte jedoch, dass in vitro die doppelte Menge an Ascorbinsäure im Vergleich zu 5-Caffeoylchinasäure sogar synergistische Wirkungen auf AOA haben kann. Weitere Untersuchungen zu Verhältnissen könnten zeigen, ob auch in vivo positive Effekte erzielt werden können.

Gemäß den HPLC-Daten hat die Zugabe von Eisen zur Probe eine minimale Auswirkung auf ihre katalytische Aktivität, da nur die Ascorbinsäurekonzentration in 0 min gekochten Proben abnahm. In den gekochten Ascorbinsäureproben führten im Gegensatz zu Proben ohne Eisen höhere Ascorbinsäurekonzentrationen zu einem höheren Abbauverhältnis.5-Caffeovlchinasäure und Quercetin-3-rutinosid benötigen die zusätzlichen Faktoren Temperatur und Zeit sowie Wechselwirkungen in Mischungen, damit die katalytische Aktivität von Eisen funktioniert. Quercetin-3-rutinosid nahm in Gegenwart von Eisen nur in binären Mischungen mit Ascorbinsäure nach thermischer Behandlung ab. Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass das Flavonoid als primäres Antioxidans wirkt und das resultierende Verbindungsradikal dann mit Ascorbinsäure reagiert, wodurch die ursprüngliche Verbindung regeneriert wird [18]. 5-Caffeoylchinasäure scheint etwas Besonderes zu sein, da sie Quercetin-3-rutinosid schützt, während Ascorbinsäure nicht in der Lage ist, Quercetin-3-rutinosid zu schützen. Daher kann 5--Caffeoylchinasäure das Schlüsselmolekül zur Stabilisierung des Systems in Kombination mit Eisen und thermischer Verarbeitung sein. Diese Hypothese von 5--Caffeoylchinasäure als stabilisierendem Molekül wurde in den ternären Mischungen weiter bestätigt. Dabei wurde Quercetin-3-rutinosid immer durch 5-Caffeoylchininsäure stabilisiert, so dass auch in Anwesenheit von Ascorbinsäure keine Verringerung der Quercetin-3-rutinosid-Konzentration beobachtet wurde. In einer anderen Studie zeigte 5--Caffeoylchinasäure Schutzeigenschaften gegen den Abbau von Anthocyanen durch einen Co-Pigmentierungsmechanismus [40]. Von allen drei Substanzen traten in Gegenwart von Eisen neue Abbauprodukte mit möglicherweise höherem AOA auf. Kaffeesäure (Peak 6) wurde als 5--Caffeoylchinasäure-Abbauprodukt identifiziert (Daten nicht gezeigt). Dies führte zu der Annahme, dass die andere Substanz Chinasäure oder eines der neun möglichen Derivate sein könnte, die von Dawidowicz und Typek [24] beschrieben wurden: Chinasäure;(1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoyl]-1,4,5-Trihydroxycyclohexancarbonsäure;(1S3R,4R,5R)-5- [3-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 Trihydroxycyclohexancarbonsäure; trans-3-O-Caffeoylchinasäure; trans-5-O-Caffeoylchinasäure; trans-4-O-Caffeoylchinasäure; Kaffeesäure; cis-5-O-Caffeoylchinasäure;4,5-Dicaffeoylchinasäure. Für Quercetin-3-rutinosid erscheint im Chromatogramm ein Abbauprodukt, das nicht identifiziert werden konnte.

3.4. Fähigkeit zur Bildung von Chelaten mit Eisen (Fe3 plus) und Eisen (Fe2 plus)

In allen Proben, die Ascorbinsäure enthielten, wurde Eisen zu Eisen (II) reduziert. In diesem Prozess,Askorbinsäurenimmt ein Elektron aus dem Eisen (III), reduziert es zu Eisen (II) und wird selbst zu einem Radikal. Das instabile Radikal wandelt sich schnell in Dehydroascorbinsäure und weitere Abbauprodukte um [12]. Aufgrund des fehlenden Hydroxyperoxids ist eine Rückreaktion zu Eisen über den Fenton-Zyklus nicht möglich. In 0 min gekochten binären Mischungen wurden mehr als 20 % Eisen in Gegenwart von Ascorbinsäure gebunden. Es ist bekannt, dass Ascorbinsäure Komplexe mit Eisenspezies und anderen Metallionen durch Chelatbildung über die 3-O- und 2-O-Kerne nach Wasserstoffverdrängung von 3-OH und 2- bildet. OH-Gruppen [16,17,41. Es kann auch gemischtvalente Eisen-Ascorbat-Komplexe bilden [42]. Allerdings ist Ascorbinsäure ein schwacher Chelatbildner und nach dem Kochen wurden in reinen und gemischten Proben nur Spuren von gebundenem Eisen nachgewiesen, wenn Ascorbinsäure vorhanden war. Darüber hinaus zerfällt Ascorbinsäure aufgrund des Kochvorgangs zu Abbauprodukten, die anscheinend nicht in der Lage sind, mit Eisen Chelate zu bilden.

5-Caffeoylchinasäure ist ein relativ schlechtes Reduktionsmittel. Eisen(III) wurde durch 5-Caffeoylchinasäure reduziert, und bei längerem Kochen verstärkte sich die Reduktion.5-Caffeoylchinasäure chelatiert mit Eisen(III) in einem Ladungstransfer von Ligand zu Metall [17].5-Caffeoylchinasäure trägt eine mögliche Bindungsseite an der 3,4-Endiolstruktur der Kaffeesäure. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, warum Kaffeesäure der bioaktive Teil von 5-Caffeoylchinasäure ist, während Chinasäure fast kein AOA hat [43]. Endiole hemmten die OH-Bildung aufgrund der Bildung eines Eisenkomplexes[41] in einem Eins-zu-Eins-Verhältnis [44,45]. Lamy et al.[46] folgern, dass 5--Caffeoylchinasäure monomere Komplexe bildet, während Kiss et al. [47] fanden oligomere Spezies. Im Gegensatz zu früheren Studien [17,48] wurden in Gegenwart von 5--Caffeoylchinasäure vor und nach der thermischen Verarbeitung nur Spuren von gebundenem Eisen gefunden. Dies kann durch die neutralen pH-Bedingungen in dieser Studie erklärt werden, während andere Studien in einem sauren Medium arbeiteten, basierend auf einem pH-Wert von 1-2.5 im menschlichen Magen [48]. In gelagerten Proben wurde nach mehreren Stunden ein schwarzer Niederschlag gefunden, der ein Indikator für 5--Caffeoylchininsäure-Eisen-Komplexe ist. Für die Analyse wurden kürzlich gemischte Proben verwendet, daher erfordert die Bildung dieser Komplexe bei neutralem pH-Wert eine längere Zeitspanne. Eisenkomplexe mit Kaffeesäure zeigten eine geringe Abfangaktivität [49]. Darüber hinaus gibt es keinen spektrophotometrischen Beweis für eine Reaktion zwischen Chinasäure und Eisen(III) [48]. Im Gegensatz zu 5-Caffeoylchinasäure wurde in der Quercetin-3-rutinosid-Probe auch nach thermischer Behandlung gebundenes Eisen gefunden.

Quercetin-3-rutinosid reduziert Eisen(III) zu Eisen(II) mit einer minimalen Erhöhung durch verlängerte Kochzeit. Diese moderate Reduktionsaktivität von Quercetin-3-rutinosid wurde zuvor von Mira et al. [50]. Die eisen(III)-reduzierende Aktivität von Quercetin-3-rutinosid wurde in 3-rutinosid, 5,7,3',4'-OH nachgewiesen [50]. Die mäßige Wechselwirkung mit Eisen (III) kann durch eine geringere Anzahl von -OH-Gruppen erklärt werden, was zu einer geringeren negativen Ladungsdichte auf der Chelatseite führte [50]. Flavonoide können mit Metallionen an drei möglichen Koordinationsseiten chelatieren: (i) zwischen 5--Hydroxy- und 4--Carbonylgruppen, (ii) zwischen 3--Hydroxy- und 4--Carbonylgruppen, und (ii) zwischen 3', A'-Hydroxygruppen in Bring [39]. Quercetin-3-rutinosid verwendet die Bindungsseiten (i) und (i)[9], und an der 3--Hydroxygruppe ist das Rutinosid gebunden. Spektraldaten zeigten sogar, dass Metallionen nur an die 3', A'-Hydroxygruppe gebunden sind [18]. Chelate sind wirksamer mit Eisen in seiner zweiwertigen Form [50]. In binären Mischungen kann Quercetin-3-rutinosid keine Komplexe bilden, wenn Ascorbinsäure vorhanden ist, im Gegensatz zu ternären Mischungen. Wenn 5-Caffeoylchinasäure vorhanden ist, werden geringe Mengen an gebundenem Eisen gefunden. Dies weist darauf hin, dass 5-Caffeoylquinic Quercetin-3-rutinosid-Moleküle in Gegenwart von Ascorbinsäure schützt, sodass Quercetin-3-rutinosid Komplexe mit Eisen bilden kann.

4. Materialien und Methoden

4.1.Chemikalien

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 Prozent), Eisen(III)-Ammoniumsulfat-Dodecahydrat und Eisen(III)-Ammoniumsulfat-Hexahydrat wurden von Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen.

4.2.Proben

Wässrige Lösungen und Mischungen authentischer Standards von Ascorbinsäure, {{0}}Caffeoylchininsäure und Quercetin-3-rutinosid wurden als reine Lösungen und Mischungen in verschiedenen Verhältnissen hergestellt. Alle möglichen binären Mischungen wurden in äquimolaren Verhältnissen und nicht äquimolaren Verhältnissen hergestellt, wobei eine Verbindung verdoppelt wurde. Ternäre Mischungen wurden auch in äquimolaren Verhältnissen sowie in nicht-äquimolaren Verhältnissen mit jeweils einer oder zwei verdoppelten Verbindungen hergestellt. Die Endkonzentrationen der Antioxidantien waren 0,3 mM für jede Testlösung. Zusätzlich wurden alle Experimente nach der Zugabe von 0,3 mM Eisen ({{10}},15 mM Eisen(II) und 0,15 mM Eisen(III)) insgesamt pro Mischung wiederholt. Die gewählten Mengen an Antioxidantien und Eisen basieren nicht auf physiologischen oder Nahrungsmengen, sie basieren auf Molmassen, um die Wirkung der molekularen Wechselwirkung zu untersuchen. Folglich wurde ein äquimolares Verhältnis zwischen den gesamten Antioxidantien und Eisen hergestellt. Alle Mischungen wurden 0, 10, 20 und 40 min in kochendem Wasser gekocht und danach auf Eis gekühlt, um den Erwärmungsprozess zu stoppen. Dies wurde für drei unabhängige Wiederholungen durchgeführt.

4.3.Photometrische Messungen

Antioxidantien(rein oder gemischt) in Abwesenheit und Anwesenheit von Eisen wurden auf ihre gesamte reduzierende Aktivität und antioxidative Aktivität in drei unabhängigen technischen Wiederholungen unter Verwendung einer Hochdurchsatzmethode in 96-Well-Platten (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Aufgrund der unterschiedlichen Reaktionsmechanismen wurden verschiedene Testassays verwendet: Einzelelektronentransfer (SET) und Wasserstoffatomtransfer (HAT). Während der TEAC- und TPC-Assay auf SET [17,18] basiert, ist die Literatur für den DPPH-Testassay nicht ganz klar, ob er auf SET, HAT oder sogar einer Kombination dieser beiden Mechanismen basiert [{{6} }]. Eine aktuelle Studie von Foti[51] entdeckte, dass Phenole mit DPPH über sequenziellen Protonenverlustelektronentransfer (SPLET), eine Kombination der beiden Mechanismen, reagieren können. Faktoren wie mittlere Polarität und Ionisationspotential beeinflussen den vorherrschenden Mechanismus.

4.3.1. Gesamtphenolgehalt (TPC)

Der Gesamtphenolgehalt (TPC) wurde mit der Folin-Ciocalteu-Methode in einer 96--Well-Platte bestimmt, die zuvor von Bobo-Garcia et al.[52] beschrieben wurde. mit einigen Modifikationen.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Der gebräuchliche Name dieses Tests ist irreführend, da das Folin-Ciocalteu-Reagenz auch auf Nichtphenole wie Vitamine und Mineralstoffe reagiert [22]. Es beschreibt besser die "Gesamtreduktionsaktivität" von bioaktiven Verbindungen.

4.3.2. Trolox-äquivalente Antioxidanskapazität (TEAC)

Die antioxidative Aktivität wurde unter Verwendung des TEAC-Assays in einer 96-Well-Platte mit einigen Modifikationen bestimmt. Eine Stammlösung mit 9,6 mg ABTS und 1,66 mg Kaliumpersulfat wurde mit H2O auf 25 mL aufgefüllt und im Dunkeln bei Raumtemperatur für 12-16 h inkubiert. Aus dieser Stammlösung wurde eine TEAC-Arbeitslösung hergestellt, die 5 ml Stammlösung enthielt, die mit 100 % MeOH auf 25 ml aufgefüllt war.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Radikalfänger

DasAntioxidansactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Synergismus und Antagonismus

Zur Analyse synergistischer und antagonistischer Wirkungen der antioxidativen Aktivität wurde ein Vergleich der experimentell erhaltenen Ergebnisse mit den theoretischen Werten durchgeführt, die sich aus der Summe der Wirkungen der Einzelkomponenten bei der entsprechenden Konzentration errechneten [53]. Synergismus beschreibt ein Zusammenwirken von zwei oder mehr Stoffen, so dass die kombinierte Wirkung größer ist als die Summe der Einzelwirkungen. Im Gegensatz dazu ist Antagonismus ein Phänomen, bei dem die Wechselwirkung von zwei oder mehr Substanzen in Kombination eine Gesamtwirkung hat, die geringer ist als die Summe ihrer Einzelwirkungen.

4.5.Bestimmung von ionischem Eisen

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). Die Differenz zwischen Gesamteisen und ionischem Eisen, der Summe aus Eisen (II) und Eisen (III), ist das gebundene Eisen.

4.6.HPLC-DAD

Zur Quantifizierung der Antioxidantien Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchininsäure und Quercetin-3-rutinosid und deren Abbauprodukte in denselben Extrakten, die für die Photometrie verwendet wurden

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） wurden vorbereitet. Abgeleitete Verbindungen wurden vorläufig identifiziert, indem die reinen Standards in Anwesenheit und Abwesenheit von Eisen vor und nach der thermischen Verarbeitung analysiert wurden. Daher muss der neue Peak aus dem Insert-Standard stammen. Darüber hinaus wurden ausgewählte Mischungen mittels HPLC-MS vermessen, um die vorgeschlagene Struktur zu verifizieren.

4.7. Statistische Analyse

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, USA) und R Statistics (Version 3.6.3, Holding the Windsock, 2020) wurden für biostatistische Tests und die Präsentation und Darstellung der Datenergebnisse verwendet. Inferenzstatistiken zur Bewertung und Verknüpfung von Behandlungen wurden unter Verwendung einer Drei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA), eines Post-hoc-Tukey-HSD-Tests und einer Pearson-Korrelation durchgeführt. Die verwendeten R-Pakete waren ggplot2 [55], mean [56] und multcomp [57].

5. Schlussfolgerungen

Basierend auf den oben beschriebenen Erkenntnissen wurde die AOA von Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchinasäure und Quercetin-3-rutinosid durch ihre Molekülstruktur, Konzentration, ihr Verhältnis und ihre Wechselwirkungen mit anderen Antioxidantien und Eisen beeinflusst. Interaktion scheint insbesondere bei AOA eine Rolle zu spielen, wenn Ascorbinsäure und 5-Caffeoylchinasäure kombiniert werden. Dabei wurden synergistische und antagonistische Effekte festgestellt. Die Temperatur hatte einen minimalen Einfluss auf AOA, während die Temperatur gleichzeitig die Stabilität aller Antioxidantien in bestimmten Mischungen beeinflusste, insbesondere in Gegenwart von Eisen. Nur die Ascorbinsäurekonzentration nahm in Abwesenheit von Eisen bei längerer Kochzeit ab und die 5-Caffeoylchininsäurekonzentration nahm nur in Anwesenheit von Eisen ab, während die Quercetin-3-rutinosidkonzentration nur in Kombination mit Ascorbinsäure in der Vorhandensein von Eisen. In Kombination mit Eisen konnte 5--Caffeoylchinasäure andere Moleküle davor schützen, durch thermische Verarbeitung in ihrer Konzentration reduziert zu werden.

In Pflanzen sind Kombinationen von Ascorbinsäure, 5-Caffeoylchinasäure und Quercetin-3-rutinosid nicht nur möglich, sondern auch üblich. Somit vermitteln diese Ergebnisse grundlegende Kenntnisse über die Prozesse, die beim Kochen von Gemüse ablaufen. Lebensmittelmatrizen sind komplexer und enthalten unzählige bioaktive Verbindungen, darunter Enzyme, andere Mineralien oder Säuren, die Reaktionsbedingungen verändern oder selbst Reaktanten sind. Diese komplexen Wechselwirkungen liegen weit außerhalb des Rahmens dieser Studie und nützlicher Konzentrationen und Wechselwirkungen vonAntioxidantienin gekochtem Gemüse müssen zukünftig angegangen werden.

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