Phloretin unterdrückt Neuroinflammation durch Autophagie-vermittelte Nrf2-Aktivierung in Makrophagen

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Abstrakt

Hintergrund: Makrophagen spielen eine doppelte Rolle bei neuroinflammatorischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose (MS). Sie sind am Beginn und Fortschreiten der Läsion beteiligt, können aber auch deren Auflösung fördernEntzündungund Reparatur von beschädigtem Gewebe. In dieser Studie untersuchen wir, ob und wiePhloretin, ein in Äpfeln und Erdbeeren reichlich vorhandenes Flavonoid, senkt den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen und unterdrücktNeuroinflammation.

Methoden: Transkriptionsveränderungen in aus dem Knochenmark der Maus stammenden Makrophagen nach Phloretin-Exposition wurden durch Massen-RNA-Sequenzierung bewertet. Zugrunde liegende Wege im Zusammenhang mit Entzündungen, Reaktionen auf oxidativen Stress und Autophagie wurden durch quantitative PCR, Fluoreszenz- und Absorptionsassays, Knockout-Mäuse mit Kernfaktor Erythroid 2--bezogenem Faktor 2 (Nrf2), Western Blot und Immunfluoreszenz validiert. Das Modell der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) wurde verwendet, um die Auswirkungen von Phloretin auf die Neuroinflammation in vivo zu untersuchen und die zugrunde liegenden Mechanismen zu bestätigen.

Ergebnisse: Wir zeigen, dass Phloretin den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen reduziert und die Neuroinflammation bei EAE deutlich unterdrückt. Phloretin vermittelt seine Wirkung durch Aktivierung des Nr2-Signalwegs. Die Nrf2-Aktivierung wurde der 5'AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK)-abhängigen Aktivierung der Autophagie und dem anschließenden Kelch-ähnlichen ECH-assoziierten Protein 1 (Keap1)-Abbau zugeschrieben.

Schlussfolgerungen: Diese Studie eröffnet Zukunftsperspektiven für Phloretin als therapeutische Strategie für neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS.

Testregistrierung: Unzutreffend.

Schlüsselwörter: Phloretin, Makrophagen, Neuroinflammation, Multiple Sklerose, Autoimmunität

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Hintergrund

Läsionen der aktiven Multiplen Sklerose (MS) sind durch das Vorhandensein zahlreicher gekennzeichnetMakrophagen[1-5]. Frühe Studien zeigten, dass Makrophagen in MS-Läsionen einen entzündungsfördernden Phänotyp annehmen und dadurch fördernNeuroinflammation, Demyelinisierung und Neurodegeneration. Zu den krankheitsfördernden Effektorfunktionen gehören die Präsentation von aus dem Zentralnervensystem (ZNS) stammenden Antigenen an autoreaktive T-Zellen und die Produktion von Entzündungsmediatoren wie entzündungsfördernden Zytokinen, reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und Stickstoffmonoxid (NO). 6,7]. Vor kurzem wurde festgestellt, dass Makrophagen auch vorteilhafte Funktionen in MS-Läsionen haben, da sie ihren Phänotyp zu einem umformen können, der typischerweise mit Immunsuppression und ZNS-Reparatur assoziiert ist. Dieser schützende Phänotyp ist gekennzeichnet durch eine reduzierte Produktion von entzündungsfördernden Mediatoren, die Produktion von entzündungshemmenden Mediatoren und Wachstumsfaktoren und die Aktivierung von antioxidativen Signalwegen wie dem nuklearen erythroiden 2--verwandten Faktor 2(Nrf2)-Weg [8-14]. Da der Entzündungsstatus von Makrophagen mit dem Fortschreiten der MS und der Entwicklung chronisch aktiver Läsionen in Verbindung gebracht wurde, wird das Antreiben von Makrophagen zu einem günstigen Phänotyp als vielversprechende Strategie angesehen, um das Fortschreiten der MS zu begrenzen [15].

Nahrungsbestandteile treiben die Makrophagenfunktion und die Neuroinflammation an [16]. Insbesondere wird zunehmend anerkannt, dass die Familie der Flavonoide vielversprechende Verbindungen enthält, die pathogene Wege beeinflussen und den Phänotyp von Immunzellen wie Makrophagen modulieren[17,18]. Flavonoide bilden eine der größten Phytonährstofffamilien, die über 8000 phenolische Verbindungen mit unterschiedlicher Bioaktivität enthalten. Mehrere Mitglieder der Familie der Flavonoide zeigen entzündungshemmende und antioxidative Wirkungen auf Makrophagen [19-21]. Das Flavonoid Phloretin gehört zu den Dihydrochalkonen und ist in häufig verzehrten Früchten wie Äpfeln und Erdbeeren enthalten. Phloretin ist dafür bekannt, immunmodulatorische Eigenschaften auszuüben und wird aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften häufig für die Hautpflege verwendet [22-24]. Darüber hinaus ist Phloretin ein Inhibitor des Glukosetransporters (GLUT), ein Merkmal, das den Phänotyp von Makrophagen beeinflusst, da die Aktivierung von Makrophagen durch GLUT vorangetrieben wird [25, 26]. Insgesamt machen diese Eigenschaften Phloretin zu einer vielversprechenden Verbindung zur Modulation des Phänotyps von Makrophagen und Neuroinflammation. In dieser Studie zeigen wir, dass Phloretin Makrophagen in Richtung eines weniger entzündlichen Phänotyps treibt und Neuroinflammation im experimentellen Autoimmun-Enzephalomyelitis (EAE)-Modell lindert. RNA-Sequenzierung und funktionelle Experimente identifizierten den Nrf2-Weg als Drehscheibe und Treiber dieses durch Phloretin induzierten schützenden Makrophagen-Phänotyps. Es wurde festgestellt, dass die AMPK-abhängige Aktivierung der Autophagiemaschinerie und der anschließende SQSTMl/p62--vermittelte (im Folgenden als p62 bezeichnete) Abbau von Keapl, einem Adapter, der den proteasomalen Nrf2-Abbau erleichtert, der Nrf2-Aktivierung in Makrophagen zugrunde liegt. Diese Ergebnisse zeigen, dass Phloretin das Potenzial hat, in therapeutischen Strategien für neuroinflammatorische Erkrankungen eingesetzt zu werden.

Methoden

Antikörper und chemische Reagenzien

Phloretin(Sigma Aldrich) wurde in 50 mM KOH zu einer 15 mM Stammlösung gelöst und bei -20 Grad gelagert. Weitere Verdünnungen wurden in einem RPMI1640 (Gibco)-Medium hergestellt. Für die in-vivo-Behandlung wurde Phloretin in 1 N NaOH gelöst, wonach der pH-Wert mit 1 N HCl wieder auf 7,2 eingestellt wurde, und die Lösung weiter in physiologischem Wasser verdünnt wurde, um eine Konzentration von 50 mg/kg zu erhalten. BML-275 (1 μM, Santa Cruz Biotechnology) wurde 1 Stunde vor der Phloretin-Behandlung hinzugefügt, um die AMPK-Aktivierung zu hemmen. Bafilomycin A1 (BAF, 0,1 μM, InvivoGen) wurde 2 h vor der Entnahme hinzugefügt, um die Fusion von Autophagosomen und Lysosomen zu blockieren. Lipopolysaccharid (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) wurde verwendet, um Zellen zur entzündlichen Phänotypisierung zu stimulieren. Phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) wurde verwendet, um die ROS-Produktion zu induzieren. Die folgenden Antikörper wurden für den Western Blot verwendet: Maus-Anti- --Aktin (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), Maus-Anti-GAPDH (1:{{29 }};AB_2537659, Invitrogen), Kaninchen-anti-AMPK (1:1000;5831S, Cell Signaling Technology), Kaninchen-anti-phosphoryliertes AMPK (1:1000; 2535S, Cell Signaling Technology), Kaninchen-anti-LC3 (1:1000; L7543, Sigma-Aldrich), Kaninchen-anti-p62 (1:1000; 23214, Cell Signaling Technology). Die folgenden Antikörper wurden für die Immunfluoreszenz verwendet: Ratten-Anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), Ratten-Anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), Kaninchen-Anti-LC3 (1:1000 ;L7543, Sigma-Aldrich), Kaninchen-anti-p62 (1:500;23214,Cell Signaling Technology), Kaninchen-anti-Keap1(1:500;60027-1-Ig,Proteintech Europa), Kaninchen-anti-TMEM119(1 :100, ab209064, Abcam). Geeignete sekundäre Antikörper wurden von Invitrogen erworben.

Mäuse

Wildtyp(WT)-C57BL/6JOlaHsd-Mäuse wurden von Envigo erworben. Die Tiere wurden regelmäßig ernährt und in der Tiereinrichtung des Biomedical Research Institute der Universität Hasselt untergebracht. Alle Experimente wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und von der Ethikkommission für Tierversuche der Universität Hasselt genehmigt.

Zellkultur

Aus Knochenmark gewonnenMakrophagen(BMDMs) wurden aus WT- und Nrf2-Knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd-Mäusen isoliert, von Envigo gekauft und vom RIEN BRC gemäß einem MTA an Prof. S. Kerdine-Römer bereitgestellt [27,28]. BMDMs wurden wie zuvor beschrieben erhalten [29]. In kurzen tibialen und femoralen Knochenmarkszellen von 12- Wochen alten WT- und Nrf2-KO-C57BL/6JOlaHsd-Mäusen wurden in 10--cm-Petriplatten in einer Konzentration von 10×106 Zellen/ Platte, in RPMI1640-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (FCS, Gibco), 50 E/ml Penicillin (Invitrogen), 50 E/ml Streptomycin (Invitrogen) und 15 % L929--konditioniertem Medium (LCM ). Nach der Differenzierung wurden BMDMs bei 37 Grad mit 10 mM EDTA in PBS (Gibco) abgelöst und kultiviert (0,5 × 10 Grad Zellen/ml) in RPM1640, ergänzt mit 10 Prozent FCS, 50 E/ml Penicillin, 50 E/ml Streptomycin und 5 Prozent LCM ( 37 Grad C, 5 Prozent CO2). Mikrogliakulturen wurden aus Gehirnen postnataler P1-3 C57BL/6/OlaHsd-Welpen isoliert. Nachdem der Hirnstamm, der Plexus choroideus und die Hirnhäute entfernt worden waren, wurden die Gehirne mechanisch dissoziiert und für 15 min mit 1 × Trypsin (Gibco) bei 37 Grad enzymatisch verdaut. Danach wurde die Zellsuspension in DMEM, einem Medium mit hohem Glucosegehalt (Sigma), ergänzt mit 30 Prozent LCM, 10 Prozent FCS, 50 E/ml Penicillin und 50 E/ml Streptomycin, in T75-Kulturflaschen ausgesät. Zwei bis drei Tage später wurde ein kompletter Mediumwechsel durchgeführt. Gemischte Gliakulturen wurden nach 6-7 Tagen geschüttelt (230 U/min, 3 h, 37 Grad), um reine Mikrogliakulturen zu erhalten.

RNA-Sequenzierung

Die Zellen wurden mit Phloretin (50 μM) für 20 h vorbehandelt und für 6 h mit LPS stimuliert (100 ng/ml). Die Zelllyse wurde unter Verwendung von Qiazol Lysis Reagenz (Qiagen) durchgeführt. RNA wurde unter Verwendung des RNeasy-Minikits (Qiagen) aus Zellen extrahiert. Die Proben wurden dann vom Genomics Core Leuven (Belgien) verarbeitet. Die Bibliotheksvorbereitung wurde mit dem QuantSeq-Kit von Lexogen durchgeführt, um Illumina-kompatible Bibliotheken zu generieren. Bibliotheken wurden auf dem Sequenzierungssystem Illumina HiSeq4000 sequenziert. Splice-aware Alignment wurde mit STAR v2.6.1b[30] durchgeführt. Die Quantifizierung der Reads pro Gen wurde mit HT-seq Count v2.7.14 durchgeführt. Die auf der Anzahl basierende differentielle Expressionsanalyse wurde mit R-based (The R Foundation for Statistical Computing, Wien, Österreich) Bioconductor-Paket DESeq2 durchgeführt. Eine Liste unterschiedlich exprimierter Gene wurde bei ap ausgewählt<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Quantitative reverse Transkriptions-PCR

Die Zellen wurden mit Phloretin (5 0 μM) für 20 h vorbehandelt und LPS-stimuliert (100 ng/ml) für 6 h. Die Lyse wurde unter Verwendung von Qiazol Lysis Reagenz (Qiagen) durchgeführt. Die RNA wurde mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert. Die RNA-Konzentration und -Qualität wurden mit einem Nano-Drop-Spektrophotometer (Isogen Life Science) bestimmt. Die cDNA-Synthese wurde mit dem Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die qPCR wurde auf einem StepOne-Plus"-Echtzeit-PCR-System (Applied Biosystems) unter Verwendung einer SYBR-Grünmischung durchgeführt, die 1 × SYBR-Grün (Applied Biosystems), 0,3 μM Primer (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNA und nukleasefreies Wasser enthielt Die vergleichende Ct-Methode wurde zur Quantifizierung der Genexpression verwendet.Die Daten wurden auf die stabilsten Referenzgene Cyclin A und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase1 normalisiert.Primersequenzen sind auf Anfrage erhältlich.

Bestimmung reaktiver Sauerstoffspezies

Die Zellen wurden 2 h lang mit Phloretin (50 uM) vorbehandelt. Danach wurden die Zellen mit PMA (15 min, 100 ng/ml) stimuliert und die ROS-Produktion wurde unter Verwendung der fluoreszierenden Sonde 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat bei 10 &mgr;M in PBS für 30 min gemessen. Die Fluoreszenz wurde mit dem Fluoreszenz-Mikroplattenlesegerät FLUOstar Optima (BMG Labtech, Ortenberg, Deutschland) gemessen (Anregung: 495 nm, Emission: 529 nm).

Messungen von Stickoxid

Die Zellen wurden mit Phloretin (50 μM) für 2 h vorbehandelt. Danach wurden die Zellen mit LPS (24 h, 100 ng/ml) stimuliert. NO wurde indirekt unter Verwendung des Griess-Reagenz-Nitrit-Messkits (Abcam) überwacht. Kurz gesagt reagiert Nitrat mit Sulfanilamid und N-(1--Naphthyl)ethylendiamindihydrochlorid, um einen rosafarbenen Azofarbstoff zu erzeugen. Die Extinktion dieses Azo-Derivats wurde dann bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (iMark, Bio-Rad) gemessen.

westlicher Fleck

Die Zellen wurden mit Phloretin (5{{10}} μM) und LPS (100 ng/ml) für 1 h oder 24 h behandelt, um die AMPK-Aktivierung bzw. die p62-, LC3- und Keapl-Proteinspiegel zu bestimmen. Die Zellen wurden unter Verwendung von RIPA-Puffer (150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdeoxycholat, 1 % SDS, 50 mM Tris) lysiert und über Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die Gele wurden auf eine PVDF-Membran (VWR) übertragen und die Blots wurden für 1 Stunde in 5 % Rinderserumalbumin in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,1 % Tween -20 (TBS-T) enthielt, blockiert. Membranen wurden mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C sondiert, mit TBS-T gewaschen und mit dem entsprechenden sekundären Meerrettichperoxidase-markierten Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Immunreaktive Signale wurden mit verstärkter Chemilumineszenz (ECL Plus, Thermo Fisher) unter Verwendung des Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences).Die Dichten der Banden wurden unter Verwendung von ImageJ bestimmt.

Immunfluoreszenz

Kryoschnitte des Rückenmarks wurden luftgetrocknet und in eiskaltem Aceton für 10 min bei - 20 Grad fixiert. Maus-BMDMs wurden auf Glasdeckgläsern kultiviert und in eiskaltem Methanol für 10 min bei -20 Grad fixiert. Schnitte und BMDMs wurden für 30 min unter Verwendung von Dako-Proteinblock (Agi-lent) blockiert. Danach wurden sie über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern inkubiert, gewaschen und mit den entsprechenden sekundären Antikörpern für 1 h bei RT inkubiert. Bilder des Rückenmarksgewebes wurden mit einem Nikon Eclipse 80i-Mikroskop (10 × Objektiv) und NIS aufgenommen Software Elements BR 3.10 (Nikon). Bilder von BMDMs, die für p62, LC3 und Keapl gefärbt wurden, wurden mit dem konfokalen Mikroskop Zeiss LSM 880 aufgenommen und Airyscan-korrigiert (63-fach-Objektiv). P62- und LC3- positive Puncta wurden durch halbautomatische Puncta-Analyse imageJ bestimmt. Kurz gesagt, nachdem das Bild binär gemacht und Zellen von Hand ausgewählt wurden, wurden Puncta pro Zelle analysiert. Die P62- und Keapl-Kolokalisierung wurde unter Verwendung einer Kolokalisierungspipeline in der CellProfiler-Software durchgeführt [31 ] Die in den Abbildungen gezeigten Bilder sind digital verbessert.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, therapeutisches Setup). Die Mäuse wurden täglich gewogen und auf neurologische Anzeichen der Krankheit gemäß dem Maus-EAE-Bewertungsleitfaden des Herstellers bewertet:0:keine klinischen Symptome,0.5:Schwanzspitze ist schlaff, 1:Schwanz schlaff , 1.5: schlaffer Schwanz und Hinterbeinhemmung 2: schlaffer Schwanz und Schwäche der Hinterbeine, 2.5: schlaffer Schwanz und Nachziehen der Hinterbeine, 3: schlaffer Schwanz und vollständige Lähmung der Hinterbeine, 3.5: schlaffer Schwanz und vollständige Lähmung der Hinterbeine Beine und Maus können sich in Seitenlage nicht aufrichten,4: Lähmung des Zwerchfells, 5: Tod durch EAE.

statistische Analyse

GraphPad Prism wurde verwendet, um die Daten statistisch zu analysieren, die als Mittelwert ± Standardabweichung D'Agostino dargestellt sind, und der Pear-son-Omnibus-Normalitätstest wurde verwendet, um die Normalverteilung zu testen. Für normalverteilte Daten wurde der zweiseitige ungepaarte Student-t-Test (mit Welch-Korrektur, falls erforderlich) verwendet. Die Mann-Whitney-Analyse wurde für Daten verwendet, die den Normalitätstest nicht bestanden. p-Werte<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Ergebnisse

Transkriptionsveränderungen im Zusammenhang mit der Phloretin-Behandlung von Makrophagen

Um mögliche entzündungshemmende Wirkungen festzustellen und die zugrunde liegenden Mechanismen der Phloretin-Behandlung auf Makrophagen zu identifizieren, führten wir eine Massen-RNA-Sequenzierung durch (ergänzende Abb. 1). Pathway-Analysen von aktivierten Makrophagen, die mit Phloretin behandelt wurden, zeigten, dass differentiell exprimierte Gene in verwandten kanonischen Signalwegen überrepräsentiert warenEntzündung, wie z. B. iNOS(z-score:-2.449), Toll-like-Rezeptor (z-score:-2.236), Interferon-Signalisierung (z-score:- 2), und Akutphase-Reaktionsweg (z-Score: - 1.633) (Abb. 1A, B). Ähnlich wie bei der Analyse des kanonischen Signalwegs sagte die Upstream-Analyse der RNA-Seq-Daten voraus, dass Phloretin die Aktivierung wichtiger entzündungsfördernder Transkriptionsregulatoren wie IRF7 (z-Score: 2,229), IRF1 (z-Score: -2) reduziert. 025) und STAT1 (z-Score: -2.022) (Abb. 1D). Neben der Herunterregulierung entzündungsfördernder Makrophagenwege zeigte die RNA-seq-Analyse von Phloretin-behandelten Makrophagen, dass Phloretin unter anderem den Nrf2-Weg (z-Wert: 1,897) stark aktivierte, was durch die Hochregulierung von Nrf2--assoziiert belegt wurde Gene wie mafG und Proxy (Abb. 1A, C). Darüber hinaus wurde Nrf2(NFE2L2) als der am stärksten aktivierte vorgeschaltete Transkriptionsregulator identifiziert (z-Wert: 2,801), und die Regulierung der ROS-Spiegel wurde als eine der am stärksten hochregulierten biologischen Funktionen in Phloretin-behandelten BMDMs identifiziert (z-Wert: 2,008 ) (Abb. 1D, E). Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Phloretin Nrf2 aktiviert und den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen unterdrückt.

Der Nrf2-Weg kontrolliert den Phänotyp von mit Phloretin behandelten Makrophagen

Als nächstes validierten wir die entzündungshemmende Wirkung von Phloretin und bestimmten, ob es den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen moduliert, indem es auf Nrf2 einwirkt. Reduzierte ROS-Spiegel wurden in Phloretin-behandelten WT-BMDMs beobachtet, die mit PMA stimuliert wurden ( 2A ). Darüber hinaus wurden eine verringerte NO-Produktion und mRNA-Spiegel der entzündungsfördernden Gene NOS2, I-6, COX2 und I-12 in Phloretin-behandelten WT-BMDMs beobachtet, die mit LPS stimuliert wurden (Fig. 2B, C).In In Bezug auf die entscheidende Rolle von Nrf2 bei der Induktion eines weniger entzündlichen Phänotyps zeigen unsere Daten, dass Phloretin die Nrf2--Reaktionsgene HO1 und NQO1 in WT aktiviert, aber nicht Nrf2 KO BMDMs, die mit LPS stimuliert wurden (Abb. 2D). Darüber hinaus reduzierte die Phloretin-Behandlung die ROS-Produktion in WT, aber nicht in Nrf2-KO-BMDMs (Abb. 2E). Abgesehen von der Kontrolle antioxidativer Reaktionen soll Nrf2 den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen unterdrücken [12]. Zur Unterstützung des Letzteren war Phloretin nicht in der Lage, die Expression der entzündungsfördernden Gene NOS2, IL{-6}, COX2 zu reduzieren und IL-12 in aktivierten Nrf2--defizienten BMDMs (Abb. 2F). Insgesamt weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass Nrf2 die Phloretin-vermittelte entzündliche Phänotypverschiebung von Makrophagen antreibt.

Phloretin fördert die AMPK-Aktivierung

Phloretin ist ein gut definierter GLUT-Hemmer, und neuere Studien unterstreichen die Bedeutung der GLUT-vermittelten Glukoseaufnahme für die Makrophagenaktivierung [26,32]. Daher haben wir festgestellt, ob Phloretin den Energiesensor AMPK aktivieren kann, der bei niedrigen Energie-/Glukosespiegeln aktiviert wird. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit Phloretin zu einer AMPK-Phosphorylierung und -Aktivierung führt (Abb. 3A, B). Darüber hinaus verhindert die Zugabe des AMPK-Inhibitors BML-275 weitgehend die AMPK-Aktivierung in mit Phloretin behandelten BMDMs (Abb. 3A, B). Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die AMPK-Aktivierung für Phloretin unerlässlich ist, um die ROS-Produktion zu unterdrücken, wie durch höhere ROS-Spiegel bei BMDMs gezeigt wird, die sowohl mit Phloretin als auch mit AMPK-Inhibitor behandelt wurden, im Vergleich zu BMDMs, die nur mit Phloretin behandelt wurden (Abb. 3C). Insgesamt deuten unsere Daten darauf hin, dass die Phloretin-induzierte AMPK-Aktivierung entscheidend dafür ist, Makrophagen in Richtung eines weniger entzündlichen Phänotyps zu treiben.

Phloretin stimuliert die Autophagie auf AMPK-abhängige Weise

Da die AMPK-Aktivierung mit der Aktivierung katabolischer Prozesse als Reaktion auf Nährstoffmangel zusammenhängt [33], untersuchten wir als nächstes, ob Phloretin die Autophagie aktivieren kann. Autophagie ist ein konservierter katabolischer Prozess, der durch Hunger und andere Stressreaktionen induziert wird und den lysosomalen Abbau von intrazellulärer Fracht fördert, die in Vesikeln, den sogenannten Autophagosomen, sequestriert ist. Die RNA-seq-Analyse sagte die Autophagie als einen der nachgeschalteten biologischen Prozesse voraus, die eine erhöhte Aktivität in Phloretin-behandelten BMDMs zeigen (z-Score: 0.779) (Abb. 4A). Darüber hinaus zeigte die immunzytochemische Analyse von BMDMs, die mit Phloretin und dem Autophagie-Inhibitor Bafilomycin Al behandelt wurden, eine erhöhte Akkumulation der Autophagie-Marker MAP1LC3/LC3 (Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3) und p62 im Vergleich zu mit Bafilomycin A 1- behandelten BMDMs (Abb 4B-D), was auf einen erhöhten autophagischen Fluss nach Phloretin-Behandlung hinweist [34]. Bei Induktion der Autophagie wird LC3 von der LC3I-Form in die lipidierte LC3I-Form umgewandelt, was mit der Anzahl der Autophagosomen korreliert. In Übereinstimmung damit wurden höhere Proteinspiegel von LC3II und p62 in Phloretin-stimulierten BMDMs durch Western Blot bestimmt (Fig. 4E, F). Interessanterweise wurde dieser Anstieg von p62 und LC3II durch Phloretin verhindert, indem BMDMs mit dem AMPK-Inhibitor BML-275 behandelt wurden (Abb. 4E-F). Insgesamt zeigen unsere Daten, dass Phloretin die Autophagie auf AMPK-abhängige Weise stimuliert.

Phloretin aktiviert den Nrf2-Weg durch Autophagie-vermittelten Keap1-Abbau

Unsere Daten zeigen, dass Phloretin Nrf2 aktiviert und die Autophagie in Makrophagen stimuliert. Interessanterweise kann der Autophagie-Rezeptor p62 mit Nrf2 um die Bindung an Keapl konkurrieren, dem Adapter, der die Ubiquitinierung und den Abbau von Nrf2 unter normalen Bedingungen erleichtert. Diese p62--vermittelte Dissoziation von Keap1/Nrf2 verhindert daher den Abbau von Nrf2 und führt schließlich zur Aktivierung von Nrf2 [35]. Aus diesem Grund haben wir festgestellt, ob Phloretin die p62/Keapl-Wechselwirkung fördert und dadurch den Nrf2-Weg aktiviert. Hier zeigen wir, dass Phloretin den Nrf2-Weg durch p62--vermittelten Keapl-Abbau in Makrophagen aktiviert. Durch die Verwendung der hochauflösenden konfokalen Airyscan-Mikroskopie in Kombination mit der Kolokalisierungsanalyse zeigen wir, dass Phloretin die Wechselwirkung von p62 und Keapl stimuliert, wie durch einen erhöhten Wert des Kolokalisierungsparameters (Pearson-Koeffizient) in mit Phloretin behandelten BMDMs gezeigt wird (Abb. 5A , B). Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass niedrigere Keapl-Proteinspiegel in mit Phloretin behandelten BMDMs vorhanden sind, was den Abbau von Keapl bestätigt (Abb. 5C). Um zu bestätigen, dass der Abbau von der Autophagie abhängt, haben wir den mit Phloretin behandelten den Autophagie-Inhibitor Bafilomycin A1 hinzugefügt BMDMs. Interessanterweise wurde diese Keapl-Verringerung durch die Behandlung mit Bafilomycin Al rückgängig gemacht (Fig. 5C). Diese Ergebnisse wurden durch Western Blot bestätigt, was eine Verringerung der Keapl-Proteinspiegel in Phloretin-behandelten BMDMs zeigte, die durch Bafilomycin A1 verhindert wurde ( 5D , E).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), reduzierte Phloretin die Schwere der Erkrankung (Fig. 6B). Eine verringerte Schwere der Erkrankung bei mit Phloretin behandelten Tieren ging einher mit einer verringerten Expression von Entzündungsgenen MHCI,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 und CXCL2 im Rückenmark (Abb. 6C). Darüber hinaus wurde eine verringerte Menge an F4/80t-Zellen im Rückenmark von mit Phloretin behandelten Tieren gefunden (Fig. 6E, F). Da sowohl F4/80*-Mikroglia als auch F4/80*-Makrophagen zur Neuroinflammation beitragen, zeigte eine eingehendere Analyse, dass Phloretin die Menge an F480 plus TMEM1 deutlich reduzierte19-

Makrophagen in EAE-Mäusen (ergänzende Fig. 2 DF), während ein nicht signifikanter Trend in Richtung einer Reduktion von F480 plus TMEM119 plus Mikroglia beobachtet wurde. In Übereinstimmung mit diesem Befund unterdrückte Phloretin die Produktion von Entzündungsmediatoren in Mikroglia, aber diese Unterdrückung war im Vergleich zu Makrophagen weniger ausgeprägt (ergänzende Fig. 2AC). Diese Befunde legen nahe, dass die EAE-Verbesserung durch Phloretin hauptsächlich Makrophagen-gesteuert ist. Zusätzlich zur Verringerung der Expression von Entzündungsgenen erhöhte Phloretin die Expression von entzündungshemmenden und neurotrophen Faktoren, dh IL-4, CNTF und IGF-1 im Rückenmark von EAE-Tieren (Fig. 6D ). Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Phloretin die Schwere der EAE-Erkrankung verringert, indem es Makrophagen in Richtung eines krankheitsauflösenden Phänotyps treibt. In Übereinstimmung mit unseren früheren In-vitro-Ergebnissen haben wir auch erhöhtes Nrf2-Signalling im ZNS von mit Phloretin behandelten EAE-Tieren nachgewiesen, wie durch eine erhöhte mRNA-Expression von Nrf2 und seinen nachgeschalteten Zielen NQO1 und GPX1 angezeigt wird ( 6G ). Insgesamt zeigen diese Daten, dass Phloretin die Neuroinflammation sowohl in prophylaktischer als auch in therapeutischer Hinsicht unterdrückt. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass Phloretin die Neuroinflammation reduzieren kann, indem es die entzündlichen Merkmale von Makrophagen durch die Nrf2-Aktivierung unterdrückt.

Diskussion

In dieser Studie zeigen wir, dass Phloretin Makrophagen in einer Nrf2--abhängigen Weise zu einem weniger entzündlichen Phänotyp treibt. Es wurde festgestellt, dass die AMPK-abhängige Aktivierung der Autophagie und der anschließende Keapl-Abbau der Nrf2-Aktivierung durch Phloretin zugrunde liegen. Darüber hinaus bestätigen wir die entzündungshemmenden Wirkungen von Phloretin in einem EAE-Modell, wo es die Schwere der Erkrankung verringert und die Abhängigkeit von Makrophagen lindertNeuroinflammation.

Wir zeigen, dass Phloretin den entzündlichen Phänotyp von Makrophagen unterdrückt. Dies steht im Einklang mit den Ergebnissen von Wei-Tien Chang et al. die zeigten, dass Phloretin in einer Makrophagen-Zelllinie entzündungshemmende Eigenschaften hat [36]. Wir zeigen, dass die Induktion dieser Phänotypverschiebung von Nrf2 abhängig ist. Nrf2 ist ein Hauptregulator antioxidativer Reaktionen und seine Aktivierung treibt Makrophagen bekanntermaßen in Richtung eines entzündungshemmenden Phänotyps [1l, 12, 37]. Darüber hinaus haben mehrere Studien definiert, dass die Nrf2-Aktivierung Neuroinflammation und Neurodegeneration bei ZNS-Erkrankungen dämpft [{{10 }}]. Obwohl unsere Ergebnisse zeigen, dass Nrf2 der Phänotypverschiebung von mit Phloretin behandelten Makrophagen zugrunde liegt, zeigten RNA-Sequenzierungsdaten, dass neben der Nrf2-Aktivierung andere Wege hochreguliert wurden. Insbesondere die Hochregulierung des PPAR-Signalwegs ist aufgrund seiner entzündungshemmenden Eigenschaften und der Wechselwirkung mit Nrf2 von Interesse [41-45]. Da Phloretin ein gut definierter GLUT-Inhibitor ist und der Wechsel zur Glykolyse ein entscheidendes metabolisches Ereignis für die Makrophagenaktivierung ist, könnten Phänotypänderungen auch teilweise durch direkte metabolische Wirkungen von Phloretin auf diese Glukosetransporter induziert werden [46,47]. Weitere Forschung ist gerechtfertigt, um die Relevanz von PPAR bei der Phloretin-induzierten Nrf2-Aktivierung zu definieren und inwieweit die Phloretin-induzierte Immunmodulation durch direkte metabolische Veränderungen beeinflusst wird. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse deutlich, dass die Nrf2-Aktivierung eine wesentliche Rolle beim Phloretin-vermittelten Phänotypwechsel spielt.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Nrf2-Aktivierung durch Phloretin durch die AMPK-Aktivierung vermittelt wird. AMPK spielt eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung der zellulären Energiehomöostase im Falle von Belastungen, die ATP erschöpfen, was zu einem erhöhten ADP: ATP-Verhältnis führt, wodurch alternative katabole Wege eingeschaltet werden, die ATP erzeugen, während anabole Wege ausgeschaltet werden, die ATP verbrauchen [48]. Dementsprechend ist Phloretin ein gut etablierter GLUT-Hemmer und senkt den zellulären Glukosespiegel [49-51]. Mehrere Studien zeigten, dass die AMPK-Aktivierung in Makrophagen einen immunsuppressiven Phänotyp induziert, was unsere Ergebnisse bestätigt, die zeigen, dass die AMPK-Aktivierung für Phloretin wesentlich ist, um Entzündungen zu verringern [52,53]. Unsere Daten stimmen auch mit früheren Studien überein, in denen gezeigt wurde, dass Phloretin AMPK in anderen Zelltypen aktiviert, einschließlich Adipozyten und Endothelzellen [50, 54-56]. Phloretin kann AMPK indirekt aktivieren, indem es die AMP- und ATP-Spiegel erhöht, da AMP und ATP die AMPK-Aktivierung allosterisch stimulieren bzw. hemmen [48, 57]. Dennoch kann CaMKK, das eine AMPK vorgeschaltete Kinase ist, die AMPK-Aktivierung als Reaktion auf erhöhte zelluläre Ca2+-Spiegel fördern, ohne dass sich die AMP/ATP-Spiegel verändern [58]. Darüber hinaus ist angesichts des breiten Netzwerks des Zusammenspiels zwischen AMPK und vor- und nachgelagerten Signalwegen weitere Forschung erforderlich, um den zugrunde liegenden Mechanismus der Phloretin-induzierten AMPK-Aktivierung aufzuklären.

Unsere Daten legen nahe, dass die Phloretin-vermittelte AMPK-Aktivierung die Autophagie in Makrophagen stimuliert. Wie oben erwähnt, ist die AMPK-Aktivierung ein Selbstschutzprozess, der darauf abzielt, das Energiegleichgewicht der Zelle wiederherzustellen [48]. Obwohl keine Studie jemals gezeigt hat, dass Phloretin den Phänotyp von Makrophagen durch Förderung der Autophagie stimulieren konnte, haben einige Studien dennoch eine Wirkung von Phloretin auf Autophagiewege in Krebszellen und Hepatozyten gezeigt [59-61]. Darüber hinaus zeigen verschiedene Studien, dass nachgeschaltete katabole Prozesse der AMPK-Aktivierung die Autophagie aktivieren können [60, 62, 63]. Interessanterweise wird die AMPK-vermittelte Autophagie als Reaktion auf Glukosemangel durch Phosphorylierung des wichtigen Autophagie-Initiators unc-51 wie der Autophagie-aktivierenden Kinase induziert [64,65]. In Bezug darauf spekulieren wir, dass AMPK die Autophagie stimuliert, um ATP aus zellulären Komponenten als Reaktion auf Phloretin-induzierten Glukoseabbau wiederherzustellen. Glukosemangel kann jedoch auch die Autophagie auf AMPK-unabhängige Weise aktivieren [66-68]. Daher ist weitere Forschung notwendig, um festzustellen, ob die Autophagie-Aktivierung durch Phloretin auch teilweise unabhängig von AMPK erfolgt.

Jüngste Studien zeigten die Bedeutung der Autophagie, um den funktionellen Makrophagen-Phänotyp voranzutreiben. In diesem Zusammenhang wurde die Dysregulation der Autophagie in Makrophagen insbesondere mit dem Ausbruch von Atherosklerose und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht [69-72]. Hier stellen wir eine Verbindung zwischen Phloretin-Behandlung, Autophagie-Induktion und Nrf2-Aktivierung her, indem wir zeigen, dass Phloretin die Nrf2-Aktivierung über p62--vermittelten Abbau von Keap1 fördert. Bis vor kurzem wurde ein Anstieg von p62 puncta als Zeichen einer verminderten Autophagie angesehen, da p62 in Autophagosomen bei Aktivierung der Autophagie abgebaut wird [34]. In diesem Zusammenhang wurde die Akkumulation von p62 mit einer Autophagie-Dysfunktion in atherosklerotischen Läsionen in Verbindung gebracht [73]. Diese Vorstellung wurde jedoch in den letzten Jahren in Frage gestellt und es wird angenommen, dass p62 für die Bildung von Autophagosomen notwendig ist und dass ein Anstieg der p62-Spiegel parallel zu einem Anstieg von LC3Il puncta ein Zeichen für eine Autophagie-Induktion sein kann [74]. Zusammen mit der Fähigkeit von Phloretin, AMPK zu aktivieren, und seiner bekannten Rolle bei der Aktivierung der Autophagie legen unsere Ergebnisse daher nahe, dass die Akkumulation von P62 und LC3 nach der Behandlung mit Bafilomycin A1 in Phloretin-stimulierten Makrophagen auf einen erhöhten autophagischen Fluss und nicht auf eine Beeinträchtigung zurückzuführen ist Autophagie. Interessanterweise haben Lee Y et al. haben kürzlich gezeigt, dass neben der Aktivierung von Nrf2 auch die p62-Bindung an Keapl an der Autophagosomenbildung beteiligt ist, was darauf hindeutet, dass die Phloretin-vermittelte Autophagie-Aktivierung einerseits direkt mit einer erhöhten p62-Aktivität, andererseits aber auch mit einer stärkeren Keapl-p62-Interaktion verbunden ist [ 75]. Keapl ist ein Adapter der Cullin-3--basierten Ubiquitin-Ligase, die unter homöostatischen Bedingungen ein Homodimer mit Nrf2 bildet und dadurch die Nrf2-Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau fördert [76]. Eine Unterbrechung des Keapl-Nrf2-Komplexes führt zu einer Nrf2-Stabilisierung und Translokation in den Zellkern [77, 78]. Es ist gut dokumentiert, dass die Störung dieses Komplexes entweder über die Modifikation von Keapl-Cysteinresten durch elektrophile Moleküle, die direkte Wechselwirkung kleiner Moleküle mit Keapl oder den p62--vermittelten Keapl-Abbau erfolgt [35]. Ying Y et al. schlagen eine direkte Interaktion von Phloretin und Keapl basierend auf In-silico-Experimenten vor, die dann zur Aktivierung des Nrf2-Signalwegs in einer Kardiomyozyten-Zelllinie führt [79]. Hier haben wir einen zusätzlichen Autophagie-bezogenen Mechanismus etabliert, durch den Phloretin Nrf2 aktiviert.

Durch die Verwendung des EAE-Modells stellten wir fest, dass Phloretin die Neuroinflammation in vivo lindert. Unsere Daten deuten stark darauf hin, dass Phloretin EAE verbessert, indem es die durch Makrophagen vermittelte Entzündungsreaktion unterdrückt und den Nrf2-Weg aktiviert. In anderen Krankheitsmodellen wurde von Phloretin auch berichtet, dass es neuroprotektive und immunmodulierende Eigenschaften ausübt. Insbesondere wurde festgestellt, dass Phloretin den Nrf2-Weg im Gehirn bei zerebraler Ischämie aktiviert und die Amyloid-beta-Akkumulation im Ratten-Alzheimer-Krankheitsmodell verringert [80-84]. Phloretin könnte auch andere Immunzellen in vivo beeinflussen, da festgestellt wurde, dass diese Verbindung die Aktivierung von T-Zellen und dendritischen Zellen in vitro hemmt [85, 86]. Da die Neuroinflammation im EAE-Modell nicht ausschließlich Makrophagen-abhängig ist, wäre es von Interesse zu definieren, in welchem ​​Ausmaß die Reduktion der Neuroinflammation durch andere Immunzellen vermittelt wird. Obwohl unsere Daten darauf hindeuten, dass die EAE-Verbesserung hauptsächlich von Makrophagen angetrieben wird und weniger von der Mikroglia-Modulation abhängt, sind diesbezüglich weitere Experimente erforderlich, um aufzuklären, inwieweit Phloretin Mikroglia bei neuroinflammatorischen Erkrankungen beeinflusst. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass Phloretin die Neuroinflammation reduziert, indem es den Phänotyp von Makrophagen beeinflusst, was das therapeutische Potenzial von Phloretin für neuroinflammatorische Erkrankungen zeigt.

Schlussfolgerungen

Unsere Studie zeigt, dass Phloretin ein potenter immunmodulatorischer Wirkstoff ist, der die entzündlichen Eigenschaften von Makrophagen bei neuroinflammatorischen Erkrankungen moduliert. Es wurde festgestellt, dass die Aktivierung des Nrf2-Signalwegs, vermittelt durch AMPK-abhängige Autophagie-Aktivierung und anschließenden Keapl-Abbau, diese Phänotypverschiebung vorantreibt. Daher ist Phloretin ein vielversprechender natürlich vorkommender Wirkstoff, der zur Senkung der Entzündungslast bei neuroinflammatorischen Erkrankungen wie MS eingesetzt werden kann.

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