Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Dent-Krankheit angewendet?

Der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib stellt die Aktinorganisation wieder her und verbessert die Dysfunktion der proximalen Tubuli in vitro und in einem Mausmodell des Lowe-Syndroms und der Dent-Krankheit

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Marine Berquez^1,5, Jonathan R. Gadsby^2,5, Beatrice Paola Festa^1,5, Richard Butler³ , Stephen P. Jackson², Valeria Berno⁴, Alessandro Luciani1, Olivier Devuyst^1,6und Jennifer L. Galopp^2,6

SCHLÜSSELWÖRTER: Zytoskelett; Endozytose; Lipide; proximalen Tubulus; renales Fanconi-Syndrom

Loss-of-Function-Mutationen im OCRL-Gen, das für Phosphatidylinositol [PI] 4,5-bisphosphat [PI(4,5)P2] 5-Phosphatase OCRL kodiert, verursachen eine defekte Endozytose und eine Dysfunktion der proximalen Tubuli inLowe-Syndrom und Dent-Krankheit2. Der Defekt ist auf erhöhte PI(4,5)P2-Spiegel und eine abweichende Aktinpolymerisation zurückzuführen, wodurch der endosomale Transport blockiert wird. PI 3--Phosphat [PI(3)P] wurde kürzlich als Coaktivator mit PI(4,5)P2 im Aktinweg identifiziert. Hier haben wir die Hypothese getestet, dassPhosphoinositid-3-kinase(PI3K)-Inhibitoren können den durch OCRL-Verlust verursachten endozytischen Defekt retten, indem sie die Phosphoinositid-Signale an die Aktin-Maschinerie neu ausbalancieren. Der Breitband-PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitor Copanlisib und Klasse IA p110a PI3K(Phosphoinositid 3-kinase) Inhibitor Alpelisibreduzierte aberrante Aktinpolymerisation in OCRL-defizienten menschlichen Nierenzellen in vitro. Die Spiegel von PI 3,4, 5--Triphosphat, PI(4,5) P2 und PI(3)P wurden alle durch die Alpelisib-Behandlung reduziert, und der siRNA-Knockdown der katalytischen PI3K-Untereinheit p110a phänokopierte den Aktin-Phänotyp. In einem humanisierten OcrlY/--Mausmodell reduzierte Alpelisib die endosomale Aktinfärbung, während es die Stressfaserarchitektur und die Megalinspiegel an der Plasmamembran proximaler Tubuluszellen wiederherstellte, was sich in einer verbesserten endozytischen Aufnahme von niedermolekularen Proteinen in vivo widerspiegelte. Somit unterstützen unsere Ergebnisse den Zusammenhang zwischen Phosphoinositid-Lipiden, Aktinpolymerisation und endozytischem Transport im proximalen Tubulus und stellen einen Proof-of-Concept für die Umnutzung von Alpelisib darLowe-Syndrom/Dent-Krankheit2.

Übersetzungserklärung

Lowe-Syndrom und Dent-Krankheit2, verursacht durch Mutationen in der Phosphoinositid-Lipid-5--Phosphatase OCRL, manifestiert sich mit proximaler Tubulusfunktionsstörung und niedermolekularer Proteinurie, wobei nur unterstützende Maßnahmen zur Verfügung stehen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass diePhosphoinositid-3-kinase Inhibitor Alpelisib, das derzeit für die Krebstherapie zugelassen ist, lindert das mit dem OCRL-Verlust verbundene anormale Phosphoinositid-Gleichgewicht und den Actin-Phänotyp, was zu einer wesentlichen Verbesserung der endozytischen Maschinerie und der Absorptionskapazität in zellulären Systemen und einem humanisierten Mausmodell für das Lowe-Syndrom / die Dent-Krankheit führt 2. Angesichts seines offensichtlichen Sicherheitsprofils ist Alpelisib ein vielversprechender Kandidat für die Umwidmung von Arzneimitteln inLowe-Syndrom und Dent-Krankheit.

Epithelzellen, die die proximalen Tubuli (PTs) der Niere auskleiden, besitzen einen effizienten rezeptorvermittelten endolysosomalen Weg, der essentielle Substanzen, die durch den Glomerulus gefiltert werden, zurückgewinnt und verarbeitet. Angeborene Störungen, die Endolysosomen betreffen, verursachen eine PT-Dysfunktion (renales Fanconi-Syndrom) mit Urinverlust von gelösten Stoffen und Proteinen mit niedrigem Molekulargewicht (LMW), die oft durch Stoffwechsel- und Wachstumskomplikationen und die Entwicklung einer chronischen Nierenerkrankung kompliziert werden.¹Die inaktivierende Mutation in OCRL wurde mit der Dent-Krankheit 2 (MIM #300555), einer Störung, die durch PT-Dysfunktion, Nierensteine ​​und fortschreitendes Nierenversagen gekennzeichnet ist, und mit dem okulozerebrorenalen Syndrom von Lowe (MIM #309000), das zusätzlich auftritt, in Verbindung gebracht zum PT Dysfunktion und Nierenversagen, systemische Manifestationen wie angeborene Katarakte, kognitive Behinderung und Hypotonie.^2-4Aktuelle Behandlungen für Dent-Krankheit 2 und Lowe-Syndrom sind nur unterstützend.

Abbildung 1|PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren lindern die anormale Aktin-Assemblierung an Endosomen in einem OCRL-defizienten menschlichen Nierenzellmodell (HK2). (a) Für diese Studie relevante Schritte der Phosphoinositid-Lipidumwandlung, die die Umwandlungen zwischen PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P2 und PI(3)P angeben, wobei die relevantesten Enzyme fett gedruckt sind, am relevantesten Konvertierungen in durchgezogenen Linien und andere in gestrichelten Linien. PI(4,5)P2 ist beim Lowe-Syndrom aufgrund der fehlenden 5--Phosphatase-Aktivität von OCRL erhöht und wird durch die Phosphorylierung von PI durch Phosphatidylinositol-4--Kinasen (PI4Ks) und PI(4) hergestellt. P 5--Kinase (PIP5K). PI(4,5)P2 wird durch PI3Ks der Klasse I phosphoryliert, um PI(3,4,5)P3 zu produzieren. PI(3,4,5)P3 kann durch PTEN zu PI(4,5)P2 oder durch SH-2-haltige Inositol-50-Polyphosphate (SHIP) 1 und 2 zu PI(3,4)P2 dephosphoryliert werden, Synaptojanin 1 und 2 und auch OCRL, obwohl dies (Fortsetzung)

Abbildung 1|(Fortsetzung) für gering gehalten. PI(3,4)P2 wird durch Inositpolyphosphat-4-phosphatase Typ IA (INPP4A) und B zu PI(3)P dephosphoryliert. PI(3)P wird auch an Endosomen über die Phosphorylierung von PI durch Klasse III hergestellt PI3K(Phosphoinositid 3-kinase), vakuoläres Sortierprotein Vps34. (b) Western Blots, die den Verlust der OCRL-Expression in der HK2-OCRL-CRISPR-Knockout-Zelllinie (KO) im Vergleich zu Wildtyp-(WT)-HK2-Kontrollzellen mit Tubulin als Ladekontrolle veranschaulichen. (c–e) Repräsentative konfokale Airyscan-Aufnahmen und Quantifizierung der Überlappung von frühem Endosomen-Antigen 1 (EEA1)/Aktin (ausgedrückt als Prozentsatz der insgesamt nachgewiesenen EEA1þ-Vesikel) für HK2 WT- oder OCRL KO-Zellen, die entweder mit Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt wurden (d) oder dem angegebenen Inhibitor und mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fix fixiert. In allen Fällen veranschaulichen die Bilder einen einzelnen Z-Schnitt aus einem Airyscan-verarbeiteten konfokalen Stapel von Zellen, die für EEA1 (gelb), Phalloidin (Aktin, Magenta) und 40,6-diamidino{ {14}}Phenylindol (DAPI) (Cyan). Stangen =5 mm. In den Quantifizierungen geben die Linien den Mittelwert ± SEM an und jeder Datenpunkt ist eine einzelne Zelle. In allen Experimenten wurden Behandlungen 16 Stunden vor der Fixierung angewendet. Bei allen Quantifizierungen wurde die statistische Signifikanz durch eine Kruskal-Wallis (KW)-Varianzanalyse mit Dunns multiplem Vergleichstest bewertet. (c) WT- oder KO-Zellen, die entweder mit DMSO oder 100 nM Copanlisib behandelt wurden, was die Rettung der Actin-endosomalen Überlappung zeigt. KW-Test: ***P < 0.0{{50}}1,="" mehrfachvergleiche;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" copanlisib="" beide="" ***p="">< 0.001,="" wt="" copanlisib="" versus="" ko="" copanlisib="" p="0.44" (nicht="" signifikant="" [ns]).="" n="52," 85,="" 67="" und="" 63="" zellen="" für="" wt-dmso,="" wt-copanlisib,="" ko-dmso="" bzw.="" ko-copanlisib.="" (d)="" wt-="" oder="" ko-zellen,="" die="" entweder="" mit="" dmso="" oder="" 10="" mm="" alpelisib="" behandelt="" wurden,="" was="" die="" rettung="" der="" actin-endosomalen="" überlappung="" zeigt.="" kw-test:="" ***p="">< 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt-dmso="" versus="" ko-dmso,="" ko-dmso="" versus="" ko-alpelisib,="" beide="" ***p="">< 0,001,="" wt-alpelisib="" versus="" ko-alpelisib.="" p=""> 0,99 (ns). N=31, 30, 43 und 41 Zellen für WT-DMSO, WT-Alpelisib, KO-DMSO bzw. KO-Alpelisib. (e) WT- oder KO-Zellen, die entweder mit DMSO, 10 mM GSK2636771 oder 10 mM Idelalisib behandelt wurden, was zeigt, dass keine der Verbindungen in der Lage ist, die Actin-endosomale Überlappung signifikant zu reduzieren. KW-Test: ***P < 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt-dmso="" versus="" ko-dmso,="" ***p="">< 0,001,="" ko-dmso="" versus="" ko-gsk,="" *p{="0.04," ko-dmso="" versus="" ko-idelalisib,="" p=""> 0,99 (ns). N=159, 130, 203, 122, 131 und 145 Zellen für WT DMSO, WT GSK2636771, WT Idelalisib, KO DMSO, KO GSK2636771 bzw. KO Idelalisib. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org

Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent angewendet?

LMW-Proteinurie ist ein konsistentes Merkmal, das beim Lowe-Syndrom/Morbus Dent 2 beobachtet wird, was zeigt, dass OCRL die Rezeptor-vermittelte Endozytose beeinflusst.⁵OCRL codiert das Phosphatidylinositol (PI) 4,5-Bisphosphat [PI(4,5)P2] 5- Phosphatase OCRL,⁶das die Lipididentität im endolysosomalen Weg durch den Abbau von PI(4,5)P2 kontrolliert (Abbildung 1a). Ein mangelhafter Abbau von PI(4,5)P2 durch OCRL ist mit dem Scheitern der Enthüllung von Clathrin-beschichteten Vesikeln in Fibroblasten verbunden, begleitet von der Bildung von "Kometen"-Strukturen aus polymerisiertem, fadenförmigem Aktin aus den resultierenden aberranten frühen Endosom-ähnlichen Organellen.^7-9In anderen Zelltypen, insbesondere den PT-Zellen der Niere, führt ein OCRL-Mangel zu F-Aktin-„Korb“-Strukturen, die abweichende endolysosomale Organellen umgeben.¹⁰Das überschüssige F-Aktin blockiert den Membrantransport durch den endozytischen und endolysosomalen Weg und soll das Recycling des Multiligand-Rezeptors Megalin zur apikalen Membran verringern, wodurch der Defekt im endolysosomalen Weg verschlimmert wird.¹¹In Übereinstimmung mit einer Hauptrolle von aberrantem F-Aktin wird die durch OCRL-Mutationen verursachte fehlerhafte endozytische Aufnahme durch Angriffe auf die Aktinmaschinerie mit Latrunculin B oder durch Depletion von Actin-Regulatorproteinen sowie durch kleine, interferierende RNA (siRNA)-vermittelte Depletion gemildert von PI(4)P 5--Kinase, um die Synthese von PI(4,5)P2 einzustellen^7,10(Abbildung 1a).

Aktin-Polymerisation wird zunehmend so verstanden, dass sie nicht nur von PI(4,5)P2, sondern auch von anderen Phosphoinositid-Lipiden ausgeht. Beispielsweise aktiviert PI(3,4,5)P3 die GTPase Rac vom Rho-Typ, und PI(3)P wirkt in Verbindung mit PI(4,5)P2, um die Aktinpolymerisation stromabwärts einer anderen GTPase vom Rho-Typ, Cdc42, zu stimulieren.^12-14Die gegenseitige Umwandlung dieser Phosphoinositide ist an die Bewegung von Lipiden über den endozytischen und endosomalen Weg gekoppelt. PI(4,5)P2 wird durch Klasse-I-Phosphatidylinositol- 30 --Kinase (PI3K) zu PI(3,4,5)P3 an der Plasmamembran phosphoryliert und wird zunehmend zu PI(3,4)P2 und PI dephosphoryliert (3)P oder PI(4,5)P2.^14,15PI(3)P wird an Endosomen angereichert, wo es für deren Funktion essentiell ist, und überwiegend durch direkte Phosphorylierung von PI durch PI3K der Klasse III hergestellt (Phosphoinositid 3-kinase), Vps34¹⁶(Abbildung 1a). In einer OCRL-defizienten retinalen pigmentierten Epithelzelllinie (RPE) werden die erzeugten Actin-Kometen durch die Behandlung mit PI3K reduziert (Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren Wortmannin und Vps34-IN1, in Übereinstimmung mit biochemischen Studien, die eine Co-Regulation von Aktin über das Zusammentreffen von sowohl PI(3)P als auch PI(4,5)P2 zeigen.¹⁴

Die Rettung der Endozytose, die beobachtet wurde, wenn die Aktinmaschinerie in OCRL-Patienten- und Knockout-Zellen (KO) angegriffen wurde,^7,10zusammen mit der vorgeschalteten Regulation von Aktin durch PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Aktivität¹⁴und die stark vernetzte Natur der PI-Umwandlung bietet eine faszinierende Möglichkeit, dass Klasse-I-PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren können beim Lowe-Syndrom von Nutzen sein. Solche Inhibitoren, die für die Krebstherapie entwickelt wurden, sind für den klinischen Einsatz zugelassen¹⁷und sind daher möglicherweise für die Wiederverwendung von Arzneimitteln geeignet. Obwohl Verbindungen wie Copanlisib¹⁸Da sie eine breite Spezifität und Nebenwirkungen haben, wurden kürzlich Erfolge für spezifischere Inhibitoren gezeigt. Idelalisib,¹⁹die auf PI3K abzielt (Phosphoinositid 3-kinase)Die Untereinheit p110d ist für das chronische lymphatische Lymphom zugelassen, und Alpelisib, das auf p110a abzielt, ist für die Anwendung bei Brustkrebs zugelassen.^20,21Darüber hinaus hat Alpelisib einen klinischen Nutzen bei Kindern mit PROS/CLOVES-Syndrom gezeigt,²²ein seltenes Überwucherungssyndrom, das aus der Aktivierung von PIK3A resultiert.

Hier haben wir die Hypothese getestet, dass Klasse I PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren können den Endozytosedefekt aufgrund des Verlusts von OCRL unter Verwendung etablierter Zell- und Mausmodelle retten.^10,11,23Wir zeigen, dass die Hemmung von PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Aktivität über Copanlisib oder Alpelisib oder die siRNA-vermittelte Depletion der katalytischen Alpelisib-Zieluntereinheit p110a reduziert die übermäßige Aktinpolymerisation in menschlichen Nierenzellen (HK2), die OCRL-defizient sind. Wir konzentrieren uns auf Alpelisib als die spezifischste Verbindung für die klinische Anwendung und zeigen, dass sie die Aktinpolymerisation reduziert und die Aufnahme über den endolysosomalen Weg in PT-Zellen aus humanisiertem Ocrl verbessert^Y/-Mäuse in vitro. Darüber hinaus lindert die Alpelisib-Behandlung in vivo die Proteinurie, reduziert die PT-Dysfunktion und rettet die zellulären Megalinspiegel in humanisiertem Ocrl^Y/-Mäuse. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass Alpelisib ein Kandidat für die Wiederverwendung von Arzneimitteln istLowe-Syndrom und Dent-Krankheit 2.

Abbildung 2|Die Wirkung von Alpelisib auf Aktin ist dosisabhängig und wird durch die siRNA von PI3K rekapituliert (Phosphoinositid 3-kinase)p110a. (a) Repräsentative konfokale Airyscan-Aufnahmen (fixiert mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix und immunmarkiert für frühes Endosomen-Antigen 1 [EEA1], gelb; Aktin [Phalloidin], magenta; und 4{{40}},{{ 5}}Diamidino-2-phenylindol [DAPI], Cyan; Balken=5 mm) und Quantifizierung von Wildtyp- (WT) oder Knockout- (KO) menschlichen Nierenzellen (HK2), die mit Dimethylsulfoxid (DMSO) behandelt wurden oder die angegebenen Dosen von Alpelisib für 16 Stunden, was eine dosisabhängige Rettung der Aktin-endosomalen Überlappung zeigt. In allen Fällen geben die Linien den Mittelwert ± SEM und die Punkte die einzelnen Zellen an. N=31, 30, 71, 42, 90, 89, 41, 69, 66 und 67 Zellen zur WT-Kontrolle, WT 10 mM, WT 50 mM, KO DMSO und KO 2,5, 5, 10, 15, 25 bzw. 50 mM Alpelisib. Statistische Signifikanz, bewertet durch den Kruskal-Wallis (KW)-Test mit Dunns multiplem Vergleichstest: insgesamt ***P < 0,001,="" multiple="" vergleiche;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 5,="" 15,="" 25="" und="" 50="" mm="" alpelisib="" alle="" ***p="">< 0,001,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" mm="" alpelisib="" *p="0.0131," ko="" dmso="" versus="" ko="" 10="" mm="" alpelisib="" **p="0.0043," wt="" dmso="" versus="" sowohl="" wt="" 10="" als="" auch="" 50="" mm="" alpelisib="" p=""> 0,9999 (nicht signifikant [ns]). (b) Western Blot für p110a und die Ladekontrolle a-Tubulin von WT- oder KO-Zellen, die entweder mit Scramble (Scram.) oder p110a-siRNA behandelt wurden. (c) Repräsentative konfokale Airyscan-Aufnahmen (fixiert mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fix und immunmarkiert für EEA1, gelb; Aktin [Phalloidin], magenta; und DAPI, cyan; Balken =5 mm) und Quantifizierung der behandelten WT- oder KO-Zellen entweder mit Scramble (S) oder p110a-siRNA, was die Verringerung der EEA1--Aktin-Überlappung bei p110a-Verarmung demonstriert. KW-Test mit Mehrfachvergleichstest nach Dunn: ***P < 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt="" scramble="" vs.="" ko="" scramble,="" ko="" scramble="" vs.="" ko="" p110a="" sirna="" beide="" ***p="">< 0,001.="" n="79," 108,="" 93="" bzw.="" 131="" zellen.="" hk2,="" menschliche="" niere;="" pi3k,="" phosphatidylinositol-30="" -kinase;="" sirna,="" kleine,="" interferierende="" rna.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Abbildung 3|Die Spiegel von Phosphatidylinositol (PI) 4,5-Bisphosphat [PI(4,5)P2] sind bei OCRL-Knockout (KO) und PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 erhöht und PI(3)P werden durch die Behandlung mit Alpelisib unterdrückt. In allen Experimenten wurden die angegebenen Behandlungen 16 Stunden vor der Fixierung angewendet. In den Quantifizierungen geben die Linien den Mittelwert ± SEM an, und jeder Datenpunkt resultiert aus einer einzelnen Zelle. Bei allen Quantifizierungen wurde die statistische Signifikanz durch eine Kruskal-Wallis (KW)-Varianzanalyse mit Dunns multiplem Vergleichstest bewertet. Balken =20 mm in allen Bildern. (a) Repräsentative Weitfeld-Mikrofotografien von Wildtyp- (WT) oder menschlichen KO-Nierenzellen (HK2), die mit Dimethylsulfoxid (DMSO) oder 10 mM Alpelisib behandelt und dann mit dem Plasmamembran-Fifix fixiert und für PI(3,4,5) immunmarkiert wurden )P3 (rot) und 40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (cyan), mit Quantifizierung der mittleren zellulären PI(3,4,5)P3-Markierungsintensität, die die Wirksamkeit von Alpelisib zeigt Behandlung der PI(3,4,5)P3-Synthese. N=96, 128 und 109 Zellen für WT-DMSO, WT-Alpelisib, KO-DMSO bzw. KO-Alpelisib. KW (Fortsetzung)

Abbildung 3|(Fortsetzung) Test: insgesamt ***P < 0.001,="" multiple="" vergleiche;="" wt-dmso="" versus="" ko-dmso,="" wt-dmso="" versus="" wt-alpelisib="" und="" ko-dmso="" versus="" ko-alpelisib,="" alle="" ***p="">< 0.0{{70}}1.="" (b)="" repräsentative="" konfokale="" mikroaufnahmen="" von="" wt-="" oder="" ko-hk2-zellen,="" die="" 16="" stunden="" lang="" entweder="" mit="" dmso,="" 1="" 0="" mm-="" oder="" 50-="" mm="" alpelisib="" behandelt="" und="" dann="" mit="" dem="" golgi-fix="" fixiert="" und="" mit="" dem="" m="" ch="" markiert="" wurden="" {{10}}xfyve="" pi(3)p-sonde="" (magenta)="" und="" dapi="" (cyan),="" mit="" quantifizierung="" der="" anzahl="" von="" pi(3)p-positiven="" puncta,="" die="" in="" zellen="" nachgewiesen="" wurden,="" die="" mit="" einer="" reihe="" von="" alpelisib-konzentrationen="" behandelt="" wurden="" ,="" wie="" angegeben,="" was="" zeigt,="" dass="" pi(3)p-positive="" punkte="" in="" einer="" dosisabhängigen="" weise="" reduziert="" werden.="" n="280," 254,="" 210,="" 287,="" 324,="" 239,="" 340,="" 250,="" 240="" und="" 215="" zellen="" zur="" wt-kontrolle,="" wt="" 10="" mm,="" wt="" 50="" mm,="" ko="" dmso="" und="" ko="" 2,5,="" 5,="" 10,="" 25="" bzw.="" 50="" mm="" alpelisib.="" kw-test:="" gesamt="" ***p="">< 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt="" dmso="" versus="" ko="" dmso,="" wt="" dmso="" versus="" wt="" 10="" und="" 50="" mm="" alpelisib,="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 50="" mm="" alpelisib="" alle="" ***p="">< 0,001;="" ko="" dmso="" versus="" ko="" 2,5="" und="" 5="" mm="" alpelisib,="" beide="" p=""> 0,9999 (nicht signifikant [ns]); KO DMSO versus KO 10 mM Alpelisib **P=0.0049; KO DMSO versus KO 25 mM Alpelisib ***P=0.0002. (c) Repräsentative Weitfeld-Mikrofotografien von WT- oder KO-HK2-Zellen, die mit DMSO oder 10 mM Alpelisib behandelt und dann mit dem Plasmamembran-Fifix fixiert und für PI(4,5)P2 (gelb) und DAPI (cyan) immunmarkiert wurden, mit Quantifizierung von die mittlere zelluläre PI(4,5)P2-Markierungsintensität, die einen erhöhten Plasmamembran-PI(4,5)P2 in KO-Zellen zeigt, der durch die Behandlung mit Alpelisib reduziert wird, insbesondere in KO-Zellen. N=126, 112, 85 und 116 Zellen für WT-DMSO, WT-Alpelisib, KO-DMSO bzw. KO-Alpelisib. KW-Test: Gesamt ***P < 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt-dmso="" versus="" ko-dmso="" und="" ko-dmso="" versus="" ko-alpelisib,="" beide="" ***p="">< 0,001;="" wt-dmso="" versus="" wt-alpelisib="" p="0.4752" (ns).="" (d)="" repräsentative="" weitfeld-mikrofotografien="" von="" wt-="" oder="" ko-hk2-zellen,="" die="" mit="" dmso="" oder="" 10="" mm="" alpelisib="" behandelt="" und="" dann="" mit="" dem="" 4-prozentigen="" formaldehyd-fifix="" fixiert="" und="" für="" pi(4,5)p2="" (gelb)="" und="" dapi="" (cyan)="" immunmarkiert="" wurden,="" mit="" quantifizierung="" der="" anzahl="" der="" pi(4,5)p2--positiven="" punkte,="" die="" erhöhte="" pi(4,5)p2-punkte="" in="" ko-zellen="" zeigen,="" die="" durch="" die="" behandlung="" mit="" alpelisib="" reduziert="" werden,="" insbesondere="" in="" ko-zellen.="" n="75," 65,="" 52="" und="" 69="" zellen="" für="" wt-dmso,="" wt-alpelisib,="" ko-dmso="" bzw.="" ko-alpelisib.="" kw-test:="" gesamt="" ***p="">< 0,001,="" mehrfachvergleiche;="" wt-dmso="" versus="" ko-dmso="" und="" ko-dmso="" versus="" ko-alpelisib,="" beide="" ***p="">< 0,001;="" wt-dmso="" versus="" wt-alpelisib="" p=""> 0,99 (ns). au, willkürliche Einheiten. Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent angewendet?

1. ERGEBNISSE

1.1 PI3K-Inhibitoren der Klasse I reduzieren die Aktinaggregation in OCRL-KO HK2-Zellen

Wir verwendeten CRISPR-Cas9-Geneditierung zum Knockout (KO) OCRL in der HK2-Zelllinie, um das Testen von PI3K der Klasse I zu ermöglichen (Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren auf die charakteristische Aktinaggregation an endolysosomalen Kompartimenten.^7,9,10,14Western-Blotting bestätigte eine 98,0±0,7-prozentige Reduktion der OCRL-Expression in Lysaten aus den KO-HK2-Zellen (Abbildung 1b). Der OCRL KO rekapitulierte den Aktin-Korb-Phänotyp in den HK2-Zellen, wie durch eine erhöhte Überlappung zwischen F-Aktin und frühem Endosomen-Antigen 1 (EEA1) angezeigt, quantifiziert auf konfokalen Airyscan-Mikroskopie-Z-Stapeln (Abbildung 1c–e). Diese erhöhte Überlappung, die bei OCRL-KO-Zellen beobachtet wurde, wurde durch die Behandlung mit Copanlisib (C), einem Breitband-PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitor, der auf p110a und d und in geringerem Maße auf die p110b- und g-Isoformen abzielt (Abbildung 1c). Durch Western-Blotting von HK2-Ganzzellextrakten fanden wir, dass die PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Die regulatorischen p110-Untereinheiten a, b und d wurden alle sowohl in Wildtyp- (WT) als auch in KO-Zellen gut exprimiert, wobei nur Spuren der p110g-Isoform vorhanden waren (ergänzende Abbildung S1A).

Wir haben den PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Spezifität der Hemmung von F-Aktin mit Alpelisib (A), einem selektiven Inhibitor von p110a, und GSK2636771 (G) und Idelalisib (I), selektiven Inhibitoren von p110b bzw. p110d (ergänzende Abbildung S1A). Obwohl die Alpelisib-Behandlung im Vergleich zu Copanlisib zu einer ähnlichen Verringerung der endosomalen Aktinpolymerisation führte (Abbildung 1d), hatten GSK2636771 und Idelalisib eine geringe Wirkung auf die Aktinakkumulation (Abbildung 1e). Die Klasse I PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren hatten keine erhöhte Toxizität für OCRL KO im Vergleich zu nicht modifizierten Zellen, basierend auf dem MTT-Assay (ergänzende Abbildung S1B).

1.2 Alpelisib und p110a-Knockdown retten den Actin-Phänotyp in HK2-Zellen

Für unsere anschließenden Studien konzentrierten wir uns auf Alpelisib, da es das selektivste und am wenigsten toxische PI3K ist (Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitor entwickelt und wird derzeit zur Behandlung einer Mosaik-Überaktivierung von PI3K Klasse Ia bei Kindern mit PROS/CLOVES-Syndrom eingesetzt.²²Alpelisib reduzierte die Aktinkörbe in OCRL-KO-HK2-Zellen dosisabhängig (Abbildung 2a). Die Wirkungen wurden bei einer Dosierung von 10 mM bereits 4 Stunden nach der Behandlung ohne offensichtliche Toxizität beobachtet (ergänzende Abbildung S2). Um zu testen, ob PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Da die Hemmung durch Alpelisib die Ursache für die verringerte Aktinfärbung war, reduzierten wir spezifisch ihr Ziel, die p110a-Untereinheit, mithilfe von siRNA (Abbildung 2b). Verglichen mit der Behandlung mit einer Kontroll-siRNA (sequenzverwürfelt) ergab siRNA gegen p110a eine 78,3±4,8-prozentige bzw. 68,9±7,7-prozentige Depletion des p110a-Proteins in WT- bzw. OCRL-KO-HK2-Zellen, was sich in einer signifikanten Verringerung der Aktinkörbe widerspiegelt ( Abbildung 2c).

1.3 Reduzierte Spiegel von PI(3,4,5)P3, PI(4,5)P2 und PI(3)P in mit Alpelisib behandelten HK2-Zellen

Um zu untersuchen, wie Phosphoinositid-Lipide durch die Behandlung mit OCRL KO und Alpelisib beeinflusst werden, haben wir HK2-Zellen mit Antikörpern oder Proteindomänen gegen PI(3,4,5)P3, PI(3)P und PI(4,5)P2 gefärbt optimierte Fixierungsbedingungen für die Plasmamembran oder intrazelluläre Färbung.^24,25PI(3,4,5)P3 hat eine diffuse Lokalisation an der Plasmamembran, und die Behandlung mit Alpelisib (10 mM) induzierte eine deutliche Abnahme der Färbung für PI(3,4,5)P3 sowohl in WT- als auch in OCRL-KO-Zellen, wie aufgrund seines Wirkmechanismus und seiner Spezifität für Klasse IA PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)p110a (Abbildung 3a). Es wird erwartet, dass PI(3,4,5)P3 schrittweise dephosphoryliert wird, wenn Membranen endocytiert und in Endosomen transportiert werden.^14,26,27Indem Zellen so fixiert werden, dass intrazelluläres PI(3)P erhalten bleibt,²⁵Wir fanden heraus, dass PI(3)P-Punkte auch durch die Alpelisib-Behandlung reduziert wurden (in einer dosisabhängigen Weise, die aus Konzentrationen von nur 10 mm für die 16--stündige Behandlung ersichtlich ist) sowohl in WT- als auch in OCRL-KO-Zellen (Abbildung 3b und ergänzende Abbildung S2C). Wie erwartet induzierte der KO von OCRL in HK2-Zellen einen deutlichen Anstieg der PI(4,5)P2-Spiegel sowohl an der Plasmamembran (Abbildung 3c) als auch intrazellulär (Abbildung 3d) im Vergleich zu WT-Zellen.^10,28Die Behandlung mit Alpelisib reduzierte die durch OCRL KO erzeugte Erhöhung von PI(4,5)P2 in beiden Kompartimenten deutlich, während sie keine Wirkung auf WT-Zellen hatte (Abbildung 3c und d). Es wird berichtet, dass Alpelisib PI 4--Kinase b mit einer 50-prozentigen Hemmkonzentration von 0,5 mM hemmt,¹⁹was eine mögliche Quelle für die Verringerung von PI(4,5)P2 ist. Insgesamt legten unsere Daten nahe, dass Alpelisib die Aktin-Assemblierung auf OCRL-KO-Endosomen über eine bispezifische Wirkung auf die PI(4,5)P2- und PI(3)P-Spiegel hemmt.

Abbildung 4|Alpelisib lindert Aktindefekte von Oral in kultiviertem humanisiertem Ocrl^Y/-Maus-PTCs (m PTCs). (a) Repräsentative konfokale Z-Projektionsmikroskopaufnahmen mit maximaler Intensität von OcrlY/þ oder Ocrl^Y/-m PTCs, die 16 Stunden lang mit Dimethylsulfoxid (DMSO) oder 10 mM Alpelisib behandelt und dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für Aktin (Phalloidin) (weiß) und 40,6-Diamidino-2-phenylindol immunmarkiert wurden (DAPI) (blau), mit Quantifizierung des Ausmaßes, in dem Stressfasern in jedem Zustand vorhanden sind, was zeigt, dass Stressfasern in Ocrl verloren gehen^Y/-m PTCs werden durch Alpelisib-Behandlung gerettet. Die Linien geben Mittelwerte ± SEM an, und die Datenpunkte zeigen jede Bildgebungsregion an: N=5 Bildgebungsregionen pro Bedingung (jeweils mit etwa 15–20 Zellen). Die Signifikanz wurde durch gewöhnliche 1--Weg-Varianzanalyse (ANOVA) mit Holm-Sidaks Mehrfachvergleichstest, **P=0.001, Mehrfachvergleiche; Ocrl Y/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO**

P=0.002, Okrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib **P=0.004, OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/- Alpelisib P=0.50 (nicht signifikant [ns]). Stangen =20 mm. (b) Repräsentative 3D-Oberflächendarstellungen mit hoher Vergrößerung von Ocrl m PTCs, die 16 Stunden lang mit DMSO oder 10 mM Alpelisib behandelt und dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für frühes Endosomen-Antigen 1 (EEA1) (lila), Aktin (lila) immunmarkiert wurden ( Phalloidin, gelb) und DAPI (blau) und Quantifizierung, die die Rettung der Aktin-endosomalen Überlappung durch Alpelisib veranschaulicht. Ansichten mit geringerer Vergrößerung zeigen Übersichten über (Fortsetzung)

Abbildung 4|(Fortsetzung) Diese Regionen sind in der ergänzenden Abbildung S4B und den ergänzenden Filmen S1–S3 dargestellt. Die Linien geben den Mittelwert ± SEM an. N=42, 47 und 45 zufällig ausgewählte Felder für OcrlY/þ þ DMSO, Ocrl^Y/-þ DMSO und Ocrl^Y/-Jeweils þ Alpelisib-Zustände, jeweils gepoolt aus 4 Mäusenieren pro Zustand. Die Signifikanz wurde durch Kruskal-Wallis (KW) ANOVA mit Dunns multiplem Vergleichstest getestet: insgesamt ***P < 0,001,="" multiple="" vergleiche;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-Alpelisib P > 0,99 (ns). Stangen =1 mm. (c) Repräsentative konfokale Mikroaufnahmen von OcrlY/þ oder Ocrl^Y/-m PTCs, die mit DMSO oder 10- mM Alpelisib behandelt und dann mit dem Golgi-Fix fixiert und mit der m Ch-2 xFYVE PI(3)P-Sonde (Magenta) und DAPI (Cyan) markiert wurden, mit Quantifizierung von die Anzahl der in Zellen nachgewiesenen PI(3)P-positiven Punkte. N=188, 177, 246 und 206 Zellen aus OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO und Ocrl^Y/-þ Alpelisib; Zellen wurden aus 3 oralen Nieren pro Gruppe gepoolt. KW-Test: Gesamt ***P < 0.001,="" mehrfachvergleiche;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ Alpelisib und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib, alle ***P < 0.001.="" stangen="20" mm.="" (d)="" repräsentative="" konfokale="" mikroaufnahmen="" von="" ocrly/þ="" oder="">^Y/-m PTCs, die 16 Stunden lang mit DMSO oder 10 mM Alpelisib behandelt wurden, dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für Phosphatidylinositol (PI) 4, 5--Bisphosphat [PI(4,5) P2] (gelb) und DAPI immunmarkiert wurden (Cyan), mit Quantifizierung der Anzahl von PI(4,5)P2--positiven Punkten, die erhöhte PI(4,5)P2-Punkte in Ocrl zeigen^Y/-Zellen, die durch die Behandlung mit Alpelisib reduziert werden. N=477, 444, 423 und 494 von OcrlY/þ þ DMSO, OcrlY/þ þ alpelisib, Ocrl^Y/-þ DMSO und Ocrl^Y/-þ Alpelisib; Zellen wurden aus 3 oralen Nieren pro Gruppe gepoolt. KW-Test: Gesamt ***P < 0.001,="" mehrfachvergleiche;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO, OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ Alpelisib und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib, alle ***P < 0.001.="" stangen="20" mm.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

1.4 Alpelisib reduziert intrazelluläre Phosphoinositide und lindert Zytoskelettdefekte bei Ocrl^Y/-m PTCs

Als nächstes testeten wir, ob Alpelisib die gleichen Wirkungen in Primärzellen von PT-Zellen hatte, die aus dem humanisierten ocrldefizienten Mausmodell (Ocrl^Y/-), die die abnormale Aktinpolymerisation und den endozytischen Defekt rekapituliert, die in von Patienten stammenden Zellen beobachtet wurden.^10,11Die Maus-PTCs (m PTCs) exprimierten ähnlich wie Klasse I PI3K(Phosphoinositid-3-kinase) regulatorische Untereinheiten zu HK2-Zellen sowohl in WT als auch in Ocrl^Y/-Mäuse und zeigten ein ähnliches Toxizitätsprofil gegenüber Alpelisib, wenn es durch MTT-Assays bewertet wurde (ergänzende Abbildung S3). Die Bildgebung durch konfokale Mikroskopie zeigte eine auffällige Störung der normalen F-Aktin-Stressfaserarchitektur in m PTCs von Ocrl^Y/-im Vergleich zu OcrlY/þ-Mäusen, wahrscheinlich aufgrund der Verlagerung von Actin-Regulatorproteinen von ihren normalen zellulären Orten zu Endosomen, da große Actin-Ansammlungen diese Organellen umgeben und als Ursprung des Transportdefekts angesehen werden.^10,29Behandlung von Ocrl^Y/- m PTCs mit Alpelisib (10 mM) stellten die Spannungsfaserarchitektur wieder her (Abbildung 4a).

Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent angewendet?

Als Hauptproblem inLowe-Syndrom und Dent-Krankheit2 verringerter endosomaler Transport und daraus resultierender Abbau von Megalin ist, haben wir versucht, endosomales Aktin von den Stressfasern zu unterscheiden. Wir sammelten konfokale Z-Stapel mit Laserscanning in den Zellen, rekonstruierten das Färbemuster in 3D-Oberflächendarstellungen und verwendeten Größenform / -parameter, um punktförmige Aktinstrukturen und den Grad ihrer Überlappung mit endosomalen Strukturen zu identifizieren (ergänzende Abbildung S4 und Filme S1 –S3). Diese Analyse ergab, dass die Behandlung mit Alpelisib die aberrante Polymerisation von F-Aktin an mit EEA1 gefärbten Endosomen verringerte, die sich von der Stressfaserarchitektur unterscheiden (Abbildung 4b). Die von Ocrl abgeleiteten m PTCs^Y/-Mäuse zeigten signifikante Veränderungen in der intrazellulären Färbung für PI(3)P (verringert) und PI(4,5)P2 (erhöht) im Vergleich zu m PTCs von WT OcrlY/þ-Mäusen (Abbildung 4c und d). Behandlung von m PTCs von Ocrl^Y/- Mäuse mit Alpelisib führten zu einer signifikanten Verringerung der intrazellulären PI(3)P- und PI(4,5)P2-Färbung (Abbildung 4c und d).

1.5 Alpelisib verbessert die endozytische Aufnahme in Ocrl^Y/-m PTCs

Als nächstes untersuchten wir, ob die Wirkung von Alpelisib auf die bei m PTCs beobachteten zytoskelettalen und vesikulären Defekte zu Veränderungen der endozytischen Aufnahmekapazität führte. Um die Wirkung von Alpelisib auf die Bindung und/oder Internalisierung des Liganden zu differenzieren, wurden m PTCs zuerst mit markiertem Rinderserumalbumin (BSA) inkubiert, um die Bindung der Sonde mit den endozytischen Rezeptoren zu induzieren, und dann mit einem Wachstumsmedium inkubiert, um Folgen Sie der Internalisierung von Albumin (Abbildung 5a). Das Ocrl^Y/-Zellen zeigten im Vergleich zu OcrlY/ξ-Zellen eine geringere Plasmamembranbindung von Alexa 488--Rinderserumalbumin zusammen mit einer beeinträchtigten Internalisierung von Albumin. Die Behandlung mit Alpelisib rettete sowohl die Bindung als auch die Aufnahme von Albumin im Ocrl^Y/-Zellen, mit einer 50-prozentigen Gesamtrettung der endozytischen Aufnahme (Abbildung 5b und c). Diese Daten wurden durch die Messung der Gesamtalbuminaufnahme gestützt (ergänzende Abbildungen S5a und b). Wir stellten fest, dass das Verhältnis von internalisiertem/gebundenem Alexa 488--Rindserumalbumin zwischen den verschiedenen Bedingungen ähnlich blieb (Abbildung 5d), was impliziert, dass die reduzierte Aufnahme von Albumin hauptsächlich auf eine beeinträchtigte Bindung und nicht auf einen fehlerhaften Internalisierungsprozess an sich zurückzuführen ist.

1.6 Alpelisib verbessert die PT-Dysfunktion und die rezeptorvermittelte Endozytose bei Ocrl^Y/- Mäuse

Wir haben die potenzielle therapeutische Wirkung von Alpelisib auf die PT-Dysfunktion in vivo getestet. Oral verabreichten Mäusen wurde 6 Wochen lang entweder Vehikel oder Alpelisib (50 mg/kg Körpergewicht pro Tag) per Schlundsonde verabreicht (Abbildung 6a). Dieses Regime wurde gemäß früheren In-vivo-Studien gewählt, die Wirksamkeit und Sicherheit zeigten.^22,30Im Einklang mit der Verabreichung von Alpelisib, von der bekannt ist, dass sie Insulinresistenz und Hyperglykämie verursacht,²²Die Behandlung mit Alpelisib führte sowohl bei Ocrl Y/þ als auch bei Oral zu einem signifikanten Anstieg der Glykosurie^Y/-Mäuse, die als Biomarker für die Arzneimitteldosierung angesehen werden könnten (Ergänzungstabelle S1). Nach 6-wöchiger Behandlung mit Alpelisib wurde die Ocrl^Y/-Mäuse zeigten eine signifikante Verringerung der Urinausscheidung der LMW-Proteine ​​CC16 (-34 Prozent) und Albumin (-38 Prozent), verglichen mit Vehikel-behandelten Kontrollen (Fig. 6b und c), wohingegen das Volumen von Urin und andere Parameter waren nicht betroffen (Ergänzungstabelle S1). Mit Alpelisib behandelte Mäuse beider Genotypen zeigten eine ähnliche Verringerung der Wachstumsrate im Vergleich zu Kontrollmäusen, wie zuvor beschrieben.²²Dennoch nahmen sowohl die Vehikel- als auch die behandelten Mäuse an Körpergewicht zu, was darauf hinweist, dass das Medikament die postnatale Entwicklung nicht stark beeinflusst (Abbildung 6d und Ergänzungstabelle S1).

Um zu testen, ob die Wirkung von Alpelisib auf die LMW-Proteinurie die Wiederherstellung der Rezeptor-vermittelten Endozytose in PT-Zellen widerspiegelt, verfolgten wir die In-vivo-Aufnahme von Cy5--markiertem b-Lactoglobulin in einer Mausniere. Mit Alpelisib behandeltes Ocrl^Y/-Mäuse zeigten eine signifikante Wiederherstellung der Aufnahme von Cy5--markiertem b-Lactoglobulin, ähnlich dem Ausmaß der Internalisierung, das bei mit Vehikel behandelten OcrlY/þ-Mäusen beobachtet wurde (Abbildung 6e). Dies spiegelte sich in einer signifikanten Verbesserung der Expression des endozytischen Rezeptors Megalin in PT-Zellen wider, wie durch Immunmarkierung und Western-Blotting der Nierenlysate von mit Alpelisib behandeltem Ocrl beobachtet wurde^Y/-Mäuse; Beachten Sie, dass sich die Expression des PT-Markers AQP1 nicht verändert hat (Abbildung 6f und g und ergänzende Abbildung S5C und D). Diese Daten zeigen, dass der PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitor Alpelisibin einem humanisierten Mausmodell für das Lowe-Syndrom eine wesentliche Verbesserung der PT-Endozytenmaschinerie induziert und die LMW-Proteinurie reduziert.

Abbildung 5|Alpelisib verbessert die endozytische Aufnahme von humanisiertem Ocrl^Y/-Maus-PTCs (m PTCs). (a) Schematische Darstellung des Pulse-Chase-Experiments, das zur Untersuchung der Bindung und Internalisierung von Alexa 488- Rinderserumalbumin (BSA) in m PTCs verwendet wurde. Die Zellen wurden Alexa 488-BSA (0,2 mg/ml) für 1 Stunde bei 4 Grad ausgesetzt, damit BSA an Zelloberflächenrezeptoren (Puls) binden kann, und dann in Zellmedium auf 37 Grad erwärmt für 20 Minuten vor der Fixierung, um die Internalisierung des Liganden zu ermöglichen (Verfolgung). (b) Repräsentative konfokale Mikroaufnahmen von OcrlY/þ oder Ocrl^Y/-m PTCs, die 16 Stunden lang mit Dimethylsulfoxid (DMSO) oder 10 mM Alpelisib behandelt und dem Alexa 488-BSA (grün)-Pulse-Chase-Experiment unterzogen wurden, bevor sie für 40,6-diamidino{ fixiert und markiert wurden {6}}Phenylindol (DAPI) (blau). Die Pulsphase des Experiments wird im oberen Feld für jede Bedingung gezeigt, mit dem Chase unten. Stangen =20 mm. (c) Quantifizierung von Zelloberflächen-Alexa 488-BSA (i) und internalisiertem Alexa 488-BSA (ii), bewertet als mittlere FL-Fluoreszenzintensitäten pro Zelle. Alpelisib rettet die in Ocrl beobachtete gerettete BSA-Bindung und Internalisierung^Y/-Zellen. N=209, 228, 186 und 196 Zellen für OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ Alpelisib, OcrlY/DMSO und Ocrl^Y/-Alpelisib-Bedingungen, jeweils in (i) und N=203, 183, 199 und 233 Zellen für OcrlY/þ DMSO, OcrlY/þ Alpelisib, Ocrl^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-Alpelisib-Bedingungen jeweils in (ii), jeweils gepoolt aus 2 Mäusenieren pro Erkrankung; jeder Datenpunkt repräsentiert die mittlere FL-Fluoreszenzintensität in einer einzelnen Zelle. Die Signifikanz wurde durch Kruskal-Wallis (KW)-Varianzanalyse (ANOVA) mit Dunns multiplem Vergleichstest getestet: für (i) Zelloberflächen-BSA, insgesamt ***P < 0.001,="" multiple="" vergleiche:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib ***P <{{0}}.001; ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.60" (nicht="" signifikant="" [ns]);="" für="" (ii)="" internalisiertes="" bsa,="" gesamt-***p="">< 0,001,="" mehrfachvergleiche:="" ocrly/þ="" dmso="" versus="">^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib ***P < 0.001;="" ocrly/þ="" dmso="" versus="" ocrly/þ="" alpelisib="" p="0.66" (ns).="" (d)="" quantifizierung="" des="" verhältnisses="" zwischen="" der="" alexa="" 488-="" bsa-zelloberfläche="" und="" den="" internalisierten="" alexa="" 488-bsa="" fl-fluoreszenzintensitäten,="" die="" keine="" signifikanten="" unterschiede="" in="" den="" verhältnissen="" zwischen="" den="" einzelnen="" bedingungen="" zeigen.="" jeder="" punkt="" stellt="" den="" durchschnitt="" des="" verhältnisses="" in="" einem="" feld="" dar,="" das="" ungefähr="" 15–20="" zellen="" enthält="" (n="13," 13,="" 10="" und="" 11="" zufällig="" ausgewählte="" felder="" für="" ocrly/þ="" dmso,="" ocrly/þ="" alpelisib,="">^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-Alpelisib-Zustände, jeweils gepoolt aus 2 Mäusenieren pro Zustand). Die Signifikanz wurde durch KW ANOVA mit Mehrfachvergleichstests nach Dunn getestet: Gesamt-P=0,46 (ns), Mehrfachvergleiche: OcrlY/þ DMSO versus Ocrl^Y/-DMSO und Ocrl^Y/-DMSO versus Ocrl^Y/-Alpelisib P > 0,99 (ns); OcrlY/þ DMSO versus OcrlY/þ Alpelisib P=0.84 (ns). Um die Anzeige dieses Bildes zu optimieren, lesen Sie bitte die Online-Version dieses Artikels unter www.kidney-international.org.

Abbildung 6|Alpelisib verbessert die Funktion des proximalen Tubulus (PT) von OcrlY/L-Mäusen, indem es die Ligandenaufnahme und die Megalin-Expression wiederherstellt. (a) Experimenteller Aufbau. Orale Mäuse wurden 6 Wochen lang mit einer täglichen oralen Dosis von entweder Carboxymethylcellulose 1 Prozent (Vehikel) oder Alpelisib (50 mg/kg Körpergewicht) behandelt. Am letzten Behandlungstag wurde den Mäusen Cy5--markiertes b-Lactoglobulin (N=6 Ocrl^Y/-, oder 8 Okrl^Y/-Mäuse pro Gruppe). (b–d) Die gezeigten D-Werte zeigen die mittlere Änderung von BL zu D42 für die Bedingung ± SEM. (b) Clara-Zellprotein 16 (CC16), (c) Albumin-Harnausscheidung (beide innerhalb von 15 Stunden) und (d) Körpermasse wurden bei OcrlY/--Mäusen gemessen, die zum angegebenen Zeitpunkt entweder mit Vehikel oder Alpelisib behandelt wurden. Jeder Punkt repräsentiert 1 Maus. Die Signifikanz wurde durch den 2-schwänzigen gepaarten Student's t-Test bewertet; in (b) CC16 (Fortsetzung)

Abbildung 6|(Fortsetzung) Output-Änderung relativ zum Ausgangswert; þ Vehikel, P=0.9802 (nicht signifikant [ns]), þ Alpelisib, *P=0.0334; in (c) Änderung der Albuminabgabe relativ zur Grundlinie; þ Vehikel, P=0.0502 (ns), þ Alpelisib, ***P ¼ 0,0006; in (d) Veränderung der Körpermasse relativ zum Ausgangswert; þ Vehikel, ***P < 0,0001,="" þ="" alpelisib,="" **p="0,0083." (e)="" repräsentative="" konfokale="" mikroaufnahmen,="" die="" cy5--markiertes="" b-lactoglobulin="" (magenta)="" 15="" minuten="" nach="" injektion="" in="" die="" schwanzvene="" zeigen="" und="" mit="" 40,6-diamidino-2-phenylindole="" (dapi)="" (cyan)="" markiert="" sind,="" plus="" quantifizierung="" der="" entsprechenden="" fl-fluoreszenzsignale="" von="" ocrl-mausnieren="" (n="412," 500="" bzw.="" 588="" tubuli="" für="" ocrly/þþ-vehikel,="">^Y/-þ Fahrzeug und Ocrl^Y/-þ Alpelisib) für 3 Mäuse pro Behandlungsgruppe. Die Aufnahme von b-Lactoglobulin wird durch die Behandlung mit Alpelisib gerettet. Balken ¼ 20 mm. In den Quantifizierungen repräsentiert jeder Punkt die FL-Fluoreszenzintensität, normalisiert durch die Tubulusfläche; aufgetragene Daten zeigen den Mittelwert ± SEM. Die Signifikanz wurde durch den Kruskal-Wallis (KW)-Test, gefolgt von Dunns multiplem Vergleichstest, bewertet; ***P < 0,001,="" multiple="" vergleiche;="" ocrly/þþ-fahrzeug="" gegen="">^Y/-þ Fahrzeug und Ocrl^Y/-þ Fahrzeug versus Ocrl^Y/-þ Alpelisib, beide ***P < 0.001.="" (f)="" western-blotting="" und="" densitometrie-analyse="" von="" megalin-spiegeln="" in="" ganzen="" nierenlysaten="" von="" oral-mäusen.="" a-tubulin="" wurde="" als="" ladekontrolle="" verwendet.="" der="" reduzierte="" megalin-ausdruck="" in="">^Y/-wird durch Alpelisib gerettet. Bei der Quantifizierung der densitometrischen Analyse repräsentiert jeder Punkt 1 Maus (N=4 OcrlY/þþ-Vehikel und Ocrl^Y/-þ Fahrzeug und N=3 Ocrl^Y/-þ Alpelisib-Mäuse); Linien zeigen den Mittelwert ± SEM an. Die Signifikanz wurde durch 2-tailed ungepaarte Student's t-Tests bewertet: OcrlY/þþ-Vehikel versus Ocrl^Y/-þ Fahrzeug; **P ¼ 0.0057, Ocrl^Y/-þ Fahrzeug versus Ocrl^Y/- þ Alpelisib, *P=0.0246. (g) Repräsentative konfokale Mikrofotografien mit stark vergrößerten Einschüben und Quantifizierung der Intensität von Megalin (gelb) in AQP1þ PTs (magenta) aus oralen Nieren wurden auch für DAPI (cyan) gekennzeichnet, was die Wiederherstellung der Megalinspiegel nach der Behandlung mit Alpelisib veranschaulicht. Stangen =20 mm. In den Quantifizierungen repräsentiert jeder Punkt die FL-Fluoreszenzintensität, normalisiert durch die Tubulusfläche; aufgetragene Daten zeigen den Mittelwert ± SEM; N=142, 191 bzw. 266 Tubuli für OcrlY/þþ-Vehikel, Ocrl^Y/-þ Fahrzeug und Ocrl^Y/-þ Alpelisib für 3 Mäuse pro Behandlungsgruppe. Die Signifikanz wurde durch KW-Varianzanalyse gefolgt von Dunns multiplem Vergleichstest bewertet; insgesamt ***P < 0.001,="" mehrfachvergleiche;="" ocrly/þþ-fahrzeug="" gegen="">^Y/-þ Fahrzeug und Ocrl^Y/-þ Fahrzeug versus Ocrl^Y/-þ Alpelisib, beide ***P < 0.001.="" um="" die="" anzeige="" dieses="" bildes="" zu="" optimieren,="" lesen="" sie="" bitte="" die="" online-version="" dieses="" artikels="" unter="">

Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent angewendet?

2. DISKUSSION

Derzeit gibt es keine Behandlung zur Linderung der defekten Endozytose, die eine PT-Dysfunktion verursachtLowe-Syndrom und Dent-Krankheit2. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Alpelisib den abweichenden Aktin-Phänotyp lindert, indem es die Spiegel von PI(4,5)P2 und PI(3)P reduziert, was zu einer wesentlichen Verbesserung der endozytischen Maschinerie und Absorptionskapazität in zellulären Systemen und einem humanisierten Mausmodell führt Lowe-Syndrom/Morbus Dent 2. Diese Ergebnisse unterstützen die Verbindung zwischen Phosphoinositid-Lipiden, Aktin-Polymerisation und endozytischem Transport, mit unmittelbarer Relevanz für hochaktive Epithelzellen, die an entscheidenden homöostatischen Prozessen beteiligt sind (Abbildung 7). Angesichts des Mangels an wirksamen Therapien und der offensichtlichen Sicherheit dieser Klasse von PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren ist Alpelisib ein vielversprechender Kandidat für die Umwidmung von ArzneimittelnLowe-Syndrom und Dent-Krankheit.

LMW-Proteinurie ist das beständigste Merkmal bei Patienten mitLowe-Syndrom und Dent-Krankheit2 aufgrund inaktivierender Mutationen in OCRL.⁴Diese LMW-Proteine ​​können leicht nachgewiesen und quantifiziert werden und bieten einen zuverlässigen Biomarker für eine defekte Rezeptor-vermittelte Endozytose in PT-Zellen.1 LMW-Proteinurie ist besonders relevant, da sie konsistenter und oft früher als andere gelöste Stoffe (z. B. Glucose, Phosphat, Aminosäuren) als Teil des klassischen „renalen Fanconi-Syndroms“ – zumindest bei angeborenen Störungen des endolysosomalen Weges.¹Hier zeigen wir, dass Alpelisib die apikale endozytische Aufnahmekapazität von PT-Zellen in vitro und in vivo rettet, da die Spiegel des Megalinrezeptors an der Plasmamembran wiederhergestellt werden. Dieser Effekt spiegelt sich in Ocrl in einer signifikanten Verringerung des Urinverlusts von LMW-Proteinen (CC16 und Albumin) wider^Y/-Mäuse, die 6 Wochen lang mit Alpelisib behandelt wurden. Diese Wirkungen von Alpelisib wurden bei m PTCs beobachtet, die ihre apikale Differenzierung beibehalten und besonders gut geeignet sind, um die Rezeptor-vermittelte Endozytose in Physiologie und Krankheit zu untersuchen.⁹ Insbesondere erhielten wir m PTCs aus einem humanisierten Mausmodell, das menschliches INPP5B in Ocrl exprimiert^Y/-; Inpp5b^-/-Hintergrund, der es uns ermöglicht, die konkreten Folgen des Verlusts der OCRL-Aktivität zu untersuchen.^11,23

Die Rettung der Endozytose durch Alpelisib wird durch seine Wirkung auf die Aktinmaschinerie erklärt, die in OCRL KO HK2-Zellen und m PTCs eindeutig nachgewiesen wurde. Unsere Beobachtungen bestätigen und erweitern somit frühere Studien, die den Zusammenhang zwischen der Kontrolle des Phosphoinositid-Gleichgewichts und F-Aktin im frühen endosomalen Weg bei OCRL-Patienten und KO-Zellen zeigen.^7,10Der funktionelle Verlust der OCRL-Aktivität beeinträchtigt den Abbau von PI(4,5)P2, was wiederum dazu führt, dass Clathrin-beschichtete Vesikel nicht mehr freigelegt werden können, was zu aberranten endosomalen Organellen in verschiedenen Zelltypen, einschließlich der PT-Zellen, führt.^7-10Wir haben kürzlich gezeigt, dass überschüssiges F-Actin das Recycling des Multiligand-Rezeptors Megalin zur apikalen Membran von PT-Zellen verringert, was eine defekte Endozytose und LMW-Proteinurie verursacht.¹¹

Unsere Daten weisen darauf hin, dass der Wirkungsmechanismus von Alpelisib auf endosomales Aktin aus einer bispezifischen Wirkung der Alpelisib-Hemmung resultiert: erstens auf die Produktion von PI(3,4,5)P3 und seine Umwandlung in PI(3)P und zweitens auf die Produktion von PI(4,5)P2. Die Abnahme der PI(4,5)P2-Spiegel wirkt dem OCRL-Mangel direkt entgegen und stimmt mit früheren Arbeiten überein, bei denen überschüssiges Aktin gelindert und der endozytische Efflux durch eine Verringerung der Spiegel von Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-kinase erhöht wurde , ein Enzym, das PI(4,5)P2 erzeugt.¹⁰Alpelisib hat eine 0,5 mM 50-prozentige Hemmkonzentration auf die PI(4,5)P2-erzeugende Kinase PI4Kb, die möglicherweise verantwortlich ist, oder sie könnte aus allgemeineren Wirkungen auf das Phosphoinositid-Gleichgewicht resultieren, die aus der Kombination von OCRL resultieren KO- und Alpelisib-Behandlung. Wir haben festgestellt, dass Klasse IA PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Die Hemmung durch Alpelisib ist für die Aktinhemmung relevant, da die siRNA-vermittelte Depletion von p110a die Aktinakkumulation ähnlich hemmt wie die Behandlung mit Alpelisib und Copanlisib (von dem nicht berichtet wird, dass es PI4Ks hemmt). In RPE-Zellen haben wir zuvor beobachtet, dass die siRNA von INPP4A, die PI(3,4)P2 in PI(3)P umwandelt, die Aktin-Assemblierung in OCRL-KO-Zellen hemmt und einen Weg von der Hemmung von PI(3,4,5) bereitstellt. P3-Produktion zu einer Abnahme des endosomalen PI(3)P. Wir haben gezeigt, dass etwas PI(3)P verbleibt, vermutlich der Pool, der am frühen Endosom von PI3K der Klasse III, Vps34, produziert wird, da wir festgestellt haben, dass der endosomale Transport durch die Behandlung mit Alpelisib eher verstärkt als unterdrückt wird. Die komplexe Co-Regulierung des PI-Metabolismus und seine Relevanz für die OCRL-Inaktivierung wurde auch in einer kürzlich durchgeführten Studie hervorgehoben, in der nichtkatalytische Funktionen der Phosphoinositid-3--Phosphatase PTEN den PI(4,5)P2-Abbau über PLCXD aktivieren, wodurch zelluläre Phänotypen und die Absorption von gelindert werden Liganden in einem Zebrafischmodell.³¹

Die Linderung des Aktin-Phänotyps durch reduzierte PI(4,5)P2- und PI(3)P-Spiegel durch die Behandlung mit Alpelisib stimmt mit der synergistischen Wirkung von PI(4,5)P2 und PI(3)P bei der Rekrutierung von SNX9 zur Aktivierung überein die Aktinmaschinerie an Ocrl-Endosomen,¹⁴was auf eine sehr effektive Anpassung der Alpelisib-Spezifität hindeutet, um die molekulare Regulation der Aktinaktivierung an Endosomen zu manipulieren. Wie zuvor gezeigt, führt wiederum eine verringerte endosomale Aktin-Assemblierung wiederum zu einer Verbesserung der PT-Endozytose in OCRL-defizienten Zellen.¹⁰Eine weitere Charakterisierung ist erforderlich, um besser zu verstehen, ob die Regulation von Aktin durch den Phosphoinositid-Metabolismus die wahre Quelle der therapeutischen Wirkung ist, die wir bei Alpelisib im Ocrl beobachten^Y/-Maus-Modell. Weil Klasse I PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)regulieren Wege, die das Zellwachstum, die Proliferation, das Überleben, den Stoffwechsel und die Autophagie steuern,³²wir können nicht ausschließen, dass die Endozytose-Rescue direkt auf Wirkungen auf PI(3,4,5)P3 und die kombinierte Wirkung auf andere Signalwege, die durch Klasse-I-PI3K moduliert werden, zurückzuführen ist. Es ist auch mehr Arbeit erforderlich, um zu testen, ob PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitoren könnten auch die neurologischen und anderen klinischen Manifestationen von Patienten mit OCRL-Mutationen lindern.⁴

Die jüngsten Erfahrungen mit Alpelisib bei pädiatrischen Patienten mit PROS/CLOVES-Syndrom deuten darauf hin, dass das Medikament möglicherweise gut vertragen wird. Alpelisib wird oral eingenommen, zielt selektiv auf die Isoform von PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Klasse I und zeigt ein geringes Toxizitätsprofil im Vergleich zu pan-PI3K-Inhibitoren. Da Alpelisib PI3K nicht vollständig blockiert (Phosphoinositid 3-kinase)Aktivität, also die Aufrechterhaltung von Funktionen des Signalwegs, kann es besonders für eine Langzeitanwendung geeignet sein. Interessanterweise kann die durch die Anwendung von Alpelisib verursachte Hyperglykämie durch Ernährungsumstellungen beherrschbar sein.²²Da die PT-Dysfunktion die erste Manifestation einer Nierenerkrankung ist, die bei jungen Säuglingen mit Dent-Krankheit 2 und Lowe-Syndrom beobachtet wird, könnte eine frühzeitige Behandlung einer solchen PT-Dysfunktion, die zu Verbesserungen des Stoffwechselprofils und des Wachstums führt, das Fortschreiten zu einer chronischen Nierenerkrankung verlangsamen und daher haben einen erheblichen Einfluss auf die Lebensdauer und Lebensqualität.³³Obwohl die Krankheitsmanifestationen der OCRL-Mutation besonders weit verbreitet sind, haben neuere Studien, die auf großen Kohorten genotypisierter Patienten mit Lowe-Syndrom der Dent-Krankheit 2 basieren, keine signifikanten Auswirkungen der Art der Mutation oder des Mutationsortes auf das renale Überleben gezeigt.³⁴Insgesamt unterstreichen unsere Daten das Potenzial für die Umnutzung von Alpelisib zur Behandlung von PT-Dysfunktion bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent 2 und bieten somit eine Grundlage für einen schnellen und kostengünstigen Einsatz in klinischen Studien am Menschen.

3. METHODEN

3.1 Ausführliche Informationen finden Sie in den ergänzenden Methoden.

HK2-Zellen wurden mit Copanlisib, Alpelisib, GSK2636771 oder Idelalisib in den angegebenen Konzentrationen für 16 Stunden behandelt, sofern nicht anders angegeben. Proteine ​​wurden unter Verwendung von Standardverfahren aus Zellen oder Nierengeweben extrahiert und Western Blotting wurde unter Verwendung von veröffentlichten oder im Handel erhältlichen Antikörpern durchgeführt. Der siRNA-Knockdown wurde unter Verwendung von 2 Transfektionen 72 und 24 Stunden vor der Analyse durchgeführt. Wir verwendeten alters- und geschlechtsangepasstes OcrlY/þ; Inpp5b^{- /-}; und Ocrl^Y/-; Inpp5b^-/- Maus-Wurfgeschwister mit BAC-INPP5B-Expression. Primärkulturen von m PTCs wurden aus den Nieren von 8 Wochen alten Ocrl-Mäusen erzeugt und die endozytische Kapazität von oralen m PTCs wurde durch Messen der Albuminaufnahme bewertet. Alpelisib-Behandlungen waren 10 mM für 16 Stunden, sofern nicht anders angegeben. Die Albuminaufnahme in m PTCs wurde unter Verwendung eines "Pulse-Chase"-Protokolls bewertet, um die apikale Bindung und die resultierende Aufnahme zu bewerten. m PTCs wurden über Nacht mit dem geeigneten Primärantikörper und 45 Minuten lang mit geeigneten FL-Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern und/oder Alexa-488 Phalloidin gefärbt. PI(3)P-Färbung auf m PTCs wurde unter Verwendung der FYVE-Domänensonde durchgeführt. Die Bildanalyse wurde mit CellProfifiler durchgeführt, wobei benutzerdefinierte Pipelines verwendet wurden, um die Aktin/EEA1-Überlappung und die Anzahl der Puncta zu messen, und mit ImageJ, um die Immunfluoreszenzintensität und erkannte Kanten zu messen, um den Stressfaser-Score zu berechnen. Quantitative Daten wurden als Mittelwerte ± Standardfehler des Mittelwerts ausgedrückt. Für die In-vivo-Experimente wurden Mäuse im Alter von 6 Wochen mit Vehikel oder Alpelisib 50 mg/kg Körpergewicht behandelt. Urin wurde alle 14 Tage gesammelt und die Tiere wurden nach 42 Behandlungstagen getötet, wobei Blut und Nieren entnommen wurden. Die endozytische PT-Kapazität von Oral-Mäusen wurde durch Messung der b-Lactoglobulin-Aufnahme untersucht.

4. OFFENLEGUNG

JLG wird von AstraZeneca für ein Stipendium in ihrem Labor finanziert. SPJ sitzt in den Beratungsgremien und ist Kapitalbeteiligung an Mission Therapeutics, Carrick Therapeutics und Adrestia Therapeutics und ist Wissenschaftspartner für Ahren Innovation Capital. Alle anderen Autoren erklärten keine konkurrierenden Interessen.

5. BESTÄTIGUNGEN

Diese Arbeit wurde unterstützt durch European Research Council Grant 281971, Wellcome Trust Research Career Development Fellowship WT095829AIA, Wellcome Senior Research Fellowship 219482/Z/19/Z, Wellcome Trust Developing Concept Fund 209749/Z/17/Z, Isaac Newton Trust Research Grant 18.23 (j) an JLG und Wellcome Investigator Award 206388/Z/17/Z an SPJ, und wir danken dem Gurdon Institute für die Finanzierung durch den Wellcome Trust (092096) und CRUK (C6946/A14492). Wir danken der Cystinosis Research Foundation (Irvine, CA), dem Schweizerischen Nationalfonds (Projektförderung 310030_189044), dem klinischen Forschungsschwerpunktprogramm (KFSP) RADIZ (Rare Disease Initiative Zurich) der UZH, der Swiss

National Centre of Competence in Research (NCCR) Kidney Control of Homeostasis (Kidney.CH) für die Unterstützung sowie dem NIDDK/NIH und dem Lowe Syndrom Trust/UK für die Unterstützung der Entwicklung der Oral-Mäuse. Wir danken Robert L. Nussbaum (Invitae Corporation und UCSF, San Francisco, CA) und Maria Antonietta De Matteis (Telethon Institute of Genetics and Medicine, University Federico II Naples, Naples, Italy) für die Bereitstellung der Gründer für die Oral-Maus-Kolonie;

und Eric Olinger (UZH, Zürich) für fruchtbare Diskussionen. Wir danken Nadine Näegele und Daniela Nieri für die technische Unterstützung bei der Urinsammlung und -analyse; Guillaume Canaud (Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris) dafür, dass er uns das detaillierte Protokoll für die Vorbereitung von Alpelisib für die In-vivo-Behandlung zur Verfügung gestellt hat; und Renata Kozyraki und Pierre Verroust für die Bereitstellung von Reagenzien. Wir danken auch dem Zentrum für Mikroskopie und Bildanalyse der Universität Zürich (Zürich, Schweiz) und der Zürcher integrativen Nagetierphysiologie (ZIRP) für die Bereitstellung der Ausrüstung für die Bilderfassung und die technische Unterstützung während der In-vivo-Experimente.

Wie wird der Phosphoinositid-3--Kinase-Hemmer Alpelisib bei Lowe-Syndrom/Morbus Dent angewendet?

6. ERGÄNZENDES MATERIAL

Ergänzende Datei (PDF)

Ergänzende Methoden und Referenzen.

Tabelle S1. Körpergewicht, Urin und Blutparameter im Zeitverlauf bei mit Alpelisib oder Vehikel behandelten Oral-Mäusen.

Abbildung S1. p110-Isoform-Expression und Wirkstoff-Dosis-Wirkungs-Zytotoxizitätsassays in HK2-Zellen.

Abbildung 2. PI3KInhibitor Alpelisibstellt die Actin-endosomale Überlappung wieder her und reduziert die PI(3)P-Spiegel dosisabhängig 4 Stunden nach der medikamentösen Behandlung in HK2-Zellen.

Abbildung S3. p110-Isoform-Expression und Alpelisib-Toxizität in Ocrl-mPTCs.

Abbildung S4. Arbeitsablauf der EEA1/Aktin-Überlappungsanalyse in Ocrl mPTCs.

Abbildung S5. Alpelisib stellt die Albuminaufnahme in Ocrl wieder her^Y/-mPTCs. Die Aqp1-Expression ist nicht betroffen. Ergänzende Datei (Filme)

Film S1. Imaris 3D-Darstellung der EEA1/Aktin-Überlappung in mit DMSO behandelten OcrlY/þ mPTCs. Repräsentative 3D-Oberflächendarstellung eines konfokalen Stapels von OcrlY/þ-mPTCs, die 16 Stunden lang mit DMSO behandelt, dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für EEA1 (lila), Aktin (Phalloidin; gelb) und DAPI (blau) immunmarkiert wurden, was wenig darstellt Aktin/endosomale Assoziation. Balken =5 mm.

Film S2. Imaris 3D-Rendering der EEA1/Aktin-Überlappung in Ocrl^Y/-Mit DMSO behandelte mPTCs. Repräsentative 3D-Oberflächendarstellung eines konfokalen Stapels von OcrlY/– mPTCs, die 16 Stunden lang mit DMSO behandelt, dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für EEA1 (lila), Aktin (Phalloidin; gelb) und DAPI (blau) immunmarkiert wurden, zur Veranschaulichung der Punktierung Aktin, das nahe endosomalen Strukturen assoziiert. Balken =5 mm.

Film S3. Imaris 3D-Rendering der EEA1/Aktin-Überlappung in Ocrl^Y/- Mit Alpelisib behandelte mPTCs. Repräsentative 3D-Oberflächendarstellung eines konfokalen Stapels von OcrlY/– mPTCs, die 16 Stunden lang mit 10 mM Alpelisib behandelt wurden, dann mit dem 4-prozentigen Formaldehyd-Fifix fixiert und für EEA1 (lila), Aktin (Phalloidin; gelb) und DAPI (blau) immunmarkiert wurden. , die die Rettung von Aktin-Punktstrukturen um Endosomen veranschaulicht. Bar =5 mm.

VERWEISE

1. van der Wijst J, Belge H, Bindels RJM, Devuyst O. Physiologie aus vererbten Nierenerkrankungen lernen. Physiol Rev. 2019;99:1575–1653.

2. Loi M. Lowe-Syndrom. Orphanet J Rare Dis. 2006;1:16.

3. Lewis RA, Nussbaum RL, Brewer ED. Lowe-Syndrom. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., Hrsg. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): Universität von Washington, Seattle; 1993-2020. Verfügbar unter: HTTPS://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1480/. Veröffentlicht am 24. Juli 2001; Aktualisiert am 18. April 2019. Zugriff am 8. August 2019.

4. MA De Matteis, L. Staiano, F. Emma, ​​O. Devuyst. Die 5--Phosphatase-OCRL inLowe-Syndrom und Dent-Krankheit2. Nat. Rev. Nephrol. 2017;13: 455–470.

5. Devuyst O, Luciani A. Chloridtransporter und rezeptorvermittelte Endozytose im proximalen Nierentubulus. J Physiol. 2015;593:4151–4164.

6. Zhang X, Jefferson AB, Auethavekiat V, Majerus PW. Das beim Lowe-Syndrom defiziente Protein ist eine Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat5--Phosphatase. Proc Natl Acad Sci US A. 1995;92:4853–4856.

7. Nández R., Balkin DM. Messa M. et al. Eine Rolle von OCRL in der Clathrin-beschichteten Pit-Dynamik und dem Uncoating, die durch Studien an Lowe-Syndrom-Zellen offenbart wurde. eLife. 2014;3:e02975.

8. Mehta ZB, Pietka G, Lowe M. Die zellulären und physiologischen Funktionen des Lowe-Syndrom-Proteins OCRL1. Verkehr. 2014;15:471–487.

9. De Leo MG, Staiano L, Vicinanza M, et al. Die Autophagosom-Lysosom-Fusion löst eine lysosomale Reaktion aus, die durch TLR9 vermittelt und durch OCRL kontrolliert wird. Nat. Cell Biol. 2016;18:839–850.

10. Vicinanza M., Di Campli A., Polishchuk E. et al. OCRL kontrolliert den Verkehr durch frühe Endosomen über die PtdIns4,5P(2)-abhängige Regulation von endosomalem Aktin. EMBO J. 2011;30:4970–4985.

11. Festa BP, Borquez M., Gassama A., et al. OCRL-Mangel beeinträchtigt die endolysosomale Funktion in einem humanisierten Mausmodell fürLowe-Syndrom und Dent-Krankheit. Hum Mol Genet. 2019;28:1931–1946.

12. Welch HC, Coldwell WJ, Ellson CD, et al. P-Rex1, ein PtdIns(3,4,5)P3-- und Gbetagamma-regulierter Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor für Rac. Zelle. 2002;108:809–821.

13. Galopp JL, Walrant A, Cantley LC, Kirschner MW. Phosphoinositide und Membrankrümmung ändern den Modus der Aktinpolymerisation durch selektive Rekrutierung von Toca-1 und Snx9. Proc Natl Acad Sci US A. 2013;110:7193–7198.

14. Daste F, Warrant A, Holst MR, et al. Steuerung der Aktinpolymerisation über das Zusammentreffen von Phosphoinositiden und hoher Membrankrümmung. J CellBiol. 2017;216:3745–3765.

15. Malek M., Kielkowska A., Chessa T., et al. PTEN regelt die PI(3,4)P2-Signalisierung nach Klasse I PI3K(Phosphoinositid 3-kinase). Mol-Zelle. 2017;68:566–580.e510.

16. Gillooly DJ, Morrow IC, Lindsay M, et al. Lokalisierung von Phosphatidylinositol-3-phosphat in Hefe- und Säugetierzellen. EMBO J. 2000;19:4577–4588.

17. Fruman DA, Chiu H., Hopkins BD, et al. Der PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Weg in der menschlichen Krankheit. Zelle. 2017;170:605–635.

18. Liu N, Rowley BR, Bull CO, et al. BAY 80-6946 ist ein hochselektiver intravenöser PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Inhibitor mit starken p110alpha- und p110delta-Aktivitäten in Tumorzelllinien und Xenotransplantatmodellen. Mol Cancer Ther. 2013;12:2319–2330.

19. Fritsch C., Huang A., Chatenay-Rivauday C., et al. Charakterisierung des neuartigen und spezifischen PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Alpha-Inhibitor NVP-BYL719 und Entwicklung der Patientenstratifizierungsstrategie für klinische Studien. Mol Cancer Ther. 2014;13:1117–1129.

20. Furet P, Guagnano V, Fairhurst RA, et al. Entdeckung von NVP-BYL719, einem potenten und selektiven Phosphatidylinositol-3-Kinase-Alpha-Hemmer, der für die klinische Bewertung ausgewählt wurde. Bioorg Med. Chem. Lett. 2013;23:3741–3748.

21. Andre F., Ciruelos E., Rubovszky G. et al. Alpelisib für PIK3CA-mutierten, Hormonrezeptor-positiven fortgeschrittenen Brustkrebs. N Engl. J Med. 2019;380:1929–1940.

22. Venot Q, Blanc T, Rabia SH, et al. Zielgerichtete Therapie bei Patienten mit PIK3CA-bedingtem Überwucherungssyndrom. Natur. 2018;558:540–546.

23. Bothwell SP, Chan E, Bernardini IM, et al. Mausmodell für Nierentubulopathie bei Lowe-Syndrom/Dent-Krankheit 2. J. Am. Soc. Nephrol. 2011;22: 443–448.

24. R. Chen, VH Kang, J. Chen et al. Ein monoklonaler Antikörper zur Visualisierung von PtdIns(3,4,5)P(3) in Zellen. J Histochem Cytochem. 2002;50:697–708.

25. Hammond GR, Schiavo G, Irvine RF. Immunzytochemische Techniken zeigen mehrere, unterschiedliche zelluläre Pools von PtdIns4P und PtdIns(4,5)P(2). Biochem J. 2009;422:23–35.

26. He K., Marsland R. III., Upadhyayula S., et al. Dynamik der Phosphoinositid-Umwandlung im Clathrin-vermittelten endozytischen Verkehr. Natur. 2017;552:410–414.

27. Bilanges B, Poor Y, Vanhaesebroeck B. PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Isoformen in der Zellsignalisierung und im Vesikeltransport. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2019;20:515–534.

28. Montjean, R., Aoidi, R., Desbois, P., et al. OCRL-mutierte Fibroblasten von Patienten mit Dent-2-Krankheit weisen im Vergleich zu Lowe-Syndrom-Zellen eine INPP5B-unabhängige phänotypische Variabilität auf. Hum Mol Genet. 2015;24: 994–1006.

29. Suchy SF, Nußbaum RL. Der Mangel an PIP2 5--Phosphatase beim Lowe-Syndrom beeinflusst die Aktinpolymerisation. Bin J Hum Genet. 2002;71:1420–1427.

30. A. Mizrachi, Y. Shamay, J. Shah et al. Tumorspezifischer PI3K(Phosphoinositid 3-kinase)Hemmung durch Nanopartikel-gerichtete Abgabe bei Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinomen. Nat Commun. 2017;8:14292.

31. Mondin VE, Ben El Kadhi K, Cauvin C, et al. PTEN reduziert endosomales PtdIns(4,5)P2 auf Phosphatase-unabhängige Weise über einen PLC-Weg. J CellBiol. 2019;218:2198–2214.

32. Jean S., Kiger AA. Koordination zwischen RAB-GTPase und Phosphoinositid-Regulation und -Funktionen. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012;13: 463–470. 33. Devuyst O, Knoers NV, Remuzzi G, et al. Seltene erbliche Nierenerkrankungen: Herausforderungen, Chancen und Perspektiven. Lanzette. 2014;383: 1844–1859. 34. Zanies M., Bokenkamp A., Kolb M. et al. Langfristiges Nierenergebnis bei Kindern mit OCRL-Mutationen: retrospektive Analyse einer großen internationalen Kohorte. Nephrol Dial-Transplantation. 2018;33:85–94.

Aus: Kidney International (2020) 98, 883–896; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.05.040

Copyright ª 2020, Internationale Gesellschaft für Nephrologie. Veröffentlicht von Elsevier Inc. Dies ist ein Open-Access-Artikel unter der CC BY-Lizenz (HTTP://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).

Institute, University of Cambridge, Tennis Court Road, Cambridge CB2 1QN, UK. E-Mail: j.gallop@gurdon.cam.ac.uk; oder Olivier Devuyst, Institut für Physiologie, Universität Zürich, Zürich, Schweiz. E-Mail: olivier.devuyst@uzh.ch⁵ Diese Autoren haben zu gleichen Teilen zu dieser Arbeit beigetragen.⁶Diese Autoren haben die Studie gemeinsam geleitet. Eingegangen am 8. August 2019; überarbeitet am 1. Mai 2020; angenommen 15. Mai 2020; online veröffentlicht am 9. September 2020