Sagen Sie die Rolle von LncRNA bei der Nierenalterung anhand der RNA-Sequenzierung voraus

Abstrakt

Hintergrund: Lange nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind an physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Es wurden jedoch keine Studien zum Zusammenhang zwischen lncRNAs und der Nierenalterung durchgeführt. Ergebnisse: Zunächst untersuchten wir die Histopathologie junger (3- Monate alter) und alter (24- Monate alter) C57BL/6J-Mausnieren. Die Masson-Trichrom-Färbung und die PAS-Färbung zeigten interstitielle Kollagenablagerung und Fibrose, mesangiale Matrixausdehnung, eine dickere Basalmembran uswinterstitielle Nierenfibrosein old mouse kidneys. Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal)-positive areas in the kidneys of old mice were significantly elevated compared to those of young mice. Then, we analyzed the differential expression of lncRNAs and mRNAs in the kidneys of young and old mouse kidneys by RNA-seq analysis. 42 known and 179 novel differentially expressed lncRNAs and 702 differential mRNAs were detected in the mouse kidney. Next, we focused on the differentially expressed mRNAs and lncRNAs by RNA-seq. GO and KEGG analyses were performed based on differentially expressed mRNAs between young and old mouse kidneys. Transregulation based on research and the correlation coefficient of mRNA-lncRNA were also calculated. The mRNA-lncRNA network was constructed by choosing a Spearman correlation coefficient>0.9 oder<-0.9. GO and KEGG pathway enrichment analyses revealed that differentially expressed mRNAs participated in aging-related pathways. A total of 10 lncRNAs and trans-regulated mRNAs were constructed. Finally, we validated the role of lncRNA Gm43360 by CCK-8, flow cytometry, western blot, and SA-β-gal staining. The expression level of Adra1a was positively correlated and Csnk1a1 was negatively correlated with lncRNA Gm43360. The cell counting kit-8 (CCK-8) results showed that lncRNA Gm43360 promoted cell viability. LncRNA Gm43360 increased the percentage of S-phase cells and decreased the percentage of G1-phase cells compared with the negative control. LncRNA Gm43360 decreased the expression of p53, p21 and SA-β-gal. Conclusions: lncRNA Gm43360 may play aschützende Rolle bei der Nierenalterung.

Schlüsselwörter:lncRNA, Niere, Altern

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Hintergrund

Statistiken der Vereinten Nationen zufolge hat sich die durchschnittliche Lebenserwartung der Menschen in den meisten entwickelten Ländern in den letzten 200 Jahren verdoppelt; Daher ist die Frage, wie die Lebensqualität älterer Menschen verbessert werden kann, zu einem großen Problem der öffentlichen Gesundheit geworden [1, 2]. Alterung ist ein kontinuierlicher und schrittweiser Prozess und wurde allgemein als Ausgangspunkt für mehrere Prozesse identifiziertchronische Krankheit, einschließlichErkrankungen des Herz-Kreislauf-Systems[3], Stoffwechselstörungen [4], Krebs [5, 6] und neurodegenerative Erkrankungen [7]. Derglomeruläre Filtrationsrate(GFR) nimmt mit zunehmendem Alter ab, die Nieren verarbeiten Stoffwechselgifte langsamer und die Ansammlung von Stoffwechselgiften beschleunigt das Altern [8, 9]. Die Erforschung des Mechanismus der Nierenalterung wird für die Verzögerung des Auftretens und der Entwicklung von Nierenerkrankungen von großer Bedeutung seinNierenalterung. Obwohl nur wenige Studien zur Nierenalterung durchgeführt wurden, ist es dennoch sinnvoll, den Mechanismus der Nierenalterung zu verstehen.

Langkettige nichtkodierende RNAs (lncRNAs) sind mehr als 200 Nukleotide lang. LncRNAs regulieren die transkriptionelle und posttranskriptionelle RNA-Verarbeitung, Translation, DNA-Methylierung und Chromatinarchitektur über lokale (cis) und distale (trans) Mechanismen. Es wird allgemein davon ausgegangen, dass sie keine Proteine ​​kodieren, aber an verschiedenen beteiligt sein könnenbiologische Regulierungsfunktionen. Lin schlug vor, dass die lncRNA HOTAIR die Entwicklung der Parkinson-Krankheit fördert, indem sie auf miR-126 abzielt [10]. Gu schlug vor, dass die lncRNA EBF3-AS die neuronale Apoptose bei der Alzheimer-Krankheit fördert [11]. JX Pan schlug vor, dass lncRNA H19 das Fortschreiten der Arteriosklerose fördert. Kürzlich wurde berichtet, dass LncRNA H19 eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung von MAPK und dem NF-kB-Signalweg sowie der Induktion von Atherosklerose spielt [3]. lncRNAs spielen eine entscheidende Rolle beim Fortschreiten der diabetischen Nephropathie [12], der glomerulären Erkrankung [13] und der Nierenfibrose [14]. Die lncRNA Arid-IR fördert die NF-kB-vermittelte Nierenentzündung, indem sie auf die NLRC5-Transkription abzielt [15]. Der Zellzyklus verändert sich im Laufe des Alterns. Frühere Studien haben gezeigt, dass lncRNAs mit der Zellproliferation zusammenhängen und in engem Zusammenhang mit dem Fortschreiten des Zellzyklus stehen. LncRNA ANRIL hemmt die Seneszenz von glatten Gefäßmuskelzellen, indem es den Stillstand des Zellzyklus lindert [16]. Die lncRNA CASC11 kann die Apoptose von Magenkrebszellen fördern, indem sie den Zellzyklusprozess beschleunigt [17]. Die Untersuchung von lncRNAs bei der Nierenalterung steckt noch in den Kinderschuhen und wir fragten, ob lncRNAs den Prozess der Nierenalterung regulieren könnten.

In dieser Studie wollten wir die Expressionsänderungen von lncRNAs zwischen Mäusenieren unterschiedlichen Alters untersuchen und ein lncRNA-mRNA-Koexpressionsnetzwerk aufbauen, um die Rolle von lncRNA bei der Nierenalterung zu beleuchten. Unsere Ergebnisse liefern neue Beweise für das Verständnis der potenziellen Rolle des lncRNA-mRNA-Ex-Präzisionsnetzwerks in derPathogenese der Nierenalterung.

Ergebnisse

Sofern nicht anders angegeben, haben wir alle statistischen Vergleiche mithilfe des Student-t-Tests durchgeführt.

Nierenpathologie bei Mäusenund SA-Gal-Färbung Die renale Histopathologie wurde mittels PAS-Färbung und Masson-Trichrom-Färbung untersucht (Abb. 1). Der blau gefärbte Bereich in der alten Mäuseniere deutete auf interstitielle Fibrose und Kollagenablagerung hin (Abb. 1a), und der Fibrose-Score stieg an (P<0.05) (Fig. 1b). Old mouse kidneys exhibited thicker glomerular basement membranes, mesangial matrix expansion, and renal interstitial fibrosis by PAS staining (Fig. 1c). SA-β-gal-positive areas in the kidneys of old mice were significantly elevated compared to those in the kidneys of young mice (P<0.05) (Fig. 1d-e). These results indicated that aging leads to the aggravation of renal fibrosis. 

Unterschiedliche Expression von lncRNAs und mRNAs zwischen jungen und alten Mäusenieren Um den Mechanismus von RNAs in alternden Mäusen zu bestimmen, analysierten wir die lncRNA- und mRNA-Expression in den Nieren von C57BL/6J-Mäusen unterschiedlichen Alters durch RNA-Sequenzierung. Durch Sequenzierung wurden insgesamt 79.320 mRNA-Transkripte, 10.662 bekannte lncRNA-Transkripte und 11.412 neue lncRNA-Transkripte nachgewiesen. Insgesamt wurden 42 bekannte und 179 neue differentiell exprimierte lncRNAs und 702 differentielle mRNAs in der Mäuseniere exprimiert. Das Histogramm und das Vulkandiagramm zeigten, dass es in der alten Mäuseniere 347 hochregulierte mRNA-Transkripte und 355 herunterregulierte mRNA-Transkripte sowie in der alten Mäuseniere 130 hochregulierte lncRNA-Transkripte und 91 herunterregulierte lncRNA-Transkripte gabalte Mäuseniere(Abb. 2).

Alterungsbedingte unterschiedlich exprimierte mRNAs

Um die Rolle von mRNAs im Nierenalterungsprozess weiter zu untersuchen, wurden GO- und KEGG-Analysen an mRNAs durchgeführt, die in den Mäusenieren unterschiedlich exprimiert wurden (Abb. 3). Die GO-Anreicherungsanalyse zeigte, dass unterschiedlich exprimierte mRNAs an biologischen Prozessen (z. B. Phosphorylierung, Oxidations-Reduktionsprozess), molekularen Funktionen (Proteinbindung, Metallionenbindung) und zellulären Komponenten (z. B. Membran, Zytoplasma) angereichert waren (Abb. 3a). Die KEGG-Signalweganreicherungsanalyse ergab, dass unterschiedlich exprimierte mRNAs an alterungsbedingten Signalwegen wie der oxidativen Phosphorylierung, dem AMPK-Signalweg, dem Wnt-Signalweg, dem Rap1-Signalweg und altersbedingten Erkrankungen beteiligt sind (Abb. 3b). Differenziell exprimierte mRNAs wurden in die Heatmap-Analyse einbezogen (Abb. 3c).

mRNA-lncRNA-Koexpressionsnetzwerk und qRT-PCR-Verifizierung der lncRNAs

We observed the potential trans-regulated target genes of lncRNAs using RIsearch analysis. A total of 22,917 pairs were obtained between mRNAs and lncRNA transcripts based on trans energy >-70. Then, we choose the pairs with Spearman correlation coefcients>0.9 oder<-0.9 between mRNA-lncRNA based on the RNA expression levels, including a total of 11 mRNAs and 28 lncRNA transcripts (Fig.  4a). Ten, 5 known lncRNAs and 5 novel lncRNAs in the mRNA-lncRNA expression network were selected to validate the accuracy and reliability of the RNA-seq data. The lncRNAs were described in the heatmap analysis. We designed appropriate primers and amplified lncRNAs. Similar to the RNA-seq data, the qRT–PCR results showed that 5 known lncRNA transcripts, ENSMUST00000145042, ENSMUST00000208671, ENSMUST00000220013, ENSMUST00000205549, and ENSMUST00000197656 (Gm43360), and 3 novel lncRNA transcripts, MSTRG.34276.1, MSTRG.39067.1, and MSTRG.3870.1, were consistent with the sequence data (Fig.  4b-c). In addition, the other two lncRNAs were consistent with the sequencing results, but the results were not statistically signifcant (Fig. 4c). In general, the qRT–PCR results were consistent with RNA-seq data.

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