Schutzwirkung von ätherischem Thymus-Serrulatus-Öl auf Cadmium-induzierte Nephrotoxizität bei Ratten durch Unterdrückung von oxidativem Stress und Herunterregulierung der NF-κB-, INOS- und Smad2-mRNA-Expression
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Mohd Nazam Ansari1,*, Najeeb Ur Rehman1,*, Aman Karim2, Faisal Imam3 und Abubaker M. Hamad4,5
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Abstrakt:
Ziel der Forschung war es, die Schutzwirkung des ätherischen Öls aus Thymus serru latus Hochst zu untersuchen. von Benth. (TSA-Öl) gegenCadmium(Cd)-induziertNieren-Toxizität. Das experimentelle Protokoll wurde unter Verwendung von 30 gesunden erwachsenen Wistar-Albino-Ratten entworfen, die in Dateigruppen mit sechs Tieren in jeder Gruppe eingeteilt wurden. Gruppe 1 wurde als normale Kontrolle behandelt und die Gruppen 2, 3, 4 und 5 wurden mit behandeltCadmiumChlorid (CdCl2, 3 mg/kg, IP) für 7 Tage. Gruppe 3 wurde ebenfalls mit Silymarin (100 mg/kg, PO) als Standardgruppe behandelt, während den Gruppen 4 und 5 TSA-Öl in Dosen von 100 bzw. 200 mg/kg PO verabreicht wurde. Die Nephrotoxizität wurde mit verschiedenen Parametern wie zNiereFunktionsmarker, oxidative Stressmarker (Glutathion (GSH) und Malondialdehyd (MDA)) und Messenger-Ribonukleinsäure (mRNA)-Expressionsniveaus von Entzündungsfaktoren. Auch die histologischen Untersuchungen wurden im Versuchsprotokoll ausgewertet. Die mit CdCl2- behandelten Gruppen zeigten einen signifikanten Anstieg der SerumspiegelNiereFunktionsmarker zusammen mit MDA-Spiegeln im Nierenhomogenat. Jedoch,Nieren-Es wurde festgestellt, dass der GSH-Spiegel signifikant reduziert war. Es wurde festgestellt, dass CdCl2 die Kernfaktorspiegel von kappaB (NF-κB p65), induzierbarer Stickoxidsynthase (iNOS) und kleinen Müttern gegen Dekapentaplegie (Smad2) im Vergleich zur normalen Kontrollgruppe signifikant hochregulierte. Auf der anderen Seite verbesserte TSA-Öl signifikant die erhöhten Spiegel von Serum-Nierenfunktionsmarkern, nicht-enzymatischen Antioxidantien und Lipidperoxidation. Darüber hinaus regulierte TSA-Öl die erhöhte Expression von NF-κBp65, iNOS und Smad2 in Cd-vergifteten Ratten signifikant herunter. Darüber hinaus waren die histologischen Veränderungen in den Gewebeproben der Niere der mit Cd behandelten Gruppen in den mit Silymarin und TSA-Öl behandelten Gruppen signifikant verbessert. Die vorliegende Studie zeigt, dass TSA-Öl Cd-induzierte verbessertNieren-Verletzung, und es wird auch vorgeschlagen, dass die beobachtete nephroprotektive Wirkung auf das antioxidative Potenzial von TSA-Öl und die Heilung aufgrund seiner entzündungshemmenden Wirkung zurückzuführen sein könnte.
Schlüsselwörter:Cadmium; Entzündung; NF-κB; Nierenverletzung; Smad 2; Thymus serrulatus
1. Einleitung
Die Exposition gegenüber Umweltchemikalien bleibt weltweit ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit. Die Exposition gegenüber Cadmium (Cd), einem der reaktivsten toxischen Metalle, hat in der Biosphäre sowohl aus natürlichen als auch aus anthropogenen Quellen zugenommen [1]. Die Cd-Exposition ist auch auf die Kontamination von Boden, Luft, Wasser und Lebensmitteln sowie Zigarettenrauch zurückzuführen [2]. Eine deutlich gesteigerte Aufnahme bei gleichzeitig verminderter Ausscheidungsrate führt zu einer erhöhten Cd-Belastung in verschiedenen Organen. Das Cd kann je nach Dosis, Weg und Dauer mehrere Organe schädigen, wirkt sich aber hauptsächlich ausNierenund verursacht eine Nierenfunktionsstörung [3].
DasNierensind lebenswichtige Organe im menschlichen Körper und für verschiedene wesentliche Funktionen verantwortlich, einschließlich der Entfernung schädlicher Metaboliten, stickstoffhaltiger Abfälle und einiger Medikamente mit dem Urin [4]. Frühere Studien berichteten, dass die Cd-Toxizität zu einer irreversiblen Funktionsstörung von führtNieren-Tubuli [5] und verursacht eine verminderte Entfernung der toxischen Chemikalien, Medikamente oder beides, die zu akuten führenNiereVersagen. Darüber hinaus,Nieren-Verletzungen durch chronische Cd-Exposition können zu chronischem Nierenversagen führen und unbehandelt zum Tod führen [6,7]. Die Cd-Akkumulation in den proximalen gewundenen Tubuli behindert die tubuläre Reabsorption und führt zu Polyurie und Proteinurie. Es wurden Studien zu häufigen abnormalen Wirkungen von Cd auf die Nierenfunktion durchgeführt, aber es fehlt noch an detaillierten Informationen zu molekularen Mechanismen und es besteht die Notwendigkeit, diese weiter zu untersuchen [8].
Studien in den letzten Jahrzehnten ergaben, dass die maximale Wahrscheinlichkeit vonNieren-Schäden sind auf die Freisetzung von Cd in der Zelle zurückzuführen, die oxidativen Stress hervorruft [9,10]. Einer der vorgeschlagenen Mechanismen ist die Störung des natürlichen antioxidativen Abwehrsystems, das weiter die Überproduktion von freien Sauerstoffradikalen (OFR) verursacht [11] und zu einem verringerten Glutathion (GSH)-Spiegel und damit zu einer durch oxidativen Stress verursachten Apoptose führt [ 12]. Von mehreren berichteten Mechanismen sind ein verringerter GSH-Gehalt und OFR-induzierte Zellschäden hauptsächlich für die Lipidperoxidation verantwortlich [13,14].
Frühere Literatur stellt auch fest, dass die Korrelation zwischen oxidativem Stress und Entzündung verschiedene verstärktNieren-Krankheiten [15]. Daher kann vermutet werden, dass die Nierentoxizität durch Cd über komplexe intrazelluläre Signalwege verursacht wird, die hauptsächlich durch oxidativen Stress gesteuert werden. Kernfaktor-κB (NF-κB) kontrolliert mehrere Entzündungsgene in allen Zelltypen [16]. NF-κB ist die Hauptursache für verschiedeneNiereKrankheiten und kann durch Cd-Exposition aktiviert werden. Chronische Nierenerkrankungen wurden sowohl in Menschen- als auch in Tiermodellen durch Hochregulierung von Smad2-Proteinen festgestellt [9]. Frühere Studien stellten fest, dass die Herunterregulierung von NF-κB und Smad2 vorteilhafte Mechanismen für die entzündungshemmenden Medikamente sein könnten [17].
Unter den Behandlungsrichtlinien wird die Hypothese aufgestellt, dass die Abschwächung von Cd-induziertem oxidativem Stress unter Verwendung von Antioxidantien entweder aus natürlichen oder synthetischen Quellen als der wichtigste mögliche Ansatz für die Behandlung von Cd-induzierter Nephrotoxizität angesehen wird. Daher haben Forscher kürzlich nach Abwehrmechanismen gegen durch Chemikalien oder Medikamente verursachte Toxizität gesucht und auch biologisch aktive Verbindungen mit antioxidativer und entzündungshemmender Wirkung in Betracht gezogen [18,19].
In verschiedenen Teilen der Welt werden verschiedene Arten der Gattung Thymus traditionell zur Behandlung verschiedener Erkrankungen wie Bronchitis, Asthma, Keuchhusten, Laryngitis, Tonsillitis und Husten eingesetzt [20]. Thymus serrulatus Höchst. Ex Benth (Familie Lamiaceae) wächst in Äthiopien und wird traditionell zur Behandlung von Influenza [21] und Husten [22] eingesetzt. T. serrulatus ist ein stark verzweigter mehrjähriger Halbstrauch, der in den afromontanen und afroalpinen Zonen Äthiopiens und Eritreas wächst [23].
Es wurde berichtet, dass T. serrulatus anthelmintische, antibakterielle, fungizide [23], diuretische [22], gefäßerweiternde [24] und antihyperlipidämische [25] Aktivitäten besitzt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass das ätherische Öl von T. serrulatus (TSA-Öl) unter anderem antiseptische, antimykotische und vermifuge Eigenschaften besitzt [26]. Das ätherische Öl der Pflanze aus verschiedenen äthiopischen Fundorten zeigte eine vielversprechende hepatoprotektive Aktivität bei Ratten [27]. Darüber hinaus haben frühere Studien gezeigt, dass die pharmakologischen Aktivitäten des ätherischen Öls positiv mit dem Vorhandensein von Wirkstoffen wie Thymol, Carvacrol, p-Cymen, -Terpinen und Rosmarinsäure korrelieren [26,27]. Andererseits sind Thymol und Carvacrol, die als Hauptbestandteile in ätherischen Ölen gefunden wurden, wichtige Naturprodukte mit Radikalfängeraktivitäten und antioxidativen Eigenschaften [28]. Eine frühere Studie berichtete, dass eine Kombination aus Thymol und Carvacrol einen synergistischen Nephroschutz hatte
Wirkung, die auf antioxidative, entzündungshemmende und antiapoptotische Aktivitäten zurückgeführt werden könnte [29]. Darüber hinaus verursachten Thymol und Carvacrol, die als Hauptbestandteile in ätherischen Ölen enthaltenden Pflanzen gefunden wurden, ebenfalls eine Abnahme des Immunglobulin E (IgE), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin{ {6}} (IL-5) und Interleukin-13 (IL-13)-Spiegel sowie die Anzahl der Entzündungszellen, die Atemwegserkrankungen verursachen [30].
Soweit wir wissen, wurde die Wirkung von T. serrulatus auf die Nephrotoxizität nicht berichtet. Daher stellten wir in dieser Studie die Hypothese auf und versuchten, die nephroprotektive Wirkung des ätherischen Öls, das aus T. serrulatus äthiopischen Ursprungs extrahiert wurde, gegen Cd-induzierte Nephrotoxizität unter Verwendung von Wistar-Albino-Ratten durch Bewertung zu untersuchenNiereFunktionsmarker, Entzündungsmarker, antioxidativer Status und histologische Veränderungen.
2. Ergebnisse
2.1. Ausbeute an ätherischen Ölen (Prozent)
Die Hydrodestillation des oberirdischen Teils von T. serrulatus ergab 0,09 Prozent (v/w) blassgelbes ätherisches Öl mit einem charakteristischen Geruch.
2.2. Wirkung von TSA-Öl auf Biomarker der Nierenfunktion
Bei Ratten, die nur mit Cd behandelt wurden (3 mg/kg, IP ) für 7 Tage. Die Verabreichung von TSA-Öl und Silymarin bei Cd-vergifteten Ratten verbesserte jedoch wesentlich die Cd-induziertenNiereSchaden, wie durch unterdrückte Blutharnstoff-, Harnsäure-, Kreatinin- und BUN-Spiegel angegeben (Abbildung 1A–D).
2.3. Wirkung von TSA-Öl auf Lipidperoxidation und oxidativen Stress
DasNieren-Gewebe von Ratten zeigte signifikant erhöhte Lipidperoxidationsspiegel in Bezug auf MDA und eine Verringerung des GSH-Gehalts nach Cd-Gabe. Darüber hinaus senkt die Behandlung mit TSA-Öl in Dosen von 100 und 200 mg/kg die MDA-Spiegel dosisabhängig bei Cd-vergifteten Ratten. Darüber hinaus waren die GSH-Spiegel in den mit TSA-Öl und Silymarin behandelten Gruppen im Vergleich zur Cd-Gruppe signifikant erhöht (Abbildung 2A, B).
2.4. Auswirkungen von TSA-Öl auf die mRNA-Expression von p65, NF-κB, iNOS und Smad2
Die Veränderungen in den Signalereignissen wurden durch Western-Blotting bewertet. Die Western-Blot-Analyse legte nahe, dass die Cd-Exposition die NF-κB-p65-, iNOS- und Smad2-mRNA-Expression im Vergleich zur Referenzgruppe signifikant (p < 0.001)="" hochregulierte.="" die="" behandlung="" mit="" tsa-öl="" regulierte="" die="" p65-,="" nf-κb-,="" inos-="" und="" smad2-mrna-expression="" dosisabhängig="" im="" vergleich="" zu="" ratten,="" die="" nur="" einer="" cd-exposition="" ausgesetzt="" waren,="" signifikant="" herunter="" (abbildung="">
2.5. Wirkung von TSA-Öl auf die Histopathologie
Die histopathologische Analyse der Ratten der Kontrollgruppe zeigte NormalwerteNierehistologische Architektur mit normalen gewundenen Tubuli, Glomerulus und Bowman-Kapsel mit normalem Abstand sowie dem normalen Status von Kollagenfasern und Periodsäure-Schiff (PAS)-positiven Materialien wie Basalmembran (Abbildung 4). Mikrofotografien der toxischen Gruppe zeigen abnorme Glomeruli (G), Degeneration (D) und Nekrose (N) der gewundenen Tubuli und einen degenerierten und fast fehlenden Bowman-Raum. Abnorme gewundene Tubuli weisen auf eine histologische Störung (T), Blockierung durch beschädigtes Gewebe (B) und Nekrose hin. Mikrophotographie der mit Masson's Trichomen (MT) gefärbten toxischen Gruppe zeigt erhöhtes Kollagenmaterial (C). Darüber hinaus zeigt die Mikrofotografie der PAS-gefärbten toxischen Gruppe eine abnormale Ablagerung von PAS-positiven Materialien (P), die das Parenchym der Niere verdrängt haben; es zeigt auch Schwäche oder Verlust der intakten Basalmembran (L). Die Behandlung mit TSA-Öl in niedriger Dosis stellte die normalen Glomeruli und die normalen gewundenen Tubuli wieder her, obwohl immer noch ein leichtes Leiden unter toxischen Wirkungen in Form von blockierenden Tubuli (B) und wenig erhöhtem Kollagenmaterial (C) sowie einer abnormalen Ablagerung von bestand PAS-positive Materialien (P). Die Behandlung mit TSA-Öl bei einer hohen Dosis ergab histologische Bilder von fast normalem histologischem Erscheinungsbild, das dem der Standardbehandlung sehr ähnlich war (Vergrößerung 400× und Maßstabsbalken 20 &mgr;m für alle Mikrofotografien).
3. Diskussion
In der Umwelt sind Schwermetalle normalerweise vorhanden und neigen zur Absorption, Oxidation und Beeinträchtigung des Zellschicksals. Insbesondere Cd ist eine natürliche industrielle Verbindung, die zahlreiche toxische und gefährliche Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit hat, einschließlich Nephrotoxizität [31,32]. Seine Ablagerung in verschiedenen Organen verursacht oxidativen Stress, der die Funktion des nativen Antioxidanssystems schwächt und in der Folge zur Entwicklung verschiedener schwerer pathologischer Erkrankungen führt [33]. Der Weg der Cd-induzierten Toxizität umfasst die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), die anschließend eine Nierenschädigung verursachen [34]. Daher kann davon ausgegangen werden, dass Antioxidantien ein guter Angriffspunkt für den möglichen therapeutischen Ansatz zur Cd-assoziierten Toxizität sein könnten [35]. In diesem Bericht untersuchten wir die vielversprechende verbessernde Wirkung von TSA-Öl auf Cd-induzierten oxidativen Stress und Nierenschäden an Ratten.
Schwerwiegende Cd-induzierte Nierenschäden können mit erhöhten Serumspiegeln von Harnstoff, Harnsäure und Kreatinin aufgrund eines Austritts in den Blutkreislauf einhergehen [36,37]. In der vorliegenden Studie wurden auch signifikant erhöhte Werte von Harnstoff, Harnsäure und Kreatinin im Serum nach 7-tägiger Cd-Exposition berichtet, was die schwere Nierenschädigung bestätigte (Abbildung 1). Die beobachteten Ergebnisse bestätigen frühere Studien [19,38]. Die Verabreichung von TSA-Öl in beiden Dosierungen (100 und 200 mg/kg, PO) verbessert signifikant die durch Cd induzierte Nierenfunktionsstörung, was durch die verringerten Serumspiegel von Harnstoff, Harnsäure und Kreatinin unterstützt wurde. In der vorliegenden Studie wurde beobachtet, dass eine Cd-Exposition zuNiereSchäden durch Verstärkung der Lipidperoxidation und Störung des natürlichen Antioxidanssystems, was auf erhöhten oxidativen Stress hinweist. Beobachtete Ergebnisse deuten darauf hin, dass TSA-Öl Cd-induzierte Veränderungen in Antioxidans-bezogenen Variablen bei Ratten verhindern könnte. Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Kawamoto et al. [39], die über eine erhöhte Lipidperoxidation nach Cd-Exposition berichteten. Frühere Studien berichteten, dass eine chronische Cd-Exposition zu verminderten nichtenzymatischen (Gewebe-GSH) Antioxidantien führte [40]. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie bestätigen die von Koyuturk et al. [41], die einen reduzierten renalen GSH-Gehalt bei Cd-vergifteten Ratten beschrieben. Der verringerte GSH-Gehalt könnte auf seinen Verbrauch bei der Verhinderung der durch oxidativen Stress verursachten Lipidperoxidation [41] und der Entgiftung von Schwermetallen [42,43] zurückzuführen sein. Unsere Ergebnisse stimmen jedoch nicht mit denen von Kamiyama et al. [44], die einen erhöhten GSH-Spiegel in der Niere bei mit Cd behandelten Ratten beschrieben. Die Lipidperoxidation und der Antioxidansspiegel bei mit Cd behandelten Ratten wurden durch die Verabreichung von TSA-Öl signifikant moduliert, was auf eine Abnahme der ROS, eine Neuausrichtung des antioxidativen Abwehrsystems oder beides hinweist. Diese Ergebnisse bestätigen die einer früheren Studie, die die verbessernde Wirkung von Thymochinon gegen chemikalieninduzierte Nierenschäden beschrieb [45].
Apoptose tritt in Geweben auf und unterscheidet sich von Nekrose bei bestimmten funktionellen Störungen [46]. Apoptose ist eines der Hauptmerkmale von Cd-bezogenenNiereVerletzung. Früher wurde beschrieben, dass die Cd-Toxizität Apoptose in proximalen Tubuli durch Stimulierung des NF-kB-Signalwegs verursacht, was zu einer Nierenfunktionsstörung beiträgt [47,48]. Auch in dieser Studie wurde eine erhöhte NF-kBp65-Proteinexpression bei Cd-behandelten Ratten beobachtet. Jedoch stellte die Verabreichung von TSA-Öl bei Cd-behandelten Ratten die NF-kBp65-Proteinexpression im Wesentlichen wieder her. Die beobachteten Befunde stimmen mit den bisherigen Befunden überein [18,19]. Daher hat die NF-kB-Hemmung bei Cd-vergifteten Ratten die entzündungshemmende Wirkung von TSA-Öl bewiesen.
Induzierbare Stickoxidsynthase (iNOS) wird stark bei entzündlichen Zuständen und Infektionen exprimiert. Somit ist es eine lebenswichtige Komponente der adaptiven Reaktion des Wirts auf schädliche Stimuli. Es wurde früher berichtet, dass die Cd-induzierte Nierenschädigung durch die Stickoxidsynthese durch iNOS-Stimulation vermittelt wird [49]. Auch in dieser Studie wurde festgestellt, dass die Cd-Exposition eine erhöhte iNOS-Expression verursacht (Abbildung 3B), während TSA-Öl in beiden Dosen die iNOS-Expression bei Cd-vergifteten Ratten signifikant umkehren konnte.
Frühere Literatur berichtete, dass Cd eines der toxischsten Schwermetalle ist und hauptsächlich von den proximalen Tubuli absorbiert und hauptsächlich in der Nierenrinde akkumuliert wird, was zu Läsionen in den proximalen gewundenen Tubuli führt [50]. Diese Ergebnisse bestätigen die der vorliegenden Studie. HauptNieredie Schädigung wurde durch das Vorliegen einer signifikanten Schädigung der Glomeruli bei Cd-behandelten Ratten verifiziert. Diese Befunde bestätigen die von Damek Poprawa und Sawicka-Kapusta [51], die über eine Atrophie der glomerulären Kapillaren und eine Nekrose der proximalen Tubuli berichteten. Die Erkenntnisse derNiereFunktionsmarker und Marker für oxidativen Stress – wobei TSA-Öl Cd-induzierte degenerative Veränderungen linderte und verbesserteNiereFunktion aufgrund seiner möglichen antioxidativen und entzündungshemmenden Wirkung – wurden durch histopathologische Beobachtungen bestätigt.
4. Materialien und Methoden
4.1. Chemikalien und Reagenzien
Cadmiumchlorid (CaCl2) wurde von Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, USA) bezogen.NiereFunktionsdiagnostik-Kits wurden von Crescent Diagnostics (Jeddah, KSA) bezogen. Antikörper (primär sowie sekundär) wurden von Santa Cruz (Dallas, TX, USA) bezogen. Die verwendeten Chemikalien waren analysenrein und von hoher Qualität, die keiner weiteren Reinigung bedurften.
4.2. Pflanzenmaterial und Extraktion
Frische oberirdische Teile von T. serrulatus Höchst. ex Benth wurde aus dem Berggebiet Amba Alaje, South Tigray, Äthiopien, gesammelt. Das Pflanzenmaterial wurde von einem Botaniker, Dr. Getinet Masresha, Department of Biology, University of Gondar, authentifiziert und das Exemplar wurde im Herbarium der Universität hinterlegt (TH-001/2011).
Die frischen oberirdischen Teile wurden in kleine Stücke geschnitten und einer Hydrodestillation für 3 h unter Verwendung einer Clevenger-Apparatur unterzogen. Die Hydrodestillation wurde 11 Mal durchgeführt, bis eine ausreichende Menge gesammelt wurde. Das gewonnene ätherische Öl wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur weiteren Verwendung in einem fest verschlossenen Behälter bei 4 ◦C gelagert [26]. Die berechnete Ausbeute an ätherischem Öl wurde in Prozent (Prozent v/w) ausgedrückt, bezogen auf das Gewicht des frischen Pflanzenmaterials.
4.3. Tiere
Dreißig männliche Albino-Ratten mit einem Gewicht von 180–220 g wurden von Animal House, College of Pharmacy, Prince Sattam Bin Abdulaziz University (PSAU), KSA, bezogen. Die Ratten wurden 1 Woche lang akklimatisiert und unter 12-stündigen Hell/Dunkel-Zyklen mit Standardlaboreinrichtungen gehalten. Während der Versuchs- und Eingewöhnungszeit wurden die Tiere mit einer Pelletdiät und freiem Zugang zu Wasser gefüttert. Anweisungen und Richtlinien, die von der Tierpflegeeinheit, PSAU, KSA, bereitgestellt wurden, wurden bei der Durchführung aller Experimente befolgt. Das Protokoll wurde vom Bio-Ethical Research Committee (BERC), PSAU (BERC-004-12-19) vorab genehmigt.
4.4. Experimentelles Design
Zur Bewertung der nephroprotektiven Wirkung von TSA-Öl gegen Cd-induzierte Toxizität wurden Ratten zufällig in fünf Gruppen eingeteilt (n=6). Gruppe 1 (normale Kontrolle) erhielt 7 Tage lang täglich physiologische Kochsalzlösung (0,9 Prozent NaCl). Gruppe 2 (toxische Kontrolle) erhielt Cadmiumchlorid (3 mg/kg, IP, 7 Tage). Gruppe 3 (Positivkontrolle) wurde CdCl2 und Silymarin (100 mg/kg, PO) an 7 aufeinanderfolgenden Tagen gemeinsam verabreicht. Den Gruppen 4 und 5 wurde CdCl 2 und TSA-Öl in Dosen von 100 bzw. 200 mg/kg (PO, 7 Tage) gleichzeitig verabreicht. Die Dosis von CdCl2 wurde basierend auf früher berichteter Literatur ausgewählt [19,52].
Nach 24-stündiger Behandlung wurden alle männlichen Ratten mit einer kleinen Menge Diethylether betäubt, um die Blutproben aus dem retroorbitalen Plexus zu sammeln, gefolgt von einer Zentrifugation, und die Separation des Serums wurde durchgeführt und bis zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert zur Feststellung vonNiereFunktionsmarker (wie Harnsäure, Kreatinin und Harnstoff). Nach erfolgreicher Serumgewinnung wurden beide Nieren von allen Ratten isoliert. Die linkeNierewurde sofort bei -80 ◦C bis zur weiteren Analyse von oxidativen Stressmarkern (MDA und GSH) und Western-Blot-Analyse gelagert. Inzwischen wurde die rechte Niere für histopathologische Untersuchungen aufbewahrt.
4.5. Bestimmung des Nierenfunktions-Biomarkers
sBiomarker vonNiereFunktion, dh Harnsäure, Harnstoff und Kreatinin, wurden unter Verwendung spezifischer kommerzieller Kits gemäß den in den Protokollen der Hersteller erwähnten Methoden bewertet.
4.6. Bestimmung von Markern für oxidativen Stress in der Niere
Die Gewebe wurden homogenisiert und zerkleinert (1 0 Prozent w/v) in eiskaltem 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7,4, und die Lösung wurde für 30 min bei 12,000 × g und 4 ◦ zentrifugiert C. Das erhaltene Homogenat wurde zur Abschätzung der GSH- und MDA-Gehalte verwendet.
Der MDA-Lipidperoxidationsmarker wurde unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Verfahrens geschätzt [53]. Kurz gesagt, 0,25 ml Homogenat wurden bei einer Temperatur von 37 Grad für 1 Stunde in einem metabolischen Schüttler inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,5 ml 0,67 % Thiobarbitursäure (TBA) und 0,5 ml 5 % (w/v) gekühlte Trichloressigsäure (TCA) hinzugefügt , gefolgt von Zentrifugation (1000 × g, 15 min). Danach wurde der Überstand für 10 min in einem siedenden Wasserbad gehalten. Die entwickelte Extinktion wurde bei 535 nm gemessen, dh es wurde eine rosa Farbe beobachtet.
Für GSH, die Jollow et al. [54] Methode wurde gefolgt. Nach Präzipitation von 1 ml PMS mit 1 ml Sulfosalicylsäure (4 Prozent) wurden die Testproben kurzzeitig inkubiert (4 °C, 1 h), gefolgt von einer Zentrifugation (1200× g , 15 min, 4 ◦C). Das Assay-Gemisch enthielt Überstand (0,1 ml), Phosphatpuffer (0,1 M, pH 7,4) (1,7 ml) und Dithiol-bis-2-nitrobenzoesäure (DTNB). (0,4 Prozent in Phosphatpuffer, 0,1 M, pH 7,4) (0,2 ml) in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml. Die Extinktion der Proben wurde bei 412 nm innerhalb von 5 min nach Zugabe von DTNB zu den Reaktionsmischungen analysiert.
4.7. Western-Blot-Technik
Western-Blot-Analyse und Proteinextraktion wurden wie in der vorherigen Studie erwähnt durchgeführt [55].NiereGewebe wurden zerkleinert und das Homogenat wurde in einer Protease-Inhibitor-Mischung und kaltem Protein-Lyse-Puffer hergestellt [55]. Um die Gesamtproteine zu isolieren, wurden die Gewebelysate für 60 min in Eis aufbewahrt, mit alternativem Vortexen (nach 10 min), fortgesetzt mit der Zentrifugation bei 12,000× g (4 ◦C, 10 min). Das Verfahren von Lowry et al. [56] wurde befolgt, um das Gesamtprotein zu bestimmen. Für die Western-Blot-Analyse wurde Protein (25–50 µg) kurz aus jeder Gruppe isoliert und auf Nitrozellulosemembranen verschoben, die von Bio-Rad USA bezogen wurden. Die sofortige Blockierung der Protein-Blots erfolgte bei 4 ◦C (für 24 h); danach wurde eine Inkubation mit primären Antikörpern gegen NF-κB p65, iNOS und Smad2 und Peroxidase-konjugierten sekundären Antikörpern bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Proteine wurden mit Hilfe eines Chemilumineszenz-Nachweiskits (GE Health Care, Mississauga, Kanada) analysiert. Die Proteinbandenintensität wurde unter Verwendung von ImageJ (NIH, Bethesda, USA) auf Beta-Aktin-Banden normalisiert. Die Bilder wurden mit einem aC-Digit-Chemilumineszenz-Western-Blot-Scanner aufgenommen, der von LI-COR, USA, bezogen wurde.
4.8. Histopathologische Analyse
RechtNierein 10 % neutralem Formalin fixierte Gewebeproben wurden in einer Gewebeverarbeitungsmaschine (ASP300s, Leica Biosystems, IL, USA) verwaltet; Jede Probe wurde in Paraffinwachs eingebettet und in 4 5- µm dicke Abschnitte geschnitten. Drei Schnitte jeder Gruppe wurden ausgewählt und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E)-Farbstoff, Periodsäure-Schiff (PAS)-Färbung und Masson-Trichrom (MT)-Färbung gefärbt [57]. Alle Gewebeschnitte wurden unter Verwendung eines Mikroskops (Olympus BX 52) zur histopathologischen Beschreibung analysiert, die von einem Histopathologen aufgenommen wurde, der gegenüber den Versuchsgruppen verblindet war. Zum Fotografieren wurde die Kamera Olympus DP21 verwendet, die über dem Mikroskop befestigt war.
4.9. Statistische Analyse
Die Werte wurden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Eine Einweg-ANOVA-Analyse unter Verwendung des Post-hocTukey-Tests wurde verwendet, um die Signifikanz der biochemischen Daten der verschiedenen Gruppen zu messen. Unterschiede wurden bei p-Werten < 0,05="" relativ="" zur="" normalen="" kontrollgruppe="" oder="" zur="" toxischen="" kontrollgruppe="" gemessen.="" die="" statistische="" untersuchung="" wurde="" mit="" graphpadprism="" v.="" 4.0="" (usa)="">
5. Schlussfolgerungen
Diese Studie kommt zu dem Schluss, dass das ätherische Öl von T. serrulatus die Cd-induzierte Nierenfunktionsstörung verbessert, die möglicherweise durch eine Verbesserung der veränderten biochemischen und oxidativen Stressparameter zusätzlich zur Verbesserung der histologischen Strukturen vermittelt wurde. Darüber hinaus könnte T. serrulatus ein geeigneter Wirkstoff sein, der in Zukunft für den Nierenschutz und entwickelt werden sollNiere-bezogene Störungen.
Finanzierung:Diese Forschung erhielt keine Drittmittel.
Erklärung zur Datenverfügbarkeit:Eine Datenfreigabe entfällt.
Interessenskonflikte:Die Autoren geben keine Interessenkonflikte an. Die Geldgeber spielten bei der Gestaltung der Studie keine Rolle; bei der Erhebung, Analyse oder Interpretation von Daten; beim Schreiben des Manuskripts; oder bei der Entscheidung zur Veröffentlichung der Ergebnisse.
Probenverfügbarkeit:Proben des ätherischen TSA-Öls sind bei den Autoren erhältlich.
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