Going Micro bei Leptospirose-Nierenerkrankung Ⅱ

4. Immunantworten des Wirts auf Leptospira spp.

Der Hauptweg von Leptospira ist das direkte Eindringen von Schleimhäuten oder geöffneter Haut durch Blut, Gewebe, Urin oder kontaminiertes Wasser, das sich im gesamten Körperkreislauf ausbreitet und sich in mehreren Organen ausbreitet, wie zLeber, Lunge und proximaler Tubulus desNephron in den Nieren, wo es sich vermehren und einen Monat lang überleben kann [51]. In der Anfangsphase der Infektion ist dieangeborene Immunantwortspielt eine grundlegende Rolle als erste Verteidigungslinie bei Leptospirose und beeinflusst die Reaktion vonMustererkennungsrezeptoren, Makrophagen-Phagozytose, Induktion extrazellulärerAkkumulation von Neutrophilen, UndEingriff des Komplementsystems [52].

DerImmunreaktionbeim Menschen spielt dabei eine wesentliche RolleEntwicklung klinischer Symptome, ebenso wie die Virulenzfaktoren einiger pathogener Stämme. Die meisten Leptospirose-Erkrankungen beim Menschen verlaufen asymptomatisch oder mild, und nur 10 % der Fälle entwickeln schwere Formen mit Multiorganversagen und erhöhten Sterblichkeitsraten im Zusammenhang mit aZytokinsturmund ein Immunparalysestatus. Pathogene Arten stimulieren in der Bakteriämiephase eine humorale Reaktion, obwohl das anschließende Verhalten derImmunreaktionist unklar. In Studien an Patienten mit mehreren klinischen Manifestationen von Leptospirose wurde die Schwere des klinischen Bildes mit verschiedenen Serumzytokinspiegeln wie TNF-, IL-10 und IL-6 in Verbindung gebracht [53]. Diese Schlussfolgerung bleibt umstritten [54]. Diese Erkrankungen haben zu einem erhöhten Interesse am Verständnis der Immunantwort im Allgemeinen und der biologischen Ereignisse, die während einer Infektion auftreten, geführt.

WIE LANGE DAUERT ES, BIS CISTANCHE WIRKT?

4.1. Leptospira und das Komplementsystem

Die proteolytische Aktivität leptospiraler Proteasen gegen die extrazelluläre Matrix ermöglicht das Eindringen der Infektion in den Kreislauf. Das Komplementsystem im Kreislaufsystem ist einer der Hauptmechanismen der angeborenen Immunantwort auf pathogene Leptospiren. Leptospira hat jedoch Strategien entwickelt, um dem Angriff des Komplementsystems zu entgehen, indem es Proteine ​​an Komplementmoleküle bindet und Proteasen wie Thermolysin produziert, ein thermostabiles neutrales Metalloproteinase-Enzym, das die C3-Proteinkette beeinflusst. Pathogene Stämme binden Faktor H (FH), Komplementfaktor-H-verwandtes Protein 1 (FHR-1), Faktor-H-ähnliches Protein 1 (FHL-1) und C4b-bindendes Protein (C4BP). davon sind für die Hemmung des Komplementsystems verantwortlich [55]. Es gibt drei Hauptstrategien zur Komplementumgehung pathogener Leptospiren [55,56] durch die Einwirkung von Wirtskomplementregulatoren, Wirtsprotease und bakterieller Protease. Als Komplementregulatoren verwendet Leptospira Faktor H (FH; ein Regulator des alternativen Komplementwegs) und C4-Bindungsprotein (C4BP; ein Regulator des klassischen und Lektin-Komplementwegs), um den Zerfall der C3-Konvertasen zu beschleunigen und auch als Cofaktoren für Faktor I zu fungieren für die Spaltung von C3b und C4b [57,58]. Leptospirales Protein (LcpA) bindet zusammen mit Vitronektin (Vn; ein Regulator des terminalen Signalwegs) C9 und hemmt dessen Polymerisation [59], wodurch möglicherweise die Bildung des membranaktivierenden Komplexes (MAC) blockiert wird [60]. Darüber hinaus bindet pathogenes Leptospira mehrere Wirtsproteasen, wie z. B. Plasminogenaktivator vom Urokinase-Typ (uPA), die aktives Plasmin [61] (eine Serinprotease) für die Verdauung von C3b, C4b und C5 auf der Leptospira-Oberfläche induzieren [62]. Darüber hinaus können Metalloproteasen und Thermolysin, die endogene Leptospira-Protease, mehrere Komplementproteine ​​(C2, C3, C4 und Faktor B) spalten und inaktivieren [60]. Die Kombination von Komplementregulatoren aus dem Wirt und pathogenen Leptospiren erleichtert die bakterielle Besiedlung der Zielorgane des Wirts [63].

4.2. Leptospiren und Neutrophile

Während einer Infektion löst die pathogene Spezies Leptospiren eine starke Aktivierung von Neutrophilen und eine proinflammatorische Reaktion aus. Neutrophile sind wichtig für die Kontrolle von Mikroorganismen, tragen aber auch zur Gewebeschädigung im Wirt bei. Es wurde gezeigt, dass geringe Mengen extrazellulärer Neutrophilenakkumulation aufgrund einer geringen Neutrophilenaktivität im Kreislauf die Leptospirämie erhöhen, was darauf hindeutet, dass die intravaskuläre Bildung von Neutrophilenrekrutierungen entscheidend für die Verhinderung der frühen Ausbreitung pathogener Leptospiren sein kann [64].

4.3. Leptospiren und Makrophagen

In der Anfangsphase einer Leptospira-Infektion spielen Makrophagen eine wichtige Rolle bei der Eliminierung der Spirochäten. Dieser Effektormechanismus hängt zusammen mit einer effizienten Zytokinreaktion mit der Phagozytenkontrolle und der Ausbreitung der Infektion zusammen, obwohl Leptospira spp. Es wurde gezeigt, dass es Apoptose in Makrophagen über den Fas/FasL-Caspase-8/-3-Weg induziert und deren Überleben und Proliferation im Wirt aufgrund der Freisetzung von mitochondrialem Faktor induzierenden Apoptose und Endonuklease bei Infizierten erleichtert Makrophagen [65]. Kürzlich wurden Untersuchungen zum Mikrotranskriptom von mit Leptospiren infizierten Makrophagen durchgeführt, um die epigenetischen Mechanismen wie die posttranskriptionelle Regulation durch RNA zu bestimmen. Mit Leptospira infizierte Makrophagen haben gezeigt, dass microRNAs (miRNAs) durch eine Infektion mit der Spirochäte reguliert werden, was zeigt, dass diese Regulierung für die Reaktion dieser Zellen des Immunsystems bei einer Leptospira-Infektion von entscheidender Bedeutung ist [66]. In menschlichen Makrophagen führt die Aktivierung der Entzündung, die durch reaktive Sauerstoffspezies und lysosomales Cathepsin B, das durch eine Leptospira-Infektion erzeugt wird, vermittelt wird, zu deutlichen Konzentrationen von NLRP3 und IL-18, was die Produktion von IL-1 begünstigt und zu einem Anstieg führt Die Möglichkeit einer Phagozytose und die schnelle Modellierung einiger Zytokine korrelierten mit der Leptospirose-Resistenz [67].

4.4. Humorale Reaktion auf Leptospira

Die spezifische humorale Reaktion gegen Leptospira ist durch die Produktion von IgM- und IgG-Antikörpern am dritten Tag nach Symptombeginn gekennzeichnet. Darüber hinaus wurde über eine IgA-Produktion vom ersten bis zum neunten Monat nach der Infektion berichtet; Tatsächlich wurde der IgM-Anstieg als alternatives Maß für die Frühdiagnose von Leptospirose verwendet [68]. Der Effekt der humoralen Reaktion bei Menschen mit Leptospirose ermöglicht die serologische Diagnose nach einer natürlichen Infektion [69]. Der wichtigste Aspekt der humoralen Reaktion bei einer Leptospira-Infektion könnte die Bildung schützender Antikörper sein. Derzeit verfügbare Impfstoffe gegen Leptospirose bestehen aus vollständigen Zellpräparaten und weisen Einschränkungen auf, wie z. B. eine geringe Wirksamkeit, zahlreiche Nebenwirkungen, eine geringe Bildung von Immungedächtnissen und einen fehlenden Kreuzschutz für Serovarunterschiede. Daher ist die Entwicklung neuer Impfstoffe für die Krankheitsbekämpfung notwendig, und derzeit wird daran geforscht, Impfstoffe durch genetische Immunisierung herzustellen [70]. Die OMPs von Leptospira gelten als Antigen mit besserer Immunogenität für B-Lymphozyten, zu denen die Strukturepitope OmpL187- 98, OmpL1173-191, OmpL1297-320, LipL4130-48, LipL{ gehören. {9}} und LipL41263-282 [71]. Diese Epitope sind vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung eines universellen Impfstoffs.

4.5. Adaptive Immunantwort auf Leptospira: T-Zellen und Zytokine

Pathogene Spezies von Leptospira induzieren eine durch T- und B-Lymphozyten vermittelte Immunantwort, begleitet von der Expression von Zytokinen, die mit Schwerkraftdiagrammen verbunden sein können. Die Aktivierung von T-Zellen während einer Infektion mit Leptospira löst die Entzündungsreaktion aus, hauptsächlich durch die Produktion von Zytokinen. Dies ist für die frühzeitige Eliminierung einer Infektion von entscheidender Bedeutung, aber die unkontrollierte Produktion entzündungsfördernder Zytokine kann auch zu einer Überproduktion von Zytokinen führen, gefolgt von einem Zustand der Immunparalyse, der zu Sepsis und Multiorganversagen führen kann. T-Lymphozyten produzieren IL-1, IL-6, IL-12, Interferon (IFN)- und TNF-, die als Chemo-Lockstoffe fungieren, um Leukozyten an der Infektionsstelle zu rekrutieren. Interessanterweise vermehrten sich die naiven δ-T-Zellen ex vivo in Kulturen mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMCs), die mit Antigenen von Leptospira stimuliert wurden, und produzierten dabei sowohl IL-17 als auch IFN [72]. Darüber hinaus zeigten mit Leptospirose infizierte Wildtyp-Mäuse im Vergleich zu nicht infizierten Mäusen höhere Mengen an Zytokinen, einschließlich IL-4, IL-10 und IL-13, Leptospira-induzierte chronische Mäuse Nephritis (Daf1-/- Mäuse) zeigten eine höhere Expression von Aktin der glatten Muskulatur, IL-10, IL-13, aber keinen Unterschied zwischen IL-12 und IL{{21} } Ebenen [73]. Daher könnten Daf1 und IL-17 eine entscheidende schützende Rolle beim Fortschreiten der CNE spielen, da sie die Verbindung zwischen Leptospira-induzierter muriner CNI und Nierenfibrose herstellen [72,73]. Allerdings ist die Hypothese einer ausgewählten Zytokinreaktion beim Fortschreiten der Krankheit bei menschlicher Leptospirose bisher noch nicht schlüssig. Bei Patienten mit schwerer Leptospirose und Lungenbeteiligung wurden im Vergleich zu Patienten mit leichter Leptospirose erhöhte Werte von IL-6, CXCL8 und IL-10 erhalten [53]. Diese hohen Zytokinkonzentrationen bei Patienten mit Leptospirose verdeutlichen deren Schlüsselrolle bei der Entwicklung einer schweren Leptospirose.

Bei Patienten mit schwerer Infektion werden CD4+-T-Lymphozyten mit einem proinflammatorischen Profil und Produzenten von IL-2 und IFN- gefunden, während CD4+ CD25hohe Produzenten von IL-10 sind fast nicht vorhanden. Die Regulierung der T-Lymphozyten-vermittelten Immunantwort scheint Gewebeschäden, die durch die Entzündungsreaktion auf Leptospiren entstehen, nicht zu verhindern. In CD4+-T-Lymphozyten von Menschen mit schwerer Leptospirose ist die Produktion von TNF- und anderen proinflammatorischen Zytokinen höher als bei Menschen mit der milden Form der Krankheit, was darauf hindeutet, dass diese Zytokine als Marker verwendet werden können Schweregrad in der immunologischen Phase der Infektion [74]. Die Produktion von IL-10 wurde mit dem Sterberisiko bei Menschen mit Leptospirose in Verbindung gebracht; Eine an exponierten und asymptomatischen Menschen durchgeführte Studie brachte jedoch die Produktion dieses Zytokins mit der Kontrolle der Entzündungsreaktion und dem Überleben in Verbindung [74]. Während einer Leptospira-Infektion werden Entzündungsmediatoren und die Wirkung einiger Leukozytenzellen, wie z. B. T-Lymphozyten, bei resistenten Personen schnell reguliert, im Gegensatz zu dem, was bei Personen mit schweren Formen der Leptospirose der Fall ist [75].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Immunantwort auf eine Leptospira-Infektion aufgrund des klinischen Verhaltens von Patienten mit Leptospirose, die mit den verschiedenen Virulenzfaktoren des bakteriellen Genoms interagieren, was Leptospira eine solide pathogene Kapazität verleiht, nicht vollständig verstanden ist.

5. Klinische Manifestationen

Die klinischen Manifestationen der Leptospirose sind vielfältig und reichen von leichten, unspezifischen Symptomen wie grippeähnlichen Symptomen (Fieber, Myalgie und Kopfschmerzen) bis hin zu schweren Symptomen zusammen mit Organverletzungen im Endstadium (z. B. AKI, akutes Leberversagen). und Blutungsdiathese, auch als Weil-Syndrom bekannt), akute Hämoptyse aufgrund einer Lungenblutung, akute Verwirrtheit aufgrund einer aseptischen Meningoenzephalitis und akute Herzinsuffizienz aufgrund einer akuten oder subakuten Myokarditis [7]. Dementsprechend bestehen die drei Indikatoren für eine vermutete Leptospirose-Infektion aus (i)akute fieberhafte Erkrankung, (ii) Gelbsucht und (iii)akute Nierenschädigung[12]. Prädiktoren für eine schwere Form der Leptospirose sind eine ausgeprägte Myalgie zu Beginn, eine starke Blutungsneigung und eine ausgeprägte Gelbsucht. Interessanterweise ist das Vorhandensein von beidem bereits vorhandenchronisches Nierenleiden(kleine Nierengröße) oder vergrößerte, verstopfte Nieren mit Anurie sind mit dem schlimmsten Ergebnis verbunden [12]. Daher sollten Patienten mit einer Leptospirose-assoziierten Nierenerkrankung umgehend behandelt werden.

6. Diagnose

6.1. Klinische Diagnose

Die Diagnose einer Leptospirose basiert auf der Vorgeschichte der Exposition, Risikofaktoren und klinischen Manifestationen. Ein hoher Verdachtsindex kann eine spätere Organschädigung verhindern. Allerdings werden die Symptome der Leptospirose oft mit anderen Ursachen des akuten Fiebersyndroms wie Dengue-Fieber, Malaria, Hepatitis und einer aktiven Autoimmunerkrankung verwechselt. Das Fehlen pathognomonischer Anzeichen einer Leptospirose bedeutet, dass die Diagnose vorläufig auf der Beurteilung von Fieber und Myalgie bei Patienten aus einem Endemiegebiet basiert. Aus diesem Grund ist eine Labordiagnostik der Leptospirose unerlässlich.

6.2. Labor Diagnose

Insbesondere in der akuten Phase ist die Diagnose einer Leptospirose im Labor schwierig. Dies kann durch die direkte Identifizierung von Spirochäten oder ihren Bestandteilen in Körperflüssigkeiten oder Geweben, die Isolierung von Leptospiren in Kultur oder den Nachweis bestimmter Antikörper in verschiedenen klinischen Phasen erfolgen. Leptospirose ist aufgrund ihres vagen klinischen Erscheinungsbilds schwer von Krankheiten wie Malaria, Dengue-Fieber, Rickettsien, Influenza, Hepatitis und Gelbfieber zu unterscheiden. Daher sind Labortests erforderlich, um die Diagnose zu bestätigen. Grundlage dieser Tests ist der Nachweis von Antikörpern gegen Leptospiren, Leptospiren selbst oder deren Desoxyribonukleinsäure (DNA). Die aktuelle Labordiagnostik umfasst sowohl die direkte Identifizierung (Nachweis von Leptospira-Spirocheten oder DNA in den Proben oder Isolierung des Organismus aus Proben) als auch den indirekten Nachweis (serologische Diagnose oder Serologie zur Identifizierung einer Leptospira-Infektion, die auf dem Nachweis spezifischer Antikörper gegen verschiedene basiert Leptospirale Antigene) (Tabelle 1).

6.2.1. Direkte mikroskopische Untersuchung, Kultur und Antigennachweis

Leptospiren sind dünne, helle, aktiv bewegliche Spiralen mit charakteristisch schneller Drehung (zuckende Beweglichkeit) unter dem konventionellen Dunkelfeldmikroskop (DFM). Für die Erkennung einer Zelle pro Feld sind etwa 10 Leptospiren/ml erforderlich. Bei einer um eine Woche längeren Infektionsdauer kommt es zu einer Verstorbenheit von etwa 10 % bei der DFM-Ausbeute (von 100 auf 90 %). Zur Erhöhung der Empfindlichkeit werden mehrere spezielle Färbemethoden eingesetzt; Warthin-Starry-Silver-Färbung [76] und Immunfärbung (Immunhistochemie, Immunfluoreszenz, immunomagnetisches Antigen-Capture und Immunperoxidase-Färbung [77]), die die Serovar-spezifischen Primärantikörper (isoliert oder in Kombination) erfordern.

Tabelle 1. Labortests zur Leptospirose-Diagnose.

LAMP, schleifenvermittelte isotherme Verstärkung; PCR, Polymerase-Kettenreaktion; NGS, Next-Generation-Sequenzierung; IHA, indirekte Hämagglutination; ELISA, enzymgebundener Immunosorbens-Assay; IgM, Immunglobulin M; MAT, makroskopischer Agglutinationstest; MCAT, Mikrokapsel-Agglutinationstest; DNA, Desoxyribonukleinsäure; DFM, Dunkelfeldmikroskopie

Parallel dazu ist eine Leptospira-Kultur aus Blut, Urin, Liquor und Biopsiegewebe in den ersten Tagen bis 10 Tagen nach Auftreten der Krankheitssymptome (Leptospirose-Stadium) möglich. Da sie langsam wachsen (6–8 Stunden Verdopplungszeit), anspruchsvoll und anfällig für Kontaminationen sind, müssen die Kulturproben mindestens 3–4 Monate aufbewahrt werden, bevor sie als negativ verworfen werden. Die Empfindlichkeit beträgt nur 23 %, ist aber notwendig für den Arzneimittelsensitivitätstest [6]. Daher besteht das EMJH-Medium (Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris) (Ölalbuminkomplex) hauptsächlich aus Rinderserumalbumin (Fraktion V), Tween 80, Ammoniumchlorid, Thiamin, Monokaliumphosphat, Dinatriumphosphat und verschiedenen Nährstoffen [78]. häufig verwendet, während für einige Serovare die spezielleren T80/40/LH-Medien (Polysorbat 40, Lactalbuminhydrolysat, Superoxiddismutase und Kaninchenserum) erforderlich sind [79]. Für die primäre Isolierung des großen und vielfältigen Spektrums anspruchsvoller pathogener Leptospiren scheint Hornsby-Alt-Nally (HAN) ein gutes Medium zu sein [80].

Der Nachweis leptospiraler Antigene durch Immunperoxidase, Immunfluoreszenz oder ein immunomagnetisches Antigen-Einfangsystem wurde für Proben mit geringer Bakterienbelastung entwickelt, oder die Dunkelfeldmikroskopie kann nicht verwendet werden, wird aber aufgrund der Beschränkung auf Primärantikörper nicht routinemäßig durchgeführt [77]. Im Gegensatz dazu Nukleinsäureerkennung mit neuartiger DNA-Amplifikation; Polymerasekettenreaktion (PCR) (d. h. Nested-PCR, quantitative PCR [qPCR]), schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) und Next-Generation-Sequenzierung (NGS) sind für eine frühe und genaue Labordiagnose wertvoll, insbesondere bei der Leptospira-Isolierung mittels Inokulation biologischer Medien und DNA-Hybridisierung (DNA-Sonde) [81,82]. Eine Vielzahl leptospiraler Ziele (z. B. 16S-ribosomale RNA) oder DNA können für die Diagnose amplifiziert werden [83] und die Echtzeit-PCR (RT-PCR) ist empfindlicher und spezifischer als die Standard-PCR [84]. Da einige RT-PCR-Primer möglicherweise an eine unspezifische Stelle binden und zu falsch positiven Ergebnissen führen, wurden die neuesten Echtzeit-Multiplex-PCR-Assays mit zwei Primersätzen entwickelt [85]. Nested PCR hilft auch bei der Erkennung spezifischerer und empfindlicherer DNA-Stellen mit zusätzlichen Primersätzen [86,87]. Aktuelle Trends bei der Leptospirose-Diagnose sind jedoch die Verwendung sowohl serologischer als auch molekularer Techniken wie PCR und ELISA (einfacher als der serologische Goldstandard MAT) für Länder mit begrenzten Ressourcen [88,89]. Darüber hinaus ist die LAMP-Technik [90] zum Nachweis eines 16S-rRNA-Gens (rrs) eine kostengünstige, schnelle und ertragreiche Methode zum Nachweis der pathogenen Leptospiren im Urin. Derzeit ist NGS die kulturunabhängigste Methode, die am präzisesten auf der Kerngenomanalyse in Körperflüssigkeiten (Blut und Urin) basiert [91] und die zukünftige Richtung von Leptospirose-Tests würde darin bestehen, sich in Richtung der molekularen Klassifizierung von Leptospiren zu bewegen, die die Einschränkungen von überwindet Kulturisolierung von Leptospiren aus klinischen Proben. Daher ist der Wert der PCR in der klinischen Diagnose von Leptospirose besonders groß und es entstehen mehrere moderne Techniken

6.2.2. Nachweis von Anti-Leptospira-Antikörpern

Es werden mehrere serologische Diagnosen verwendet; zum Beispiel gattungsspezifische Antikörpertests (indirekte Hämagglutination [IHA], Enzymimmunoassay [ELISA], Lepto Dri Dot [Latexagglutination], Mikrokapselagglutination [MCAT]) und Serovar-spezifische Antikörpertests (mikroskopischer Agglutinationstest [ MAT]) [92,93]. Daher sind MAT-Kriterien für die Diagnose (i) ein vierfacher Titeranstieg in gepaarten Seren (Serokonversion der aktuellen Infektion) oder (ii) ein einzelner hoher Titer (größer oder gleich 1:400 oder 1:800, höher bei Epidemie). Bereiche) (Seropositivität) (Antikörper können noch einige Zeit nach der Infektion bestehen bleiben oder mit anderen Krankheiten kreuzreagieren). Darüber hinaus erfordert MAT ein Live-Panel aller Leptospira-Serovare in der Region, mit einem Panel lokal standardisierter Serovare [93,94] gemäß der Weltorganisation für Tiergesundheit (19 Antigene repräsentativ für 15 Serogruppen) [95]. Da Antikörper 5–7 Tage nach der Infektion nachweisbar sind, kann der MAT-Test in den ersten Tagen der Infektion negativ ausfallen (Titer < 1:50). Die Diagnose von Leptospirose kann anhand von Urinproben [96] unter Verwendung sowohl serologischer als auch molekularer Detektion (16S-rRNA) erfolgen, insbesondere bei Patienten mit kürzlich erfolgter Infektion (MAT größer oder gleich 1:800 oder ELISA IgM-positiv oder beides) [97] .

Mit begrenzten Ressourcen ergibt sich ein klinischer Vorhersagewert [98], der auf der relevanten klinischen Vorgeschichte und zugehörigen Labortests mit einer Bewertung in sieben Aspekten basiert: Hypotonie (3), Gelbsucht (2), Muskelschmerzen (2), AKI (1,5). , niedriges Hämoglobin (3), Hypokaliämie mit Hyponatriämie (3) und Neutrophilie (1) werden vorgeschlagen (ein zusammengefasster Grenzwert von 4 hat die Fläche unter der Betriebskennlinie des Empfängers {{10}}.78 ( 95 %-KI 0,68–0,89) für die Leptospirose-Diagnose [77]). Dieser Thai-Lepto-On-Hospitality-Wahrscheinlichkeitsscore könnte ein diagnostisches Instrument für die frühe präsumtive Diagnose von Leptospirose bei Patienten sein, bei denen ein schwerer klinischer Verdacht auf die Krankheit besteht.