Untersuchung der Anti-Aging-Wirkung von Calcitriol auf menschliche natürliche Killerzellen in vitro

ABSTRAKT

Es wird allgemein angenommen, dass Vitamin D eine regulierende Wirkung auf das Immunsystem hat. Einige klinische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Nachfrage nachVitamin D nimmt mit zunehmendem Alter zu. Calcitriol ist die biologisch aktive Form vonVitamin-D. Seine Wirkung auf menschliche natürliche Killerzellen (NK) bleibt jedoch unklar. Daher untersuchten wir in dieser Studie die Anti-Aging- und immunmodulatorische Wirkung von Calcitriol auf NK-Zellen mithilfe einer Reihe immunologischer Methoden, um seine wichtige Rolle bei der angeborenen Immunität zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass Calcitriol die Expression alterungsbedingter Biomarker in NK-Zellen umkehrte und deren Expansion hemmte, indem es diese Zellen in der G1-Phase hielt, ohne Apoptose und Erschöpfung. Calcitriol unterdrückte die Freisetzung entzündungsbedingter Zytokine wie Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-13 (IL-13), Interferon-gamma (IFN- ), und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-). Die Degranulation von NK-Zellen wurde durch Calcitriol herunterreguliert, wenn diese Zellen zusammen mit K562-Tumorzellen kultiviert wurden. Wir fanden auch heraus, dass Calcitriol den altersbedingten Sirtuin-1--Protein/Kinase-R-ähnlichen endoplasmatischen Retikulumkinase (SIRT1/pERK)-Weg und die SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8)-Expression hochregulierte durch Aktivierung des Vitamin-D-Rezeptors (VDR). Darüber hinaus könnte Calcitriol ein potenzieller negativer Regulator von NK-Zellen seinApoptoseUndmitochondriale Inaktivierungwas verursacht wird durchoxidativen Stress. Somit weist Calcitriol aufAnti-Aging-Effekteauf menschliche NK-Zellen in vitro durch Aktivierung der SIRT1-PERK-Achse undWiderstand gegen oxidative Seneszenz.

Klicken Sie hier, um Cistanche Anti-Aging-Ergänzungsmittel zu erhalten

1. Einleitung

Viele Studien haben herausgefunden, dass das Altern einen direkten Einfluss auf mehrere Krankheiten hat, beispielsweise Infektionskrankheiten, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, neurodegenerative Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Krebs. Die Alterung des Organismus geht mit einer Immunoseneszenz einher. Zu den gemeinsamen Merkmalen des Alterns gehören vor allem Entzündungsalterung mit chronisch geringer Entzündung [1], Genominstabilität, Ungleichgewicht der Proteinexpression, mitochondriale Inaktivierung, zelluläre Seneszenz und Veränderungen in der interzellulären Kommunikation [2]. Als Hauptbestandteil der angeborenen Immunität spielen NK-Zellen eine wichtige Rolle bei der infektions- und tumorhemmenden Wirkung sowie der Regulierung des Immunsystems [3]. NK-Zellen können die Zielzellen direkt oder über antikörperabhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) eliminieren, anstatt antigen- oder antikörperspezifische Reaktionen zu zeigen [4]. NK-Zellen werden auch mit Überempfindlichkeitsreaktionen und Autoimmunerkrankungen in Verbindung gebracht [5]. Wenn das Immunsystem altert, nimmt die Expression von Oberflächenaktivierungsrezeptoren wie dem natürlichen Killer-Gruppe-2-Mitglied D (NKG2D) [6], dem Killer-Immunglobulin-ähnlichen Rezeptor (KIR) und dem Oberflächenmarker-Cluster der Differenzierung 57 (CD57) [7] zu. , ein Differenzierungscluster 16 (CD16) [8] erhöht. Dieses Molekül könnte die Tötungsfunktion von NK-Zellen aktivieren, was bei älteren Menschen zu zellulärem Ungleichgewicht und Entzündungen führen kann. Unterdessen nahmen die inhibitorischen Moleküle von NK-Zellen wie natürliches Killer-Gruppe-2-Mitglied A (NKG2A), natürliches Killer-Gruppe-2-Mitglied C (NKG2C) und natürliche Zytotoxizitätsrezeptoren (NCRs) [6] ab. Weitere alterungsbedingte Marker von NK-Zellen sind T-Zell-Immunglobulin und Mucindomänen-haltiges Protein 3 (TIM3) sowie ein erhöhter programmierter Zelltod-1 (PD-1). Die Hochregulierung von PD-1 und TIM3 während der Immunoseneszenz kann die Funktionen von NK-Zellen hemmen und zur Erschöpfung der NK-Zellen führen [9].

Ein weiterer Faktor, der zur Immunseneszenz führt, ist eine Immunentzündung [10]. Es wurde berichtet, dass hohe Mengen an entzündlichen Zytokinen, die von NK-Zellen freigesetzt werden, DNA-Schäden, oxidativen Stress und Zellalterung verursachen. Darüber hinaus kann das zelluläre Ungleichgewicht der NK-Zellen und der Entzündungsstatus zu einer Autoimmunerkrankung führen [11]. Die Spiegel von Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-6 (IL-6), Interleukin -10 (IL-10) und Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-) sind bei älteren Menschen höher [12]. Obwohl die Anzahl der gesamten Immunzellen mit zunehmendem Alter abnahm, nahm die NK-Zellpopulation deutlich zu, was möglicherweise auf die Infiltration von Entzündungszellen zurückzuführen ist [13].

Vitamin D kommt im menschlichen Körper in zwei aktiven Formen vor: Vitamin D2 (Ergocalciferol) und Vitamin D3 (Calcitriol). Die Hauptfunktion von Vitamin D besteht darin, die Aufnahme von Kalzium und Phosphor zu fördern. Vitamin D reguliert auch die Immunfunktionen [14]. Obwohl sich viele Berichte auf seine Anti-Infektions- und Anti-Tumor-Funktionen konzentrieren [15], zeigt Calcitriol auch entzündungshemmende Wirkungen [16]. Der Vitamin-D-Rezeptor (VDR) wird auf verschiedenen Immunzellen exprimiert [17]. Eine Verringerung der Produktion entzündlicher Zytokine trägt zur Verringerung entzündlicher Reaktionen bei. Calcitriol unterdrückt bekanntermaßen die Produktion von TNF-, Interleukin-1 (IL-1), Interleukin-2 (IL-2), Interferon-gamma (IFN-) und andere entzündliche Zytokine in B- und T-Zellen. Es kann auch entzündungshemmende Zytokine wie IL-4 und IL-10 freisetzen [18] und die Autophagie gegen die Infiltration entzündlicher Zellen regulieren [19].

Über die antioxidativen Eigenschaften von Calcitriol wurde bei Depressionen, Fettlebererkrankungen [20], Herz-Kreislauf-Erkrankungen und anderen entzündungsbedingten Erkrankungen berichtet. Auch freie Radikale und reaktive Sauerstoffspezies (ROS) reichern sich im Laufe des Alterns in Zellen und Gewebe an. Veröffentlichte Daten haben gezeigt, dass oxidativer Stress eine Vielzahl von Signalwegen in Zellen beeinflusst [21], darunter die Signalwege SIRT1, Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) und Kernfaktor-κB (NF-κB). Das SIRT1-Gen gilt als Langlebigkeitsgen und die Unterdrückung dieses Gens führt zu Störungen im Zusammenhang mit der Proteinexpression, dem Zellzyklus und dem Stoffwechsel [22]. SIRT1-ΔExon8 ist eine neuartige Isoform von SIRT1, die bei Säugetieren durch alternatives Spleißen existierte. SIRT1-ΔExon8 wurde auch als co-regulatorischer Faktor von SIRT1 voller Länge angesehen [23].

Bisher konzentrieren sich nur sehr wenige Studien auf die Auswirkungen des Alterns und der oxidativen Seneszenz auf NK-Zellen. Über die Auswirkungen von Calcitriol auf SIRT1-ΔExon8 wurde ebenfalls nicht berichtet. Daher zielte diese Studie darauf ab, die Auswirkungen von Calcitriol auf die Alterung und oxidative Seneszenz von NK-Zellen zu untersuchen, da diese Zellen eine zentrale Position im angeborenen Immunsystem des Menschen einnehmen.

2. Materialien und Methoden

2.1 Zellkultur und Reagenzien

Drei menschliche periphere Blutproben wurden von Spendern entnommen, die keine aktive Autoimmunerkrankung, keine akute oder chronische Entzündungserkrankung, keinen Krebs oder andere immunbedingte Erkrankungen hatten. Das Alter der Spender lag zwischen 48 und 65 Jahren. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) wurden mit Lymphoprep Ficoll isoliert. Die NK-Zellen wurden unter Verwendung eines NK-Zellkultur-Kits (MoreCell, Shenzhen, China) bei 37 Grad / 5 Prozent CO2 vermehrt und gehalten.

2.2 Durchflusszytometrische Analyse

Nach 72-stündiger Behandlung mit Calcitriol wurden die NK-Zellen mit Anti-Human-FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 und PE-KIR (BioLegend, Kalifornien, USA) gefärbt. USA). Alle FACS-Tests wurden mit dem DxFLEX-Durchflusszytometer (Beckman, Kalifornien, USA) durchgeführt.

2.3 Messung der Zellexpansion, Zytokinfreisetzung und Zellzyklustest

Die Zellexpansion wurde mit einem Cell Counting Kit-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, China) bestimmt. NK-Zellen wurden 48 Stunden lang mit Calcitriol behandelt und der Überstand wurde für den Zytokin-Freisetzungstest gesammelt. Die Zytokinspiegel wurden mit dem LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kalifornien, USA) untersucht. Zuerst wurden die Zytokin-Einfangkügelchen mit den Standards oder Proben inkubiert und dann weiter mit biotinylierten Nachweisantikörpern inkubiert. Anschließend wurde die biotinylierte Detektionsantikörper-Bindungslösung Streptavidin (SA)-PE hinzugefügt, um das Fluoreszenzsignal bereitzustellen [25]. Diese Signale wurden dann mit dem FACS-Assay analysiert.

Der Zellzyklus wurde mit einem Cell Cycle Detection Kit (Beyotime, Shanghai, China) gemessen. NK-Zellen wurden 72 Stunden lang mit Calcitriol behandelt. Diese Zellen wurden in 70 Prozent eiskaltem Ethanol fixiert und dann mit Ribonuklease A (RNase A) und Propidiumiodid (PI) (Beyotime, Shanghai, China) gefärbt [26].

2.4 NK-Zelltötungstest

Die menschlichen erythroleukämischen Zellen, K562-Zellen (ATCC, Virginia, USA), wurden 15 Minuten lang mit 10 μM 3,3 -Dioctadecyloxacarbocyanin (DIOBeyotime, Shanghai, China) inkubiert und dann zu den mit Calcitriol behandelten NK-Zellen gegeben bei verschiedenen Verhältnissen (E/T'=1:1, 5:1 und 10:1) für jeweils 4 Stunden (27).

2.5 Oxidative Seneszenzinduktion und X-Gal-Färbungsanalyse

Das In-vitro-Modell der NK-Zellalterung unter Verwendung von Wasserstoffperoxid (H2O2). Um die antioxidative Wirkung von Calcitriol zu bestimmen, wurden NK-Zellen zunächst mit Calcitriol behandelt und dann 24 Stunden lang 100 μM H2O2 ausgesetzt. Die Aktivität von -Galactosidase wurde mittels 5-Brom-4-chlor-3-indolyl- -D-galactopyranosid (X-gal)-Färbung gemessen. Die behandelten Zellen wurden in 4 Prozent Paraformaldehyd fixiert und über Nacht bei 37 Grad mit -Galactosidase-Färbelösung (Beyotime, Shanghai, China) gefärbt [28]. Die gefärbten Zellen wurden dann in PBS suspendiert und Bilder dieser Zellen wurden mit einem Leica-Fluoreszenzinversionsmikroskopsystem aufgenommen. Für jede Gruppe wurden drei mikroskopische Bilder zufällig aus verschiedenen Positionen bei 40-facher Vergrößerung aufgenommen. Der Prozentsatz der mit X-Gal gefärbten Zellen wurde berechnet und zur Beurteilung der Zellalterung mithilfe der ImageJ-Software V.1.45S verwendet.

2.6 Färbung und Analyse des mitochondrialen Membranpotentials

Chlormethyl-X-Rosamine (CMXRos) und Hoechst (Beyotime, Shanghai, China) wurden zur Bewertung des mitochondrialen Membranpotentials verwendet. Die Zellkerne (blau) wurden durch Hoechst-Färbung lokalisiert, während das mitochondriale Membranpotential durch den mitochondrialen Spezifitätskennzeichnungsfluoreszenzfarbstoff CMXRos bestimmt wurde. Die Hoechst plus CMXRos-Zellen (gekennzeichnet durch weiße Pfeile) zeigten eine geringe Aktivität. Das relative Fluoreszenzniveau wurde berechnet, indem die Anzahl der Hoechst-positiven Zellen durch die CMXRos-positiven Zellen dividiert wurde [29]. Die Zellen wurden mit 200 nM CMXRos und Hoechst (30 Minuten, 37 Grad) inkubiert und unter Verwendung eines Leica-Umkehrmikroskops bei Anregungswellenlängen von 579 nm und 350 nm nachgewiesen. Der Prozentsatz an Hoechst-plus-CMXRos-plus-Zellen wurde wie in Abschnitt 2.5 beschrieben berechnet.

2.7 Western Blot

Die Zellen wurden unter Verwendung des Radioimmunpräzipitationsassays (RIPA)-Lysepuffers (Beyotime, Shanghai, China) mit dem Phosphataseinhibitor PhosSTOP (Roche, Basel, Schweiz) und 1 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Beyotime, Shanghai, China) lysiert. Das Gesamtprotein wurde mit dem Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Japan) quantifiziert. Die Proteinproben wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) aufgetrennt und auf 0,22 μm Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membranen (Immobilon-P-Membran; Millipore, Massachusetts, USA) übertragen. Nach der Blockierung wurden die Membranen mit primären Antikörpern sondiert und mit den sekundären Antikörpern inkubiert [30]. Membranen wurden mit dem Odyssey-System (LI-COR, Nebraska, USA) nachgewiesen.

2.8 Statistische Analyse

Die Daten wurden mittels einseitiger Varianzanalyse (ANOVA) mit GraphPad Prism analysiert und als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. 6846 W. LI ET AL. Unterschiede wurden bei P < 0.05 als statistisch signifikant angesehen. Die Ergebnisse wurden auch mit der GraphPad-Software analysiert.

Frage nach mehr:

E-Mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950