Studie zur neuroendokrinen Immunfunktion von Cistanche Deserticola und seinen Reiswein-Dampfprodukten im Glukokortikoid-induzierten Rattenmodell-Ⅱ

3.2.4. Immunhistochemie

Die neuronale Apoptose wird durch viele apoptotische und antiapoptotische Gene kontrolliert, hauptsächlich durch das Apoptose-fördernde Gen Bax und die antiapoptotischen Gene der Bcl-2-Genfamilie. Bcl-2 ist in reaktiven Sauerstoff produzierenden Organellen wie den Mitochondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und Kernmembranen lokalisiert. Bcl-2 hat kaum Einfluss auf freie Sauerstoffradikale, kann es aberverhindern oxidative Schäden in Zellen. Bax transportiert vom Zytoplasma zur Mitochondrienmembran, verändert die Struktur der Mitochondrienmembran und fördert die Freisetzung von Cytochrom c und die Induktion der Apoptose.

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Im Nebennierenzytoplasma kam es zu einer Expression des Bax- und Bcl{0}}-Proteins. Die Färbung zeigte ausschließlich gelbe Partikel. Im Vergleich zu der der BC-Gruppe stieg die durchschnittliche optische Dichte des Bax-Proteins in der MC-Gruppe deutlich an (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the average optical density in the CD-LD and WCD-LD groups decreased significantly (P < 0.01) (Figure 5(a)).

Abbildung 5(b) zeigt, dass im Vergleich zu der der BC-Gruppe die durchschnittliche optische Dichte des Bcl-2-Proteins in der MC-Gruppe deutlich abnahm (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and CD-HD groups increased significantly (P < 0.01), while those of the WCD-MD and CD-MD groups increased (P < 0.05).

Das Caspase-3-Protein ist in seiner ursprünglichen Form in normalen Geweben hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert und weist eine geringe Expression auf. Positive Signale sind blassgelb oder bräunlichgelb. Im Vergleich zur BC-Gruppe erhöhte sich die Expression von Caspase-3 in der MC-Gruppe signifikant (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the expression of caspase-3 in the WCD-HD and WCD-MD groups increased (P < 0.05) (Figure 5(c)).

In normalen Geweben war die Expression des Fas-Gens verringert und das positive Signal für die In-situ-Hybridisierung war bräunlich-gelb. Wie in Abbildung 5(d) gezeigt, erhöhte sich im Vergleich zu der der BC-Gruppe die durchschnittliche optische Dichte des Fas-Proteins in der MC-Gruppe (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density in the WCD-HD and WCD-LD groups improved (P < 0.05) (Figure 5(d)).

Das FasL-Protein befindet sich hauptsächlich in der Zellmembran oder im Zytoplasma und seine positiven Signale sind braun. Im Vergleich zu der BC-Gruppe erhöhte sich die durchschnittliche optische Dichte des FasL-Gens in der MC-Gruppe signifikant (P< 0.05). Compared to that of the MC group, the average optical density of the FasL gene in the WCD-HD, WCD-MD, CDHD, and CD-MD groups increased significantly (P < 0.01) (Figure 5(e)).

Die Ergebnisse zeigten, dass CD und WCD dies könnteninduzieren Apoptose in Entzündungszellenund reduzieren Nebennierenschäden, indem sie die Expression des FasL-Proteins und die Bindung an das Fas-Protein fördern, das Caspase-3-Protein aktivieren und eine Caspase-Kaskade auslösen. Der Effekt der WCD-HD-Gruppe war am besten.

3.3. Bestimmung der Immunfunktion

3.3.1. Immunorgan-Index

Im Vergleich zu denen der BC-Gruppe sanken der Thymuskoeffizient und der Milzindex der MC-Gruppe signifikant (P< 0.01). Compared to the MC group, the WCD-MD group had the greatest difference (P < 0.05). The thymus coefficient was almost back to the normal level. For the spleen index, the WCDMD, WCD-LD, and CD-MD groups showed significant differences compared with that of the MC group (P < 0.01) (see Figure 6). Therefore, WCD and CD treatment could protect the immune organs, and the effects of WCD were better. 

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3.3.2. Nachweis von T-Lymphozyten-Untergruppen im peripheren Blut

Der Prozentsatz der CD4+-Zellen im oberen linken Quadranten und der CD8+-Zellen im rechten unteren Quadranten war in der BC- und jeder Medikamentengruppe höher als in der MC-Gruppe. Im Vergleich zu der BC-Gruppe nahm das Verhältnis von CD4+ThCD8+ in der MC-Gruppe signifikant ab (P< 0.01). Compared to that of the MC group, the ratio of CD4+ThCD8+ increased significantly in the PC group, the WCD group, and the CD-HD group (P < 0.01) (Figure 7).

3.3.3. Bestimmung des Spiegels von IL-10, IL-6, IL-2, TNF-Α und IFN-C im Serum

Abbildung 8 zeigt, dass im Vergleich zu der BC-Gruppe der Spiegel von IL-6, TNF- und IFN-c signifikant anstieg (P< 0.01). The level of IL-10 and IL-2 decreased in the MC group. Compared to that of the MC group, the level of IL-6, TNF-α, and IFN-c decreased and IL-10 and IL-2 increased in serum in each of the drug groups. The effect of WCD was better than the effect of CD, especially in the WCD-MD group, in which the effect was close to that of the PC group.

3.3.4. Ergebnisse des Lymus-Gewebemikroskop-Beobachtungsexperiments

Abbildung 9 zeigt, dass in der BC-Gruppe eine große Anzahl von Lymphozyten vorhanden war. Lymphozyten und Retikulozyten waren in der Mitte locker angeordnet, mit verstreuten runden oder ovalen Thymozyten. Es gab keine Nekrose, keine entzündliche Zellinfiltration und keine abnormalen Veränderungen.

Die MC-Gruppe zeigte eine große Menge an lymphoidem Nekrosegewebe mit einer ungeordneten Anordnung von Lymphozyten und Retikulozyten in der Mitte. Runde oder ovale Thymozyten verschwanden, eine massive Zelldegeneration oder Nekrose war erkennbar und es kam zu einer entzündlichen Zellinfiltration mit abnormalen pathologischen Veränderungen.

In den CD-Gruppen hatten sich die morphologischen Eigenschaften der Lymphozyten wieder normalisiert und die Anordnung der zentralen Lymphozyten und Retikulozyten war nahezu normal. Runde oder ovale Thymozyten hatten sich erholt, es blieb jedoch eine kleine Anzahl degenerativer oder nekrotischer Lymphozyten und infiltrierender Entzündungszellen zurück.

In den WCD-Gruppen und der PC-Gruppe wurden die morphologischen Eigenschaften der Lymphozyten besser repariert. Die Lymphozyten und Retikulozyten in der Mitte waren gut ausgerichtet, die runden oder ovalen Thymozyten waren fast normal, es blieb jedoch eine kleine Anzahl infiltrierender und degenerativer Lymphozyten zurück.

3.4. CaM-Protein-Genexpression

Der RQ-Wert (CaM-mRNA-Actin-mRNA) wurde berücksichtigt, um die Expression von CaM-mRNA zu untersuchen. Der RQ der BC-Gruppe betrug 1. Die Expression von CaM-mRNA im Hypothalamus in der MC-Gruppe stieg signifikant an (P< 0.01), while the value decreased in the WCD-HD, WCD-MD, WCDLD, and CD-HD groups (P < 0.05) (Figure 10). The expression of CaM mRNA in the hypophysis in the MC group was lower than that in the BC group (P < 0.01). The expression in the WCD-HD, WCD-MD, WCD-LD, CD-HD, and CD-LD groups increased (P < 0.05), and the effect in the WCD groups was better than the effect in the CD groups.

4. Diskussion

Das Chinesische Arzneibuch [2] berichtet, dass CD und WCD in der Klinik als Haupttypen von Dekoktstücken verwendet werden können. Nachdem es mit Reiswein gedämpft wurde, wird dasAnti-Aging- und tonisierende Nieren-Yang-Wirkungwurden verbessert. Durch UPLC-QqQ-MS haben wir die quantitativen Veränderungen in der chemischen Materialbasis während des Prozesses des Reisweindämpfens nachgewiesen. Iridoidglykoside waren instabil und der Gehalt dieser Glykoside nahm ab und wurde sogar nicht mehr nachweisbar. Auch der Gehalt an Phenylethanolglykosiden veränderte sich, was zu Veränderungen der Pharmakodynamik und der klinischen Wirkung führen könnte.

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Das klassische Nieren-Yang-Mangelmodell wurde durch subkutane Injektion von Corticosteron repliziert [19]. Eine Überdosierung von Corticosteron könnte die CRH-Sekretion im Hypothalamus hemmen. Mittlerweile wurde auch die Sekretion von ACTH gehemmt. Der Spiegel des Nebennierenrindenhormons sank und somit wurde die Funktion der HPA-Achse reduziert. Eine Unterfunktion der HPA-Achse ist ein häufiges Merkmal eines Nieren-Yang-Mangels [20]. Dann zeigen die Ratten „Depletion“-Phänomene und die Symptome stimmen mit denen des Nieren-Yang-Mangels in der Klinik überein.

In der MC-Gruppe sanken die Spiegel von CRH, ACTH, T und CORT im Rattenserum signifikant (P< 0.01). After being treated by CD and WCD, the content of CRH, ACTH, T, CORT, and cortisol all increased to some degree, and the effect of WCD-MD was the best, almost equal to that in the PC group. These results indicated that the relative hormone balance in the HPA axis had been destroyed in the MC group, CD and WCD could improve the functional recovery of abnormal adrenal axis hormone levels, but the effect of WCD was better.

Die Modulation des Anteils der Mitglieder der Bcl-2-Familie ist einer der Kernmechanismen, durch die FasThFasL den Todesrezeptorweg vermittelt und die Bcl-2-Familie den mitochondrialen Weg reguliert [21]. Der Apoptose-hemmende Faktor Bcl-2 und Apoptose-induzierende Faktoren wie Bax gehören alle zur Bcl-2-Familie [22]. Die Zellapoptose kann durch das relative Verhältnis von Apoptose-hemmenden Faktoren und Apoptose-induzierenden Faktoren bestimmt werden [23]. Mitochondrien haben die Funktion zentraler Kontrollpunkte für viele Formen der Apoptose [24]. Die vorliegende Studie zeigte, dass CD-MD und WCDs die Expression von Bax ableiten und Bcl-2 auf erhöhen konntenVerbesserung des Nieren-Yang-Mangels. Fas ist der wichtigste Todesrezeptor, der durch Ligation mit dem Fas-Liganden (FasL) Apoptose induziert [25]. Die Expression von Fas und FasL in der MC-Gruppe nahm zu, während diese Expression in der WCD-MD-Gruppe signifikant zunahm (P< 0.01) compared with the MC group. Both FasThFasL and BaxThBcl-2 systems transduce apoptotic signals to the caspase family [26]. Caspase-3 is one of the pivotal proteinases that initiate cell apoptosis. The activation of caspase-3 indicates that apoptosis enters an irreversible stage [27]. The expression of caspase-3 in the MC group increased and increased significantly in the WCD-HD and WCD-MD groups (P < 0.05).

Ein Mangel an Immunfunktion ist eine der wichtigsten Manifestationen eines Nieren-Yang-Mangels [28]. In dieser Studie stellten wir fest, dass sich der Index der Milz und des Thymus der WCD-MD-Gruppe signifikant erholte (P< 0.01, P < 0.05). The immune response of the immune system is regulated mainly by the Th subgroups [29]. IL-2 is the growth factor for T cells, secreted by T cells and macrophages, participates in inflammatory regulation, regulates immunity, and increases infection resistance [30]. The level of IL-2 in the MC group decreased (P < 0.01), and after treatment with CD and WCD, the level of IL-2 recovered. IL-6 and TNF-α are proinflammatory cytokines. Increased levels of IL-6 and TNF-α cytokines cause cytokine imbalances and exacerbate inflammation. The levels of IL-6 and TNF-α increased in the MC group, while after treatment, the levels of IL-6 and TNF-α decreased. T cells are divided into CD4 cells and CD8 cells, and the CD4+ThCD8+ ratio can be used as an important index of immune regulation [31]. CD4+ThCD8+ in the MC group decreased (P < 0.01), while in the WCD and CDHD groups increased (P < 0.01).

Die HPA-Achse ist das wichtigste Regulierungssystem, da sie die Glukokortikoidsekretion und das endokrine System reguliert, um die sekretorische Funktion der Nebennierenrinde aufrechtzuerhalten [32]. Die Überexpression von CaM-mRNA im Hypothalamusgewebe hing mit einem Mangel an Nieren-Yang zusammen. CD und WCD könnten die Kalziumkanäle blockieren, die CaM-mRNA-Expression im Hypothalamus hemmen und den Kalziumeinstrom verringern, wodurch die Aktivität des Ca2+·CaM-Komplexes verringert wird.

Die Entstehung eines Nieren-Yang-Mangels ist ein chronischer Krankheitsentstehungsprozess. Niere ist kein rein anatomischer Begriff mehr, sondern ein allgemeiner Begriff für neuroendokrine Immunität und Urogenitalsysteme. Das neuroendokrine Immunnetzwerk (NEI) ist ein wichtiges integriertes Regulierungssystem [33]. CD und WCD können die Funktion der HPAT-Achse regulieren und die Wiederherstellung eines Nieren-Yang-Mangels verbessern. Dieses Ergebnis liefert die experimentelle Grundlage für die klinische Prävention und Behandlung von Nieren-Yang-Mangel.

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