Studie zur Schutzfunktion von Cistanche auf die Niere: Androgenabhängige Unterschiede in der Menge an CYP-mRNAs in der Schweineniere

Androgenabhängige Unterschiede in der Menge an CYP-mRNAs in der Schweineniere

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Wir berichteten zuvor über androgenabhängige Geschlechts- und Rassenunterschiede in der Menge an mRNAs von CYP-Isoformen in der Schweineleber. Um zu klären, ob es solche Geschlechts- und Rassenunterschiede bei den gibtNiereuntersuchten wir die Mengen mehrerer CYP-mRNAs in der Niere unter Verwendung beiderlei Geschlechts von 5- Monate alten Landrasse-, Meishan- und/oder ihren gekreuzten F1-Schweinen (LM und ML). Es wurden signifikante Geschlechtsunterschiede in den Mengen mehrerer CYP-mRNAs gefunden: männlich < weiblich="" für="" cyp2a19="" und="" cyp3a29;="" und="" männlich=""> weiblich für CYP4A24/25 bei allen Rassen. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Menge an CYP2B22-mRNA (männlich < weiblich)="" und="" in="" cyp2c33-="" und="" cyp2c49-mrna="" (männlich=""> weiblich) wurden ebenfalls bei allen Rassen außer Landrasse-Schweinen beobachtet. Darüber hinaus wurde ein signifikanter Geschlechtsunterschied (männlich < weiblich)="" in="" der="" cyp3a46-mrna="" nur="" bei="" lm-="" und="" ml-schweinen="" gefunden.="" weder="" bei="" landrasse-="" noch="" bei="" meishan-schweinen="" wurden="" signifikante="" geschlechtsunterschiede="" für="" cyp1a1-,="" cyp1a2-="" und="" cyp4b1-mrnas="" gefunden.="" die="" mengen="" an="" cyp2c33-="" und="" cyp4a24/25-mrnas="" bei="" männchen="" waren="" bei="" meishan-schweinen="" höher="" als="" bei="" landrasse-schweinen.="" weitere="" versuche="" mit="" schweinen,="" die="" durch="" kastration="" und/oder="" behandelt="">TestosteronPropionat zeigte, dass Geschlechts- und Rassenunterschiede in den Mengen dieser CYP-mRNAs zumindest teilweise von den Serumspiegeln abhängig warenTestosteron. Darüber hinaus korrelierten die Wirkungen von Androgen auf die Mengen an CYP-mRNAs in der Niere nicht unbedingt mit denen in der Leber, was darauf hindeutet, dass es einen gewebeselektiven Faktor gibt, der für die androgenbezogene Expression von CYP-Genen verantwortlich ist. Der Schutz vonCistancheauf derNierenist vielseitig, was auf die darin enthaltenen Elemente wie Echinacosid, Verbascosid, Flavonoide und Gesamt-Phenethylalkohol-Glykoside zurückzuführen istCistanche. Cistanchekann nicht nur die schützenNierenvor weiteren Schäden sondern auch den bestehenden Schaden reparierenNieren. Deswegen,Cistancheist das am häufigsten verwendete Kraut in Rezepten der traditionellen chinesischen Medizin.Cistanchehat einen sehr hohen medizinischen Wert.

Schlüsselwörter:Testosteron; CYP;Niere; Geschlechtsunterschied; Rassenunterschied; Schwein;NiereZelle;Cistanche

Misaki Kojima und Masakuni Degawab

Animal Genome Unit, Institut für Nutztier- und Grünlandwissenschaften, Nationale Organisation für Landwirtschaft und Lebensmittelforschung (NARO); 2 Ikenodai, Tsukuba, Ibaraki 305–0901, Japan: und bLaboratory of Molecular Toxicology, School of Pharmaceutical Sciences, University of Shizuoka; 52–1 Yada, Suruga-Ku, Shizuoka 422–8526, Japan. Eingegangen am 16. April 2021; akzeptiert am 19. Mai 2021

EINLEITUNG

Arzneimittel metabolisierende Enzyme (DMEs) wie CYPs, Sulfotransferasen (SULTs) und Uridin-5′-diphosphat (UDP)-Glucuronosyltransferasen (UGTs) spielen eine wichtige Rolle beim Metabolismus von Xenobiotika, einschließlich Arzneimitteln und endogenen Verbindungen wie Steroidhormonen und Lipide.1,2) Hausschweine (Sus scrofa domesticus), einschließlich Minischweine, sind wichtig in pharmakologischen und toxikologischen Studien wegen der Ähnlichkeit der DME-Funktion zwischen Menschen und Schweinen, insbesondere CYPs.3–7) Wir haben bereits über Sex berichtet und Rasseunterschiede in den Mengen an hepatischen DME-mRNAs, einschließlich CYP-Isoformen, zwischen Landrassen- und Meishan-Schweinen, und wir haben ferner gezeigt, dass der Androgenspiegel im Serum einer der kritischen Faktoren ist, die diese Unterschiede hervorrufen.8)

CistancheTubulusverhindertNierenerkrankung,Klicken Sie hier, um das Muster zu erhalten

DasNieresowie die Leber ist das wichtige Gewebe, das für den Metabolismus und die Ausscheidung von Xenobiotika einschließlich Arzneimitteln und endogenen Verbindungen verantwortlich ist, und ist eines der häufigsten Ziele für arzneimittelinduzierte Toxizität.9,10) Es wurde berichtet, dass CYP-Isoformen, die zu den gehören Beim Schwein existieren CYP1-, CYP2-, CYP3- und CYP4-FamilienNiere.11–15) Die meisten dieser CYP-Isoformen spielen eine wichtige Rolle im Metabolismus von Xenobiotika und/oder Lipiden in Versuchstieren und Menschen.9,10,16,17) Außerdem die Expression von Cyp4a- und Cyp4b-Isoformen in der MausNierewird durch Androgen reguliert.18–21)

In der vorliegenden Studie untersuchten wir zunächst Geschlechts- und Rasseunterschiede in der Menge an CYP-mRNAs (CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46, CYP4A24/25 und CYP4B1).Nierevon Meishan, Landrace und ihren gekreuzten F1-Schweinen. Darüber hinaus untersuchten wir, ob Androgen ein kritischer Faktor ist, der die Geschlechts- und Rassenunterschiede in der Menge dieser CYP-mRNAs beim Schwein bestimmtNiere, durch Experimente mit Kastration und/oder die Verabreichung vonTestosteronPropionat (TP).

MATERIALEN UND METHODEN

Tiere

Landrace, Meishan und ihre gekreuzten F1-Schweine (LM, weibliche Landrasse × männliche Meishan; ML, weibliche Meishan × männliche Landrasse) wurden verwendet, die gleichen wie die, die in unseren vorherigen Studien verwendet wurden.22) Kurz gesagt, die Schweine wurden im National Institute gehalten of Livestock and Grassland Science, Tsukuba, Japan. Alle Schweine wurden mit einer handelsüblichen Getreidediät gefüttert und mit Wasser nach Belieben versorgt. Schweine wurden zwischen 10:00 und 11:00 durch Elektrobetäubung getötet, gefolgt von Entbluten. Einige männliche Landrassen- und Meishan-Schweine wurden im Alter von 1 Monat kastriert und im Alter von 5 Monaten eingeschläfert. Ein Teil der Niere oder der Leber von jedem Schwein wurde schnell entfernt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zu nachfolgenden Analysen bei –80 Grad gehalten.

Diese Studie wurde vom Animal Care Committee des National Institute of Livestock and Grassland Science (Nr. 1711B060, 1811B032, 1911B068, 20B005NILGS) genehmigt. Alle Tiere wurden gemäß den Richtlinien des Komitees human behandelt.

Androgenbehandlung

Wie in früheren Berichten beschrieben,23,24)TestosteronPropionat (TP, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), gelöst in Maisöl, wurde intramuskulär fünfmal in Intervallen von 48- h in das Hinterbein jedes Schweins in einer Dosis von 10 mg/kg injiziert Körpergewicht; die Schweine wurden 24 h nach der letzten Injektion eingeschläfert.

SerummengeTestosteron

Die SerummengeTestosteronbei einzelnen männlichen Schweinen wurde mit dem gemessenTestosteronEnzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit (Enzo Life Sciences Inc., NY, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers, wie zuvor beschrieben.24) Zusätzlich wurden auch die in unseren früheren Studien erhaltenen Daten verwendet.24,25)

Mengen an CYP-mRNAs

Gesamt-RNA wurde aus den einzelnen Geweben unter Verwendung von TRIzol-Reagenz (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) präpariert und verwendet, um die Mengen an CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, CYP2E1, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29, CYP3A46 zu bestimmen. CYP4A24/25- und CYP4B1-mRNAs. Die Mengen dieser mRNAs wurden mithilfe von Echtzeit-RT-PCR unter Verwendung eines 7500 Real-Time PCR-Systems und SYBR Green Mastermix (PE Applied Systems, Tokio, Japan) wie zuvor beschrieben25) mit Ausnahme von CYP3A-mRNA bestimmt. Die Mengen an CYP3A22-, CYP3A29- und CYP3A46-mRNAs wurden unter Verwendung von Eagle Taq Master Mix mit ROX (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, USA) wie zuvor berichtet untersucht.22) Die Primersets und TaqMan-Sonden, die in der vorliegenden verwendet werden Studie waren die gleichen wie in unseren vorherigen Studien22,25), mit Ausnahme von CYP1A1, CYP1A2, CYP4A24/25 und CYP4B1, wo die Primersequenzen wie folgt waren: CYP1A1, 5′-ACT TCA TCC CTA TCC TCC GTT ACC{{53} }′ (vorwärts) und 5′-GCA TTC TCG TCC ATC CTC TTG TC-3′ (rückwärts); CYP1A2, 5′-GCT ATC GGG ACT TTG ACA AGA ACT-3′ (vorwärts) und 5′-CCA GGA GAT GGC TGT GGT AAT TG-3′ (rückwärts); CYP4A24/25, 5′-CAC CGT GCC GCC AGG ATA-3′ (vorwärts) und 5′-CAA GGA GGA GGA TGT CCA GGA A-3′ (rückwärts); CYP4B1; 5′-GAG CAC CAG CAT CGT TGT CG-3′ (vorwärts) und 5′-TCC CCA GAT CCT CCC CCT G-3′ (rückwärts). Als interner Standard wurde das ribosomale Protein L7 (RPL7) verwendet. Die Menge jeder cDNA wurde durch das relative Standardkurvenverfahren gemäß PE Applied Biosystems User Bulletin #2 (1997) bestimmt. Standardkurven zur Bestimmung der Mengen der CYP-mRNAs wurden unter Verwendung einer RT-Reaktionsmischung mit Gesamt-RNA aus der Leber von 5- Monate alten weiblichen Landrasse-Schweinen oder aus der Niere von 5- Monate alten erzeugt weibliche Landrassen- oder Meishan-Schweine, je nach Verwendungszweck

Statistische Analysen

Statistisch signifikante Unterschiede wurden durch Tukey's Post-Hoc-Test nach ANOVA oder Student's t-Test bestimmt. Korrelationen zwischen den angegebenen Parametern wurden durch Regressionsanalyse bestimmt.

ERGEBNISSE

Mengen an CYP-mRNAs in der Niere von Landrasse- und Meishan-Schweinen

Die Mengen an CYP-mRNAs wurden zuerst in den Nieren beiderlei Geschlechts von 5- Monate alten Landrasse- und Meishan-Schweinen gemessen. Um die Menge jeder CYP-mRNA zwischen der Niere und der Leber zu vergleichen, wurde die Menge jeder CYP-mRNA in der Niere als relatives Verhältnis zur entsprechenden Menge in der Leber von 5- Monate alten weiblichen Landrasse-Schweinen ausgedrückt. und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.

Bei allen untersuchten Schweinen waren die Mengen an CYP4A24/25- und CYP4B1-mRNAs in der Niere viel höher als in der Leber, während die der anderen CYPs umgekehrt waren (Tabelle 1). Obwohl CYP2E1- und CYP3A22-mRNAs in der Niere nachgewiesen wurden, lagen diese Mengen bei jeder Rasse unter einem Tausendstel derjenigen in der Leber (Daten nicht gezeigt).

Bei beiden Schweinerassen waren die Mengen an CYP2A19- und CYP3A29-mRNAs bei Männchen geringer als bei Weibchen (Tabelle 1, Abb. 1). Umgekehrt war die Menge an CYP4A24/25-mRNA bei beiden Schweinerassen signifikant höher bei Männchen als bei Weibchen. Darüber hinaus waren bei Meishan-Schweinen die Mengen an CYP2C33- und CYP2C49-mRNAs bei Männchen signifikant höher als bei Weibchen. Bei Landrasse-Schweinen wurden keine derartigen geschlechtsspezifischen Unterschiede in den Mengen an CYP2C33- und CYP2C49-mRNAs beobachtet. Bei beiden Schweinerassen wurden keine signifikanten Geschlechtsunterschiede in der Menge an CYP1A1-, CYP1A2-, CYP2B22- und CYP4B1-mRNAs beobachtet, obwohl ein Geschlechtsunterschied in der Menge an CYP2B22-mRNA bei Meishan-Schweinen laut Student's t-Test signifikant war. Darüber hinaus wurde CYP3A46-mRNA bei beiden Geschlechtern von Landrasse-Schweinen nachgewiesen, während sie bei Meishan-Schweinen beider Geschlechter unter der Nachweisgrenze lag.

Breed  differences  in  the  amounts  of  several  CYP mRNAs were also found. The amounts of CYP2B22 and CYP4B1 mRNAs in Landrace pigs were signifificantly higher than those  in sex-matched Meishan pigs, while those of CYP2C49 and CYP3A29  mRNAs  were the  opposite.  A  significant  breed  difference (Meishan > Landrace) in the amounts of CYP2C33 and CYP4A24/25  mRNA  was  also  observed in  males,  but  no  such  difference  was  found in  females.  Furthermore, the  breed  differences  (Landrace >Meishan) in den Mengen an CYP1A1-, CYP1A2- und CYP2A19-mRNAs zwischen geschlechtsangepassten Landrasse- und Meishan-Schweinen wurden ebenfalls beobachtet.

Wirkung von Androgen auf die Genexpression von repräsentativen geschlechtsbezogenen CYPs Um die Androgenabhängigkeit der Genexpression von CYPs (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49 und CYP3A29) in der Niere zu klären, wurden die Wirkungen einer Kastration und/oder TP-Behandlung untersucht untersucht mit 5- Monate alten Meishan- und Landrasse-Schweinen (Abb. 1). Bei kastrierten Rüden beider Rassen war die Menge an CYP2A19-mRNA höher als bei den entsprechenden intakten Rüden. Darüber hinaus führte die TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen beider Schweinerassen zu einer Abnahme der mRNA-Menge. Die Mengen an CYP2B22- und CYP3A29-mRNAs stiegen bei kastrierten Meishan-Schweinen, aber nicht bei kastrierten Landrasse-Schweinen, verglichen mit den entsprechenden intakten männlichen Tieren. Die TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen beider Schweinerassen führte zu einer Verringerung der Mengen dieser mRNAs, obwohl keine signifikanten Wirkungen von TP auf CYP2B22-mRNA bei kastrierten Meishan- und CYP3A29-mRNA bei kastrierten Landrasse-Schweinen beobachtet wurden, da große inter- individueller Unterschied.

Tabelle 1. Relative Mengen an mRNAs von renalen CYP-Isoformen in 5- Monate alten Landrassen- und Meishan-Schweinen

Abb. 1. Auswirkungen der Kastration und/oder TP-Verabreichung auf die Mengen an CYP-mRNAs in 5- Monate alten Schweinenieren

TP wurde intramuskulär in {{0}} Monate alte kastrierte männliche und intakte weibliche Landrassen- und Meishan-Schweine injiziert, wie in den Materialien und Methoden beschrieben. Die Menge jeder CYP-mRNA in der Niere wurde durch Echtzeit-RT-PCR bestimmt und auf die von RPL7 als internem Standard normalisiert. Standardkurven wurden unter Verwendung einer RT-Reaktionsmischung mit Gesamt-RNA aus den Nieren von 5- Monate alten weiblichen Landrassenschweinen erstellt, mit Ausnahme der Bestimmung der Menge an CYP2C49-mRNA, wo Standardkurven unter Verwendung einer RT-Reaktionsmischung erstellt wurden mit Gesamt-RNA aus den Nieren 5- Monate alter weiblicher Meishan-Schweine. Jede Spalte stellt den Mittelwert jeder experimentellen Gruppe dar, und jeder Balken stellt die Standardabweichung (SD) des Mittelwerts dar (n= 6 für intakte männliche und weibliche Landrassen- und Meishan-Schweine; n= 3 für andere). a,b Signifikante Unterschiede zu den entsprechenden intakten männlichen Schweinen wurden durch den Tukey-Post-hoc-Test bestimmt: ap < 0.{{20}}5,="" bp="">< 0,01.="" c,="" d="" signifikante="" unterschiede="" zu="" den="" entsprechenden="" tp-unbehandelten="" schweinen,="" wie="" durch="" student's="" t-test="" bestimmt:="" cp="">< 0,05,="" dp="">< 0,01.="" quadrate="" in="" cyp2b22="" und="" cyp3a29="" zeigen="" meishan-="" bzw.="" landrasse-schweine="" mit="" vergrößerung="">

Die Menge an CYP2C33-mRNA nahm bei kastrierten Meishan-Schweinen ab, aber nicht bei kastrierten Landrasse-Schweinen, verglichen mit den entsprechenden intakten Männchen, und die TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen beider Schweinerassen führte zu einer Erhöhung der mRNA-Menge. Bei Meishan-Schweinen wurde die Menge an CYP2C49-mRNA auch durch Kastration verringert, und die TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen führte zu einer Erhöhung ihrer Menge. Bei Landrasse-Schweinen wurden keine derartigen Wirkungen der Kastration oder TP-Behandlung beobachtet.

Abb. 2. Auswirkungen der Kastration und/oder TP-Verabreichung auf die Mengen an CYP4A24/25- und CYP4B1-mRNAs in der Niere und Leber von 5- Monate alten Schweinen

TP wurde intramuskulär in {{{{10}}}} Monate alte kastrierte männliche und intakte weibliche Landrassen- und Meishan-Schweine injiziert, wie in den Materialien und Methoden beschrieben. Die Menge jeder CYP-mRNA in der Niere und der Leber wurde durch Echtzeit-RT-PCR bestimmt und auf die von RPL7 als internem Standard normalisiert. Standardkurven wurden unter Verwendung einer RT-Reaktionsmischung mit Gesamt-RNA aus den Nieren von 5- Monate alten weiblichen Landrasse-Schweinen erstellt. Jede Spalte stellt den Mittelwert in jeder experimentellen Gruppe dar, und jeder Balken stellt die SD des Mittelwerts dar (n= 6 für intakte männliche und weibliche Landrassen- und Meishan-Schweine; n= 3 für andere). Signifikante Unterschiede zu den entsprechenden intakten männlichen Schweinen wurden durch Tukey's Post-Hoc-Test bestimmt: ap < 0.01.="" b,="" c="" signifikante="" unterschiede="" zu="" den="" entsprechenden="" tp-unbehandelten="" schweinen,="" wie="" durch="" student's="" t-test="" bestimmt:="" bp="">< 0,05,="" cp=""><>

To date, there are no reports concerning the constitutive amounts of CYP4A24/25  and  CYP4B1 mRNAs and sex differences in their amounts in the pig liver, although a clear sex  difference  (male >weiblich) in der Menge an CYP4A24/25-mRNA wird hier in der Schweineniere beobachtet (Tabelle 1). Um die Wirkungen von Androgen auf die Expression dieser mRNAs in der Niere und der Leber von Landrassen- und Meishan-Schweinen zu klären, untersuchten wir daher nicht nur die Wirkungen der Kastration, sondern auch die Wirkungen der TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen ( Abb. 2). Die Menge an CYP4A24/25-mRNA in der Niere war sowohl bei Landrace- als auch bei Meishan-Schweinen durch Kastration verringert, und die TP-Behandlung der kastrierten männlichen und intakten weiblichen beiden Schweinerassen führte zu einer Erhöhung ihrer Menge. In der Leber beider Schweinerassen wurden jedoch keine derartigen Kastrationseffekte beobachtet, und es wurde auch kein Geschlechtsunterschied in der Menge an CYP4A24/25-mRNA beobachtet. Ebenso wurde bei beiden Schweinerassen keine signifikante Wirkung der TP-Behandlung auf die Menge an hepatischer CYP4A24/25-mRNA beobachtet, obwohl die Erhöhung ihrer Menge durch die TP-Behandlung nur bei kastrierten männlichen Landrasse-Schweinen beobachtet wurde. Darüber hinaus zeigte die CYP4B1-mRNA keinen Geschlechtsunterschied sowohl in der Niere (Abb. 2 und Tabelle 1) als auch in der Leber für jede Schweinerasse. Bei beiden Schweinerassen wurde die Menge an CYP4B1-mRNA durch Kastration und/oder TP-Behandlung nicht signifikant verändert (Abb. 2).

Wir haben zuvor festgestellt, dass die TP-Behandlung zu einem Anstieg der Menge an CYP3A46-mRNA in der Leber von Landrasse-Schweinen führte.22) Daher wurden die Auswirkungen der TP-Behandlung und Kastration auf die mRNA-Menge in der Niere weiter untersucht unter Verwendung von {{3} } Monate alte Landrasse Schweine (Abb. 1). Obwohl die Kastration von Männchen keinen signifikanten Effekt auf die Menge an CYP3A46-mRNA in der Niere hatte, führte die TP-Behandlung von kastrierten Männchen und intakten Weibchen zu einer Abnahme der Menge an CYP3A46-mRNA. Darüber hinaus lag die CYP3A46-mRNA sowohl in der Niere als auch in der Leber aller mit Kastration und/oder TP behandelten Meishan-Schweine unter der Nachweisgrenze.22)

Genetische Faktoren, die für die geschlechtsbezogene Expression von CYP-mRNAs verantwortlich sind

We have previously reported that sex-related expression of CYP mRNAs in the pig liver is, at least in part, dependent on the amount of serum testosterone,8) and  that  the  amount  is  determined  by  autosomal  dominant  inheritance.25) Therefore, using F1 progeny (LM and ML) of Landrace and Meishan pigs, the amounts of sex-related CYP mRNAs in the kidney were measured (Fig. 3). Incidentally, the amounts of serum testosterone in 5-month-old male LM and ML pigs, as well as Meishan pigs, were >40 ng/mL, und die in 5- Monate alten männlichen Landrasse-Schweinen waren<23 ng>

In both LM and ML pigs, the mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, and CYP3A29 in males were much lower than those in  females,  while  the  converse  was  observed  for  CYP2C33 and CYP4A24/25.  For CYP2C49 mRNA,  a  significant  sex  difference (males >Weibchen) wurde bei ML-Schweinen beobachtet, aber kein signifikanter Unterschied wurde bei LM-Schweinen beobachtet, da es beträchtliche interindividuelle Unterschiede zwischen männlichen LM-Schweinen gab. CYP3A46-mRNA wurde bei LM- und ML-Schweinen sowie bei Landrasse-Schweinen nachgewiesen, und ein Geschlechtsunterschied (Männchen< females)="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was observed in lm and ml pigs ="">

Abb. 3. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Menge an CYP-mRNAs in der Niere von 5- Monate alten LM- und ML-Schweinen

Die mRNA-Menge jedes CYP in der Niere wurde durch Echtzeit-RT-PCR bestimmt und auf die von RPL7 als internem Standard normalisiert. Standardkurven wurden unter Verwendung einer RT-Reaktionsmischung mit Gesamt-RNA aus den Nieren von 5- Monate alten weiblichen Landrassenschweinen erstellt, mit Ausnahme der Bestimmung der Menge an CYP2C49-mRNA, wo Standardkurven unter Verwendung einer RT-Reaktion erstellt wurden Mischung mit Gesamt-RNA aus den Nieren 5- Monate alter weiblicher Meishan-Schweine. Jeder Kreis zeigt ein einzelnes Schwein (n= 6 und 9 für männliche bzw. weibliche LM-Schweine; n= 7 und 10 für männliche bzw. weibliche ML-Schweine). Der Balken zeigt den Durchschnitt in jeder Gruppe an. a,b Signifikante Unterschiede zwischen Rüden und Hündinnen in jeder Rasse wurden durch Student's t-Test bestimmt: ap < 0,05,="" bp=""><>

Beziehung zwischen der Menge an Serumtestosteron und der Expression von geschlechtsbezogenen CYP-mRNAs in der Niere

Es wird angenommen, dass die Konzentration von Serumandrogen einer der kritischen Faktoren ist, die Geschlechts- und Rassenunterschiede in den Mengen mehrerer CYP-mRNAs in der Schweineniere hervorrufen. Daher wurde die Beziehung zwischen der Androgenkonzentration im Serum und der geschlechtsbezogenen Expression von CYP-mRNAs (CYP2A19, CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A29, CYP3A46 und CYP4A24/25) in der Niere weiter untersucht unter Verwendung von 1-, { {17}} und 5- Monate alte Schweine. Einige der 1- Monate alten Schweine (unreif,< 10 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" were ="" treated ="" with ="" tp="" and="" used="" as="" samples="" for="" the="" present="" experiments.="" the="" concentrations="" of="" serum="" testosterone="" in="" the="" tp-treated="" pigs="" were ="" 28–59 ng/ml. ="" in ="" addition, ="" serum ="" testosterone ="" amount ="" increased="" in="" an="" age-dependent="" manner="" in="" males25) ="" but ="" not ="" in ="" females="" of="" all="" the="" pigs=""><7 ng  testosterone/ml ="" serum) ="" used. ="" therefore,="" as="" representative="" samples="" of="" females,="" 1-month-old="" and ="" 5-month-old ="" pigs ="" but ="" not ="" 3-month-old ="" pigs ="" were ="" used ="" for ="" the="" present="">

The mRNA amounts of CYP2A19, CYP2B22, CYP3A29, and CYP3A46 in all the pigs with high concentrations (>ca. 30 ng/ml) Serum-Testosteron waren niedrig im Vergleich zu denen bei allen Schweinen mit niedrigen Serum-Testosteron-Konzentrationen (<30 ng l). ="" in ="" particular, ="" the ="" amount ="" of ="" cyp3a29="" mrna="" decreased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent ="" manner ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig ="" examined ="" (fig. ="" 4). ="" furthermore,="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent="" decrease="" in="" the="" amount="" of="" cyp3a46 mrna was also observed ="" in="" all="" the="" pigs="" except="" meishan="">

Die Mengen an CYP2C33- und CYP4A24/25-mRNAs stiegen jedoch in Abhängigkeit von der Serumtestosteronkonzentration bei allen untersuchten Schweinerassen an (Abb. 5). Die Menge an CYP2C49-mRNA stieg in Abhängigkeit von der Testosteronkonzentration im Serum bei Meishan-, LM- und ML-Schweinen an, nicht jedoch bei Landrasse-Schweinen. Außerdem wurde bei den mit TP behandelten 1- Monate alten Landrasse- und Meishan-Schweinen eine geringe Zunahme der Menge an CYP2C49-mRNA beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Expression eines solchen TP-assoziierten Effekts vom Expressionsniveau des/der TP-responsiven Transkriptionsfaktor(s) für die CYP2C49-Genexpression abhängt, die an der Reifung beteiligt ist.

DISKUSSION

In der vorliegenden Studie fanden wir zunächst Geschlechts- und Rassenunterschiede in den Mengen mehrerer CYP-mRNAs in der Niere unter Verwendung von 5- Monate alten Landrasse- und Meishan-Schweinen und ihren F1-Nachkommen (LM und ML). Anschließend untersuchten wir zur Klärung der Wirkung von Androgen auf die Mengen an renalen CYP-mRNAs die Wirkungen einer Kastration und/oder TP-Behandlung auf diese Mengen. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Durch Analysieren solcher Geschlechts- und Rassenunterschiede in Bezug auf die Konzentration von Serumtestosteron haben wir hierin gezeigt, dass Serumtestosteron mindestens einer der kritischen Faktoren ist, die diese Unterschiede in der Menge jeder CYP-mRNA in erzeugen Niere.

Abb. 4. Negative Korrelationen zwischen Serumtestosteronkonzentrationen und Mengen an CYP2A19-, CYP2B22-, CYP3A29- und CYP3A46-mRNAs in der Schweineniere

Serumtestosteronkonzentrationen und Mengen an CYP-mRNA wurden wie in den Materialien und Methoden beschrieben gemessen. Einige der Serumtestosteronkonzentrationen einzelner Schweine wurden zuvor erhaltenen Daten entnommen.24,25) Jedes Symbol steht für jedes einzelne Schwein. Offene Quadrate und Rauten, 1- Monate alte Männchen bzw. Weibchen von Landrasse- und Meishan-Schweinen (n= 3 für beide Geschlechter von Landrasse- und Meishan-Schweinen); graue Quadrate, 3- Monate alte männliche Landrassen- und Meishan-Schweine (n= 4 für Landrassen-Schweine und n= 6 für Meishan-Schweine); geschlossene Quadrate und Rauten, 5- Monate alte Männchen bzw. Weibchen von Landrasse- und Meishan-Schweinen (n= 6 für beide Geschlechter von Landrasse- und Meishan-Schweinen); geschlossene und offene Dreiecke, 5- Monate alte männliche bzw. weibliche LM-Schweine (n= 6 für Männchen und n= 9 für Weibchen); geschlossene und offene umgekehrte Dreiecke, 5-Monate alte männliche bzw. weibliche ML-Schweine (n= 7 für Männchen und n= 10 für Weibchen); geschlossene und offene Kreise, 1- Monate alte männliche und weibliche Landrassen- und Meishan-Schweine, die mit TP behandelt wurden (n= 3 für beide Geschlechter von Landrassen- und Meishan-Schweinen). Die Korrelationen wurden anhand der Daten aller getesteten Tiere untersucht und durch Regressionsanalyse bestimmt, wobei r der Korrelationskoeffizient ist.

Wir haben zuvor Geschlechtsunterschiede gefunden (männlich< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp1a1="" and="" cyp1a2="" mrnas="" in="" the="" liver="" of="" meishan, lm, and ml pigs but not in landrace pigs.23–25) however, ="" no ="" such ="" sex ="" differences were ="" observed in the ="" kidney ="" of landrace="" and="" meishan="" pigs.="" on="" the="" contrary,="" there="" was="" a="" sex="" difference="" (male="" >="" female)="" in="" the="" amount="" of="" cyp4a24/25="" mrna="" in ="" the ="" kidney ="" but ="" not ="" in ="" the ="" liver. ="" sex ="" differences ="" in ="" the ="" amounts="" of="" cyp2a19,="" cyp2c33,="" and="" cyp2c49="" mrnas="" in="" the="" pig="" kidney,="" especially="" in="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs,="" correlated="" with="" the="" previous="" results="" in="" the="">< female="" for="" cyp2a19;="" male="" >="" female="" for="" cyp2c33="" and="" cyp2c49.="" interestingly, ="" sex ="" differences ="">< female)="" in="" the="" amounts="" of="" cyp2b22,="" cyp3a29, and/or cyp3a46="" mrnas="" in="" the="" kidney="" of="" meishan,="" lm,="" and="" ml="" pigs="" were="" the="" opposite="" of="" that="" previously obtained in the liver.22) sex differences in the amount of ="" cyp2a19,="" cyp3a29,="" and="" cyp4a24/25 ="" mrnas ="" were ="" observed ="" in the kidney of all the breeds of pig examined. although ="" sex ="" differences ="" in cyp2b22,="" cyp2c33, ="" and/or cyp2c49 ="" were ="" observed in meishan, lm, ="" and ml ="" pigs, ="" no ="" such ="" sex ="" differences ="">

Tabelle 2. Zusammenfassung der Androgen-abhängigen Geschlechts- und Rasseunterschiede in der Genexpression von CYP-Isoformen in der Schweineniere

These  sex  and  breed  differences  can  be  explained  by  the  differences  in  the  concentration  of  serum  testosterone  in  male pigs. Male 5-month-old Meishan, LM, and ML pigs had high concentrations of serum testosterone (>ca. 40 ng/ml), während die von Landrassenschweinen niedrige Konzentrationen aufwiesen (<23 ng l). ="" because ="" the ="" amount ="" of ="" cyp2a19="" and="" cyp3a29 ="" mrnas ="" considerably ="" decreased ="" in ="" pigs ="" with ="">ca. 20 ng/ml Serumtestosteron, Geschlechtsunterschiede (männlich< female)  in ="" their ="" amounts ="" were ="" observed ="" in ="" all ="" the ="" breeds ="" of ="" pig. ="" likewise, ="" since ="" the ="" amount ="" of ="" cyp4a24/25="" mrna="" increased="" in="" a="" serum="" testosterone="" concentration-dependent manner up to 80 ng/ml, a sex difference (male =""> female) was observed in all the breeds of pig. However, because  clear changes in the amount of CYP2B22, CYP2C33, and CYP2C49 mRNAs occurred at >30 ng/ml Serum-Testosteron, Geschlechtsunterschiede in ihren Mengen wurden bei Meishan-, LM- und ML-Schweinen, aber nicht bei Landrasse-Schweinen beobachtet. Dementsprechend wird angenommen, dass solche Geschlechts- und Rassenunterschiede von denen der Testosteronkonzentration im Serum abhängen. Diese Hypothese wird weiter gestützt durch die Experimente unter Verwendung von kastrierten und/oder TP-behandelten Schweinen. Die Mengen dieser mRNAs in kastrierten Männchen (<12 ng  testosterone/ml ="" in ="" serum) ="" were ="" almost ="" the="" same="" as="" the="" corresponding="" females.="" serum="" concentrations="" of="" testosterone="" in="" 5-month-old="" castrated="" males="" and="" intact="" females="" rose="" to="">100 ng/ml bei TP-Behandlung. Folglich stiegen bei den mit TP behandelten Schweinen die Mengen an CYP2C33- und CYP4A24/25-mRNAs, CYP2C33- und CYP4A24/25-mRNAs genauso stark oder stärker an als bei 5- Monate alten männlichen Meishan-Schweinen und die Mengen an CYP2B22-, CYP3A29- und CYP3A46-mRNAs nahmen ebenso stark ab wie die der entsprechenden männlichen Schweine.

Es wird angenommen, dass ein Unterschied im Sekretionsprofil des Wachstumshormons (GH) zwischen Männchen und Weibchen bei vielen Tieren, insbesondere bei Nagetieren, zu geschlechtsspezifischen Unterschieden in der Menge mehrerer arzneimittelmetabolisierender Enzyme, einschließlich CYPs, in der Leber führt.26) Zum Beispiel werden geschlechtsspezifische Unterschiede in den mRNA-Mengen von Ugh-, Sult- und Cyp4a-Isoformen in der Mausleber durch männliche GH-Sekretion und/oder Androgen beeinflusst, während diese Geschlechtsunterschiede hauptsächlich durch Androgen in der Niere reguliert werden.21,27 ,28) Darüber hinaus wird vorgeschlagen, dass ein transagierender Locus, genannt GH-abhängige Repression (GDR), das Gen für die weibchenspezifische Steroid-15 -hydroxylase (Cyp2a4) in der Mausleber reguliert,29) aber über dieses Gen wird berichtet durch Androgen in Leber und Niere männlicher Mäuse wechselseitig reguliert werden.30) Umgekehrt haben wir zuvor festgestellt, dass bei Landrassenschweinen mit einem Geschlechtsunterschied im GH-Sekretionsprofil31) keine Geschlechtsunterschiede in den hepatischen mRNA-Mengen auftraten mehrere CYP-, SULT- und UGT-Isoformen die Geschlechtsunterschiede bei Meishan-Schweinen zeigen.22–25,32) Daher wird angenommen, dass solche Geschlechtsunterschiede bei Schweinen hauptsächlich von Unterschieden in der Testosteronkonzentration im Serum abhängen. Da jedoch das Sekretionsprofil von GH durch Androgen modifiziert wird,33–35) besteht die Möglichkeit, dass die bei Kastration und/oder TP-Verabreichung beobachteten Änderungen der mRNA-Mengen zumindest teilweise durch eine Androgen-vermittelte Änderung des GH zustande kommen Sekretionsmuster nicht ausgeschlossen werden.

Breed  differences  in  amounts  of  the  mRNAs  of  CYP1A1, CYP1A2, CYP2A19, CYP2B22, and CYP4B1  between  sex-matched  Landrace  and  Meishan  pigs  were  also  observed  in  the  kidney  (Table  1),  while  no  such  clear  breed  differences  were  observed  in  the  liver.22,25) Additionally, as for CYP2C49 mRNA,  individual  differences  in  each  breed  of  pig  were  observed  regardless  of  serum  testosterone  concentration,  suggesting that these varieties have genetic diversity. Incidentally, pig  breeds  are  not  genetically  homogeneous.  Interestingly,  CYP3A46 mRNA was  clearly  detected in  both the  kidney  and  the liver of Landrace pigs but was below the detection limit in  both organs of Meishan pigs.22) Furthermore, CYP3A46 mRNA was  clearly  detected  in  both  the  kidney  and  the  liver  of  LM  and ML pigs, indicating that expression of CYP3A46 mRNA, as well as serum testosterone,25)  is  determined  by  autosomal  dominant inheritance. Because 5-month-old male LM and ML pigs, but not Landrace pigs, had high concentrations of serum  testosterone (>40 ng/ml) wurde ein geschlechtsspezifischer Unterschied in der Menge an CYP3A46-mRNA bei LM- und ML-Schweinen, aber nicht bei Landrasse-Schweinen beobachtet. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass genetische (rasse-) und gewebeselektive Faktoren zusammen mit Serum-Testosteron an geschlechts- und rassebezogenen Expressionsniveaus mehrerer CYP-Gene beteiligt sind. Leider bleiben diese Faktoren unklar.

Zusammenfassend zeigen wir hier, dass es Geschlechts- und Rassenunterschiede in den mRNA-Mengen von Isoformen der CYP2-, CYP3- und CYP4-Familie in der Schweineniere gibt, und legen stark nahe, dass diese Unterschiede von genetischen Wirtsfaktoren, einschließlich der Konzentration von Serumandrogen, abhängen . Darüber hinaus zeigen wir Gewebeunterschiede zwischen der Niere und der Leber bei der geschlechts-/androgenbezogenen Expression von CYP-Genen und weisen stark darauf hin, dass es einen gewebeselektiven Faktor gibt, der für die androgenbezogene Expression von CYP-Genen verantwortlich ist. Zukünftige Forschungen zur Identifizierung des geschlechtsbezogenen genetischen Wirtsfaktors und des gewebeselektiven Faktors, die für die Regulation der CYP-Gene verantwortlich sind, sind erforderlich. Da Androgen einer der Wirtsfaktoren ist, die die Expressionsniveaus mehrerer CYPs bestimmen, die für den Arzneimittelstoffwechsel verantwortlich sind, wird in jedem Fall davon ausgegangen, dass die Messung der Testosteronkonzentration im Serum zur Entwicklung einer geeigneten individuellen Arzneimittelbehandlung beiträgt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Grant-in-Aid for Scientific Research der Japan Society for the Promotion of Science (Nr. 19K06463, MK) unterstützt. Die Autoren danken der Tsukuba Operation Unit 7, Technical Support Center of Central Region, NARO, Tsukuba, Japan, für die Pflege der Tiere und das Sammeln von Geweben.

VERWEISE

1) Almazroo OA, Miah MK, Venkataramanan R. Arzneimittelstoffwechsel in der Leber. Klin. Liver Dis., 21, 1–20 (2017).

2) DW Nebert, K. Wikvall, WL Miller. Menschliche Cytochrome P450 in Gesundheit und Krankheit. Philos. Trans. R. Soc. Lang. B Biol. Sci., 368, 20120431 (2013).

3) Burkina V, Rasmussen MK, Pilipenko N, Zamaratskaia G. Vergleich von Xenobiotika metabolisierendem Human-, Schweine-, Nagetier- und Fisch-Cytochrom P450. Toxicology, 375, 10–27 (2017).

4) SD Nielsen, Y Bauhaus, G Zamaratskaia, MA Junqueira, K Blaabjreg, B Petrat-Melin, JF Young, MK Rasmussen. Konstitutive Expression und Aktivität von Cytochrom P450 bei konventionellen Schweinen. Auflösung Tierarzt. Sci., 111, 75–80 (2017).

5) Puccinelli E, Gervasi PG, Longo V. Xenobitotisch metabolisierendes Cytochrom P450 beim Schwein, ein vielversprechendes Tiermodell. akt. Drug Metab., 12, 507–525 (2011).

6) W. Schelstraete, LD Clerck, E. Govaert, J. Millecam, M. Devreese, D. Deforce, J. V. Bocxlaer, S. Croubels. Wissenschaft. Rep., 9, 9233 (2019).

7) Skaanild MT. Porcines Cytochrom P450 und Metabolismus. akt. Pharm. Des., 12, 1421–1427 (2006).

8) Kojima M. Geschlechts- und Rassenunterschiede in der konstitutiven Genexpression von Arzneimittel-metabolisierenden Enzymen in der Leber bei Meishan- und Landrasse-Schweinen: Testosteron-vermittelte Unterschiede. Jpn. Agrar. Auflösung Q., 54, 7–12 (2020).

9) Bajaj P, Chowdhury SK, Yucha R, Kelly EJ, Xiao G. Neue Nierenmodelle zur Untersuchung von Metabolismus, Transport und Toxizität von Arzneimitteln und Xenobiotika. Arzneimittel-Metab. Dispos., 46, 1692–1702 (2018).

10) Ritter KM, Rowland A, Bergleute JO. Renaler Arzneimittelstoffwechsel beim Menschen: das Potenzial für Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Endobiotika mit Cytochrom P450 (CYP) und UDP-Glucuronosyltransferase (UGT). Br. J. Clin. Pharmacol., 76, 587–602 (2013).

11) Kojima M, Morozumi T. Klonierung von sechs cDNAs voller Länge, die Cytochrom-P450-Enzyme von Schweinen kodieren, und Genexpression dieser Enzyme in Leber und Niere. J. Health Sci., 50, 518–529 (2004).

12) Lundell K. Klonierung und Expression von zwei neuartigen Fettsäurehydroxylasen aus Schweineleber und -niere [Cytochrom P450 (CYP)4A24 und CYP4A25]. Biochem. J., 363, 297–303 (2002).

13) A. Nannelli, V. Chirulli, V. Longo, PG Gervasi. Expression und Induktion von CAR- und PXR-reguliertem CYP2B und CYP3A in Leber, Niere und Atemwegen des Schweins durch Rifampicin. Toxicology, 252, 105–112 (2008).

14) Puccinelli E, Gervasi PG, La Marca M, Buffy P, Longo V. Expression und Induzierbarkeit von CYP2C33, CYP2C42, CYP2C49, CYP2B22 und CYP3As durch Phenobarbital in Leber, Niere, Dünndarm und Nasengewebe von Schweinen. Xenobiotica, 40, 525–535 (2010).

15) H. Shang, K. Guo, Y. Liu, J. Yang, H. Wei. Konstitutive Expression von CYP3A-mRNA in Geweben von Bama-Miniaturschweinen. Gene, 524, 261–267 (2013).

16) S. Imaoka, T. Hiroi, Y. Tamura, H. Yamazaki, T. Shimada, M. Komori, M. Degawa, Y. Funai und Charakterisierung von Maus-CYP4B1. Bogen. Biochem. Biophys., 321, 255–262 (1995).

17) Jarrar YB, Lee SJ. Molekulare Funktionalität von Cytochrom P450 4 (CYP4) genetischen Polymorphismen und ihre klinischen Auswirkungen. Int. J.Mol. Sci., 20, 4274 (2019).

18) M. Hiratsuka, T. Matsuura, E. Watanabe, M. Sato, Y. Suzuki. biol. Pharm. Bull., 19, 512–517 (1996).

19) Degawa M, Miura S, Hashimoto Y. Androgenabhängiges renales mikrosomales Cytochrom P-450 verantwortlich für die N-Hydroxylierung und mutagene Aktivierung von 3-Methoxy-4-aminoazobenzol im BALB/c Maus. Cancer Res., 50, 2729–2733 (1990).

20) Isern J, Meseguer A. Hormonelle Regulation und Charakterisierung der 5′-flankierenden Region des Cyp4b1-Gens der Maus. Biochem. Biophys. Auflösung Commun., 307, 139–147 (2003).

21) Zhang Y, Klaassen-CD. Hormonelle Regulation von Cyp4a-Isoformen in Mausleber und -niere. Xenobiotica, 43, 1055–1063 (2013).

22) Kojima M, Degawa M. Geschlechtsunterschiede in konstitutiven mRNA-Spiegeln von CYP2B22, CYP2C33, CYP2C49, CYP3A22, CYP3A29 und CYP3A46 in der Schweineleber: Vergleich zwischen Meishan- und Landrasse-Schweinen. Arzneimittel-Metab. Pharmacokinet., 31, 185–192 (2016).

23) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Ein neuer geschlechtsspezifischer Unterschied in der konstitutiven Expression von hepatischen Cytochrom P4501A-Unterfamilienenzymen bei Meishan-Schweinen. Biochem. Pharmacol., 75, 1076–1082 (2008).

24) Kojima M, Sekimoto M, Degawa M. Androgen-vermittelte Herunterregulierung von Genen der CYP1A-Unterfamilie in der Schweineleber. J. Endocrinol., 207, 203–211 (2010).

25) Kojima M, Degawa M. Der Androgenspiegel im Serum wird durch autosomal-dominante Vererbung bestimmt und reguliert geschlechtsbezogene CYP-Gene bei Schweinen. Biochem. Biophys. Auflösung Commun., 430, 833–838 (2013).

26) Wachsmann DJ, Holloway MG. Geschlechtsspezifische Unterschiede in der Expression hepatischer Arzneimittel-metabolisierender Enzyme. Mol. Pharmacol., 76, 215–228 (2009).

27) Buckley DB, Klaassen-CD. Mechanismus der geschlechtsspezifischen UDP-Glucuronosyltransferase-mRNA-Expression in Mausleber und -niere. Arzneimittel-Metab. Dispos., 37, 834–840 (2009).

28) Alnouti Y, Klaassen CD. Mechanismen der geschlechtsspezifischen Regulation von Maus-Sulfotransferasen (Sults). Xenobiotica, 41, 187–197 (2011).

29) Aida K, Negishi M. Ein trans-wirkender Locus reguliert die Transkriptionsrepression des weiblichen spezifischen Steroid-15 --Hydroxylase-Gens in männlichen Mäusen. J.Mol. Endocrinol., 11, 213–222 (1993).

30) Squires EJ, Negishi M. Reziproke Regulation der geschlechtsabhängigen Unterdrückung der Testosteron-15 -hydroxylase (P-45015) in Leber und Niere männlicher Mäuse durch Androgen. Nachweis für ein einzelnes Gen. J.Biol. Chem., 263, 4166–4171 (1988).

31) Arbona JR, Marple DN, Russell RW, Rahe CH, Mulvaney DR, Sartin JL. Sekretionsmuster und metabolische Clearance-Rate von Schweine-Wachstumshormon bei auf Wachstum selektierten Schweinen. J. Anim. Sci., 66, 3068–3072 (1988).

32) Kojima M, Degawa M. Geschlechtsunterschiede in der konstitutiven Genexpression von Sulfotransferasen und UDP-Glucuronosyltransferasen in der Schweineleber: Androgen-vermittelte Regulation. Arzneimittel-Metab. Pharmacokinet., 29, 192–197 (2014).

33) Chowen JA, Frago LM, Argente J. Die Regulierung der GH-Sekretion durch Sexualsteroide. EUR. J. Endocrinol., 151 (Ergänzung 3), U95–U100 (2004).

34) Dubreuil P., Pelletier P., Couture Y., Lapierre H., Petitclerc D., Moris set J., Gaudreau P., Brazeau P. Kastration und Testosteroneffekte auf die endogene und Somatocrinin-induzierte Wachstumshormonfreisetzung bei intakten und kastrierten männlichen Schweinen. Domest. Animation. Endocrinol., 6, 15–24 (1989).

35) Giustina A, Veldhuis JD. Pathophysiologie der Neuroregulation der Wachstumshormonsekretion bei Versuchstieren und Menschen. Endokrin. Rev., 19, 717–797 (1998).