Abstrakt
Untersuchung der synergistischen inhibitorischen Wirkungen vonCistanche DeserticolaPhenylethanoidglykoside (PHGs) und Glabridin (GLA) zur Hautpigmentierung, das optimale Massenverhältnis von PHGS zu GLAin vitroTyrosinase-Aktivitätshemmungstests, 1, {1- Diphenyl -2- picrylhydrazyl (dpph) radikales Scavenging und 2,2'-Azino-Bis (3- Ethyylbenzothiazolin {8}}}}}}}}}}} Sulfonicsäure. Weitere Bewertungen wurden unter Verwendung von drei zellulären Modellen durchgeführt:

Ein UVB-induzierter B16F10-Melanogenese-Modell zur Bewertung der Hemmung der Melaninsynthese über die Tyrosinaseaktivität und den Melaningehalt;

Ein Lipopolysaccharid (LPS) -induziertes HACAT-Entzündungsmodell zur Bewertung entzündungshemmender Effekte durch Messung von Interleukin -6 (il -6) und Tumornekrosefaktor (TNF-) Unterdrückung;

Ein AAPH (2,2'-Azobis (2- Amidinopropan) Dihydrochlorid-induziertes HACAT-oxidatives Spannungsmodell zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität über Superoxiddismutase (SOD) und Katalase (CAT) -Enteiterung.

Das optimale PHGS/GLA -Massenverhältnis wurde durch diese Modelle identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass PHGS/GLA-Lösungen (hergestellt in phosphatgepufferter Salzlösung, PBS, pH 6,8) bei Massenverhältnissen von 1: 1, 5: 1 und 10: 1 eine signifikante Tyrosinase-Hemmung und synergistische antioxidative Wirkungen aufwiesen. Die Tyrosinase -Hemmraten betrugen 94,37%, 92,93%bzw. 88,06%; Die DPPH -Radikalfängerquoten erreichten 89,44%, 88,72%und 88,10%; Abts⁺ Die Sparquoten betrugen 100,13%, 100,01%und 99,87%. Bei 25 ug/ml in DMEM zeigten PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) keine Zytotoxizität gegenüber B16F10- oder HACAT -Zellen. PHGS/GLA (1: 1) DMEM -Lösung angezeigtÜberlegene Tyrosinase -Hemmung(23,80% Restaktivität), signifikantReduzierter Melaningehalt(30,90%) und übertrafen andere Verhältnisse und Monotherapien bei der Unterdrückung von IL -6/TNF- Freisetzung und Verbesserung der SOD/CAT-Aktivität. Die synergistische Kombination von PHGS und GLA linderte e wirksam s sKin -Hyperpigmentierung durch Hemmung der Melanogenese, Entzündung reduzieren, undVerbesserung der antioxidativen Kapazität.

Schlüsselwörter
CistancheDeserticola Phenylethanoidglykoside; Glabridin; synergistischer Effekt; Anti-Melanogenese; Antioxidans; entzündungshemmend; pharmazeutische Rohstoffe

 

 

 

CistancheDeserticola extrahieren mitHochrangiger EbenePhenylethanoidglykoside zur Hautaufhellung

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Versuchsabschnitt

1.1 Materialien, Reagenzien und Instrumente

MausmelanomzellenB16F10 (Katalog Nr.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Human verewige KeratinozytenHacat (Katalog Nr.: ICELL-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, China.

Cistanche Phenylethanoidglycoside (PHGs)UndGlabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biologisch Chemie Technologie Co., Ltd.

Tyrosinase, HEFEI BASF Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)UndL-Tyrosin, Aladdin Biochemie Technologie Co., Ltd., Shanghai, China.

1, 1- diphenyl -2- picrylhydrazyl (DPPH), Tokio Chemie Industrie Co., Japan.

2,2'-Azino-Bis (3- Ethylbenzothiazolin -6- Sulfonsäure) Diammoniumsalz (ABTS), Shanghai Yuanye Biotechnologie Co., Ltd.

Ascorbinsäure (VC), Tianjin Damao Chemikalie Reagenz Fabrik.

KaliumpersulfatUndwasserfreies Ethanol, Tianjin Zhiyuan Chemikalie Reagenz Co., Ltd.

Natriumhydroxid, Chengdu Huayi Pharmazie Hilfsstoff Herstellung Co., Ltd.

Dipotium -Phosphat, Shanghai Sanpu Chemie Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Biotechnologie Co., Ltd.

Zell Counting Kit -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton x -100, Dimethylsulfoxid (DMSO), 2,2'-Azobis (2- Methylpropionamidin) Dihydrochlorid (AAPH), UndLipopolysaccharid (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM-Medium mit hohem Glucose, Thermo Fischer Wissenschaftlich (China).

Fetales Rinderserum (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Handel Co., Ltd.

Penicillin-Streptomycin-Lösung, Shanghai Dashier Biotechnologie Co., Ltd.

Menschliches il -6 Elisa Kit, menschliches Tnf-Elisa-Kit, Undmenschliche Katze Elisa Kit, Wuhan Feine Biotech Co., Ltd.

Total Superoxid Dismutase (SOD) Assay -Kit, Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Alle Reagenzien waren von analytischer Klasse.

Instrumente verwendet:

Multiskan FC Vollwellenlängen-MikroplattenleserUndHeracell 371 CO2 -Inkubator, Thermo Fischer Wissenschaftlich, USA.

KQ -200 VDB Ultrasonic Cleaner, Kunshan Ultraschall Instrumente Co., Ltd.

Dvkw-d -2 digitales thermostatisches Wasserbad, Peking Yongguangming Medical Instrument Factory.

DHG -9246 Ein elektrischer thermostatischer Explosionstrocknungsofen, Shanghai Jinghong Experimentell Ausrüstung Co., Ltd.

KN4006B UVB Ultraviolet Strahlungsinstrument(Bestrahlungsintensität: 8 mw/cm²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Methoden

Erstens wurden PHGs und GLA entweder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Ph =6. 8) oder 50% Ethanollösung gelöst, um Lösungen mit Massenkonzentrationen von zu erstellen{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 {0}}}}}}}}}} 05, 0.025, 0,1, 0,8, 0,8, 1.2, 1.6 und 2.0 g/l. Dann wurden PHGs und GLA in Verhältnissen von gemischtm (PHGS): M (Gla)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20 und 1:40zur Herstellung von PHGS/GLA -Lösungen mit einer Gesamtmassenkonzentration von0.4 g/L, beschriftet alsPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), jeweils.

 

1.3 Biochemische Experimente

1.3.1 Tyrosinase -Aktivitätshemmungstest

In einer 96- -Bellschette,,50 & mgr; l der Testprobenlösung, 50 μl PBS (ph =6. 8), Und50 μl L-Tyrosin-Lösung (1 g/l)wurden nacheinander hinzugefügt. Die Platte wurde 10 Minuten lang in einem 37 -Grad -Wasserbad inkubiert. Dann,5 0 μl Tyrosinase -Lösung (0,4 g/l, äquivalent zu 200 U/ml)wurde hinzugefügt, und die Platte wurde für weitere 10 Minuten in 37 Grad Wasserbad erneut inkubiert.

Arbutin (ARB)wurde als positive Kontrolle verwendet undPbs (ph =6. 8)wurde als leere Kontrolle verwendet.

Die Absorption der Lösung bei490 nmwurde unter Verwendung eines Mikroplat -Lesers gemessen, und die In -vitro -Tyrosinase -Hemmrate (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (1) berechnet.

 

 

In der Formel:

A _ Reaktionist die Absorption der Probenlösung, die L-Tyrosin-Lösung, PBS und Tyrosinase-Lösung enthält.

A _ Reaktionskontrolleist die Absorption der Probenlösung, die eine L-Tyrosin-Lösung und PBS ohne Tyrosinase-Lösung enthält.

A _ leerist die Absorption der Lösung, die L-Tyrosin-Lösung, PBS und Tyrosinase-Lösung ohne Probe enthält.

A _ leere Steuerungist die Absorption der Lösung, die eine L-Tyrosin-Lösung und PBS ohne Probe und Tyrosinase-Lösung enthält.

1.3.2 Bestimmung der DPPH -Aktivität mit freiem Radikal

Erstens wurde {{0}}. 0197 g (0,05 mmol) DPPH genau gewogen und in 250 ml wasserfreiem Ethanol gelöst, um eine DPPH -Arbeitslösung mit einer Konzentration von zu erstellen0. 2 mmol/l.

Dann wurden PHGs und GLA in 50% Ethanol gelöst, um Ethanollösungen von PHGS und GLA mit Massenkonzentrationen von herzustellen{{{Oder. Ethanollösungen von VC wurden auf die gleiche Weise hergestellt.

Anschließend wurden die Ethanollösungen von PHGS und GLA in Verhältnissen von gemischtm (PHGS -Lösung): M (Gla -Lösung)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40um 9 Ethanollösungen von PHGS/GLA mit unterschiedlichen Massenverhältnissen zu erhaltenPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Endlich,100 μl jeder ProbenlösungUnd100 μl der DPPH -Arbeitslösungwurden zu einer 96- -Wellplatte hinzugefügt, gleichmäßig gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Dunkelheit inkubiert. Die Absorption bei517 nmwurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. VC wurde als positive Kontrolle verwendet und jedes Experiment wurde dreimal wiederholt.

Die DPPH -Spulenrate (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (2) berechnet.

 

In der Formel:

A1ist die Absorption der Probenlösung + DPPH -Arbeitslösung.

A2ist die Absorption von 50% Ethanol + DPPH -Arbeitslösung.

A3ist die Absorption der Probenlösung + 50% Ethanol.

 

1.3.3 Bestimmung der ABTS⁺

Erste,1 g (1,82 mmol) ABTSwurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine ABTS -Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von vorzubereiten7,4 mmol/l. 0. 5 g Kaliumpersulfatwurde in entionisiertem Wasser gelöst, um eine Kalium -Persulfat -Arbeitslösung mit einer Endkonzentration von vorzubereiten2,6 mmol/l. Gleiche Volumina der Abts -Arbeitslösung und der Kalium -Persulfat -Arbeitslösung wurden gemischt und 12 Stunden lang im Dunkeln reagieren, um die Abts⁺ -Arbeitslösung vorzubereiten.

Dann Ethanol -Lösungen von PHGS, GLA und VC sowie PHGS/GLA Ethanol -Lösungen mit Verhältnissen vonPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40)wurden gemäß der in Abschnitt 1.3.2 beschriebenen Methode hergestellt.

Endlich,40 μl jeder ProbenlösungUnd160 μl der Abts⁺ -Arbeitslösungwurden zu einer 96- -Wellplatte hinzugefügt, gleichmäßig gemischt und 6 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln reagiert. Die Absorption der Lösung bei734 nmwurde mit einem Mikroplattenleser gemessen.

Die Abts⁺ -Spulenrate (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (3) berechnet.

 

 

In der Formel:

A1ist die Absorption der Probenlösung + Abts⁺ Arbeitslösung.

A2ist die Absorption von entionisiertem Wasser + Abts⁺ Arbeitslösung.

A3ist die Absorption der Probenlösung + entionisiertes Wasser.

1.4 Zellversuche

1.4.1 Zellkultur

Nach der Wiederbelebung von B16F10- und Hacat-Zellen wurden sie in DMEM-Hochglucose-Medium (10% fötales Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung) ausgesät und kultiviert um 1% Penicillin-Streptomycin) und bei kultiviert37 Grad, 5% CO2, Und70% Feuchtigkeit24 Stunden in einem Inkubator. Der Zellwachstumsstatus wurde unter einem Mikroskop beobachtet, und aufgrund der Zellwachstumsbedingung wurden mittlere Veränderungen oder Passagen nach Bedarf durchgeführt.

1.4.2 Experimentelle Gruppierung

Die logarithmischen Phase B16F10 und Hacat-Zellen wurden in 96- -Geplatten mit einer geeigneten Zelldichte ausgesät und 24 Stunden lang kultiviert, um die Zell Adhärenz zu ermöglichen. Probenlösungen mit unterschiedlichen Konzentrationen wurden unter Verwendung von DMEM -Medium hergestellt.

Die Versuchsgruppen waren wie folgt:

Normale Gruppe

Modellgruppe

PHGS niedrig dosierte Gruppe(125 ug/ml)

PHGS mit mittlerer Dosis(250 ug/ml)

PHGS Hochdosierte Gruppe(500 ug/ml)

GLA Niedrig dosierte Gruppe(6,25 ug/ml)

GLA mitteldosis Gruppe(12,5 ug/ml)

GLA Hochdosierte Gruppe(25 ug/ml)

PHGS/GLA (1: 1) Gruppe(25 ug/ml)

PHGS/GLA (5: 1) Gruppe

PHGS/GLA (10: 1) Gruppe

Für dieUVB-induziertes Pigmentierungsmodell in B16F10-ZellenDie Modellgruppenzellen wurden mit behandelt30 μl PBS (ph =7. 4)und bestrahlt unter einem UVB -ultravioletten Strahlungsinstrument bei3 cm unter dem Gerätfür110 Sekunden. Die Versuchsgruppen wurden mit vorbehandelt100 & mgr; l verschiedener Probenlösungen1 Stunde vor dem Hinzufügen30 μl PBSund Bestrahlung unter dem UVB -Gerät für 110 Sekunden. Die normale Gruppe wurde kontinuierlich mit einem Hochglucose-DMEM-Medium behandelt, und die Blindgruppe enthielt keine Zellen, sondern durch eine gleiche Menge an Medium.

Für dieLPS-induziertes Entzündungsmodell in Hacat-ZellenDie Modellgruppe wurde mit behandelt20 ug/ml LPS PBS -Lösung24 Stunden. Die Versuchsgruppen wurden mit vorbehandelt100 & mgr; l verschiedener Probenlösungen24 Stunden vor dem Hinzufügen20 ug/ml LPS -Lösungfür weitere 24 Stunden. Die normale Gruppe wurde kontinuierlich mit einem Hochglucose-DMEM-Medium behandelt, und die Blindgruppe enthielt keine Zellen, sondern durch eine gleiche Menge an Medium.

Für dieAHAPH-induziertes oxidatives Stressmodell in Hacat-ZellenDie Modellgruppe wurde mit behandelt25 mmol/l Aaphlösung24 Stunden. Die Versuchsgruppen wurden mit vorbehandelt100 & mgr; l verschiedener Probenlösungen24 Stunden vor dem Hinzufügen25 mmol/l Aaphlösungfür weitere 24 Stunden. Die normale Gruppe wurde kontinuierlich mit einem Hochglucose-DMEM-Medium behandelt, und die Blindgruppe enthielt keine Zellen, sondern durch eine gleiche Menge an Medium.

Jede Gruppe wurde mit mit3 Replikate Brunnenund kultiviert bei37 Grad, 5% CO2, Und70% Feuchtigkeitin einem Inkubator.

1.4.3 Zytotoxizitätstest

Die Zytotoxizität wurde unter Verwendung der gemessenCCK8 -Methode. Logarithmische Phase B16F10 und Hacat-Zellen wurden mit verdaut0. 25% Trypsin3 Minuten. Nachdem die Verdauung mit dem Medium gestoppt worden war, wurden die Zellen wiederholt pipettiert, um eine Zellsuspension mit einer Dichte von vorzubereiten1 × 10 ⁴ -Zellen/ml. Die Zellen wurden gleichmäßig in {96- Well -Platten bei ausgesät100 μl pro Brunnenund PBS wurde in die peripheren Brunnen hinzugefügt. Nach der Einhaltung von Zellen wurden verschiedene Konzentrationen von Probenlösungen zugegeben, mit3 replizieren Sie Brunnen pro Gruppeund die Zellen wurden bei kultiviert37 Grad, 5% CO2, Und70% Feuchtigkeitfür24, 48 und 72 StundenVor dem Abwerfen des Mediums.

Für alle Gruppen,100 & mgr; l CCK8 DMEM-Hochglucose-Medium (enthält 10% CCK8)wurde hinzugefügt und inkubiert für60 Minuten. Die Absorption der Lösung bei450 nmwurde mit einem Mikroplattenleser gemessen.

Die Zelllebensfähigkeit (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (4) berechnet.

 

In der Formel:

A _ behandeltist die Absorption der guthaltigen Zellen, der CCK8 -Lösung und der Probenlösung.

A _ leerist die Absorption der gut enthaltenden Medium- und CCK8 -Lösung, jedoch ohne Zellen.

A0ist die Absorption der guthaltigen Zellen und der CCK8 -Lösung, jedoch ohne die Probenlösung.

1.4.4 Tyrosinase -Aktivitätstest

Die L-DOPA-Methode wurde verwendet, um die Tyrosinaseaktivität zu messen. Nach der Behandlung der Zellen für48 StundenWie in Abschnitt 1.4.2 beschrieben, wurde der Überstand verworfen und die Brunnen wurden zweimal mit PBS (ph =7. 4) gewaschen. Dann,50 μl 1% Triton x -100 Lösungwurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt und sofort in einem Gefrierschrank von –80 Grad platziert30 Minuten. Die Zellen wurden bei Raumtemperatur aufgetaut, um Lyse zu induzieren.

Nach dem Vorwärme bei37 Gradfür5 Minuten, 10 μl 10 mmol/l l-dopa-Lösungwurde zu jedem Brunnen hinzugefügt und inkubiert37 Grad, 5% CO2 und 70% Luftfeuchtigkeitfür1 Stunde. Die Absorption bei475 nmwurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Jedes Experiment wurde wiederholtdreimalund die Tyrosinaseaktivität (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (5) berechnet.

In der Formel:

A _ Experimentist die Absorption der guthaltigen Zellen und der Probenlösung unter UVB -Bestrahlung.

A _ Normalist die Absorption der guthaltigen Zellen und der Probenlösung ohne UVB -Bestrahlung.

A _ leerist die Absorption des gut enthaltenden Mediums, jedoch ohne Zellen.

 

1.4.5 Melaningehaltmessung

Die NaOH -Lyse -Methode wurde verwendet, um den Melaningehalt zu messen. Nach der Behandlung der Zellen für72 StundenWie in Abschnitt 1.4.2 beschrieben, wurde der Überstand verworfen und die Brunnen wurden zweimal mit PBS gewaschen.100 & mgr; l NaOH wässriger Lösung, die 10% DMSO (1 mol/l) enthält, enthältwurde zu jeder Vertiefung hinzugefügt und die Platte wurde in a platziert90 -Grad -Ofenfür1 Stunde. Die Absorption bei490 nmwurde mit einem Mikroplattenleser gemessen. Jedes Experiment wurde wiederholtdreimalund der Melaningehalt (%) wurde unter Verwendung von Gleichung (5) berechnet.

 

1.5 Messung von entzündlichen Faktoren und oxidativen Stressindikatoren

Nach der Behandlung der Zellen für48 StundenWie in Abschnitt 1.4.2 beschrieben,HakatzellenAus jeder Gruppe wurden zentrifugiert und der Überstand mit einem Zellschaber gesammelt und der Überstand gesammelt. Die Konzentrationen von IL -6 und TNF- wurden gemäß den Anweisungen der ELISA-Kits gemessen.

Nach der Behandlung der Zellen für48 StundenHacat-Zellen wurden unter Verwendung eines Zellschabers gesammelt, wiederholten Gefrier-Tauzzyklen ausgesetzt, um die Zelllyse zu induzieren, und zentrifugiert an12, 000 RPM für 10 Minuten bei 4 Grad RPM. Der Überstand wurde gesammelt und die Aktivitäten vonSeitund Konzentrationen vonKATZEwurden unter Verwendung der ELISA KIT -Anweisungen gemessen.

 

1.6 Kombinationsindexmessung

DerKombinationsindex (CI) -Methode[20] wurde verwendet, um zu bewerten, ob die Kombination von PHGS und GLA bei verschiedenen Massenverhältnissen synergistische Wirkungen auf die Hemmung der Tyrosinaseaktivität und -Antioxidation aufwies. Der Kombinationsindex wurde unter Verwendung von Gleichung (6) berechnet.

 

In der Formel:

D1UndD2darstellenx% Aktivität.

Dxrepräsentiert die Konzentration (g/l) jeder einzelnen Substanz, wenn sie allein verwendet werden, um zu erreichenx% Aktivität.

DerCompuyn -Softwarewurde für Berechnungen verwendet:

Ci> 1zeigt eine antagonistische Wirkung an.

Ci=1zeigt einen additiven Effekt an.

Ci <1zeigt einen synergistischen Effekt an.

 

1.7 Datenanalyse

Alle Daten wurden als ausgedrückt als"Mittelwert ± Standardabweichung (x̄ ± s)"und Diskussionen basierten auf den Mittelwerten.

Die statistische Analyse wurde verwendetGraphPad Prism 9.5. 0. Einweg-ANOVA (Varianzanalyse) wurde für Vergleiche zwischen mehreren Gruppen verwendet. AP-Wert <0. 05wurde als statistisch signifikant angesehen.