Der aktuelle Stand der Neuroprotektion bei angeborenen Herzfehlern Teil 1

Abstrakt:

Das Vorhandensein ektopischer DNA im Zytoplasma führt zu Entzündungen und Zelltod. Es wurde weithin berichtet, dass das Austreten von Kern-DNA in das Zytoplasma hauptsächlich durch die cyclische GMP-AMP-Synthase (cGAS) erkannt werden kann.

DNA ist das Molekül, das die genetische Information jedes Menschen spezifiziert und in jeder unserer Zellen vorkommt. Neuere Forschungen zeigen, dass DNA über bestimmte Wege in das Zytoplasma gelangen und unser Gedächtnis beeinträchtigen kann.

Dieses Phänomen tritt häufig bei älteren Erwachsenen und Menschen mit kognitiven Beeinträchtigungen auf. Wenn DNA in das Zytoplasma gelangt, stört sie die normalen Funktionen innerhalb der Zelle und erhöht das Risiko von Gedächtnisverlust und kognitiven Beeinträchtigungen.

Allerdings müssen wir uns darüber nicht deprimiert und hoffnungslos fühlen. Es gibt viele Möglichkeiten, das Gedächtnis und die kognitiven Fähigkeiten zu verbessern und uns dabei zu helfen, ein gesundes Gehirn zu erhalten.

Erstens müssen Sie einen gesunden Lebensstil pflegen. Dazu gehören eine ausgewogene Ernährung, ausreichend Schlaf, mäßige Bewegung und Stressabbau. Diese Praktiken fördern die Gesundheit des Gehirns, verhindern so den Verlust von DNA und verbessern das Gedächtnis.

Zweitens ist kognitives Training erforderlich. Dazu kann das Spielen von Mathe-Spielen, Lesen, das Erlernen neuer Fähigkeiten usw. gehören. Diese Aktivitäten können dazu beitragen, das Gehirn zu stimulieren und die Neurogenese zu fördern, um ein Austreten von DNA zu verhindern.

Behalten Sie schließlich eine positive Einstellung. Emotionale Instabilität und übermäßiger Stress können zu Veränderungen in der Gehirnchemie führen, die das Austreten von DNA begünstigen. Deshalb müssen wir lernen, den Herausforderungen des Lebens positiv zu begegnen und eine optimistische Einstellung zu bewahren.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich das Eindringen von DNA in das Zytoplasma zwar auf das Gedächtnis auswirken kann, wir aber die Gesundheit unseres Gehirns verbessern, DNA-Leckagen vermeiden und letztendlich unser Gedächtnis verbessern können, indem wir den richtigen Lebensstil annehmen, kognitives Training betreiben und eine positive Einstellung bewahren. Gedächtnis und kognitive Fähigkeiten. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola ein traditionelles chinesisches Arzneimittel ist, das viele einzigartige Wirkungen hat, darunter die Verbesserung des Gedächtnisses. Die Wirksamkeit von Cistanche deserticola beruht auf den zahlreichen darin enthaltenen Wirkstoffen, darunter Gerbsäure, Polysaccharide, Flavonoidglykoside usw. Diese Inhaltsstoffe können die Gesundheit des Gehirns auf verschiedene Weise fördern.

Klicken Sie auf 10 Möglichkeiten zur Verbesserung des Gedächtnisses

Wir haben kürzlich berichtet, dass aus Mitochondrien stammende zytoplasmatische doppelsträngige DNA (dsDNA), die dem lysosomalen Abbau entgangen ist, in kultivierten Zellen und in vivo eine erhebliche Zytotoxizität hervorruft. Es wird angenommen, dass zytoplasmatische mitochondriale DNA an verschiedenen Krankheiten und Störungen beteiligt ist, und es wurden immer mehr Veröffentlichungen veröffentlicht, die dies bestätigen. Andererseits ist die derzeitige Methode zur Bewertung mitochondrialer DNA im Zytoplasma möglicherweise nicht quantitativ.

Hier stellen wir detailliert eine Methode zur Bewertung ektopischer mitochondrialer DNA-Zellen vor. Diese Methode ist sowohl in der Grundlagenforschung als auch bei der Erforschung des Alterns, der Parkinson-Krankheit, der Alzheimer-Krankheit, Herzinsuffizienz, Autoimmunerkrankungen, Krebs und anderen Erkrankungen nützlich.

Schlüsselwörter: ektopische DNA; mitochondriale DNA; Mitochondrialer Transkriptionsfaktor A (TFAM); Parkinson-Krankheit.

1. Einleitung

DNA enthält wichtige Informationen für das Überleben und die Vererbung und muss vor verschiedenen Stressfaktoren, einschließlich Oxidationsmitteln und Mutagenen, geschützt werden. Eukaryontische Zellen enthalten Mitochondrien, die zusammen mit vielen aktiven Sauerstoffspezies durch aerobe Atmung Energie produzieren.

Daher liegt in der eukaryotischen Zelle DNA im Zellkern oder in den Mitochondrien vor, verpackt in der Kernmembran bzw. der Mitochondrienmembran. Allerdings kann DNA unter bestimmten Bedingungen, beispielsweise bei viralen oder nicht-viralen Infektionen, im Zytoplasma vorhanden sein [1– 4].

Selbst bei einigen nichtinfektiösen Erkrankungen (z. B. Alterung oder verschiedenen altersbedingten Erkrankungen oder Krebs) kann DNA aus dem Zellkern oder den Mitochondrien in das Zytoplasma gelangen [5–7].

DNA im Zytoplasma kann entzündlich und toxisch für Zellen sein. Es wurde weithin berichtet, dass das Austreten von Kern-DNA in das Zytoplasma Entzündungen, Zytotoxizität und den Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) induziert, hauptsächlich über den zyklischen GMP-AMP-Synthase (cGAS)-Stimulator der Interferon-Gene (STING)-Signalweg [ 5,6].

Wir haben kürzlich berichtet, dass zytosolische doppelsträngige DNA (dsDNA) mitochondrialen Ursprungs, die dem lysosomalen Abbau entgeht, in zellulären Modellen der Parkinson-Krankheit nachweislich Zytotoxizität und Neurodegeneration induziert [8]. Das Vorhandensein oder die Zunahme solcher ektopischer DNA wurde oft durch repräsentative mikroskopische Bilder und Indizienbeweise angezeigt, nicht durch die Zunahme des DNA-Austritts selbst.

Es wird erwartet, dass die Auswertung dieser ektopischen DNA immer wichtiger wird, nicht nur für die Grundlagenforschung, sondern auch für die Erforschung des Alterns und anderer Krankheiten wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, amyotropher Lateralsklerose, Herzinsuffizienz, Autoimmunerkrankungen, Diabetes, nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH) und Krebs. Es wurde berichtet, dass der cGAS-STING-Weg nicht nur für das Altern, sondern auch für die Pathogenese dieser Krankheiten von entscheidender Bedeutung ist [8–17].

Wahrscheinlich aufgrund der oxidativen Umstände rund um die Mitochondrien und des Fehlens eines effizienten DNA-Reparatursystems für mitochondriale DNA ist mitochondriale DNA viel anfälliger für Mutationen oder Schäden als nukleare DNA [18,19].

Im Gegensatz zur Kern-DNA liegt mitochondriale DNA in mehreren Kopien in einer einzelnen Zelle vor und wird nach Bedarf synthetisiert. Daher ist die Wahrscheinlichkeit, dass mitochondriale DNA im Laufe des Alterns oder bei bösartigen Erkrankungen wie altersbedingten Störungen oder mitochondrialer Dysfunktion in das Zytoplasma gelangt, viel größer oder Krebserkrankungen.

Der Nachweis und die Messung solcher zytoplasmatisch-mitochondrialer DNA könnten für das Verständnis der Pathogenese verschiedener Krankheiten und des Alterns wichtig sein und könnten zu einem Biomarker und therapeutischen Ziel werden.

Wir haben eine semiquantitative Methode entwickelt, um ektopische mitochondriale DNA zu bewerten, die in das Zytoplasma gelangt, und hier beschreiben wir die Methode im Detail. Dieses Papier ermöglicht eine objektive Bewertung des mitochondrialen DNA-Lecks und ist nützlich bei der Untersuchung verschiedener Krankheitspathologien.

2. Materialien und Methoden

2.1. Zelllinien, siRNA-Behandlung und quantitative PCR (qPCR)-Analyse

HeLa-Zellen wurden aus Gebärmutterhalskrebszellen einer Patientin abgeleitet (ATCC,CCL-2). HeLa-Zellen wurden bei 37 °C unter 5 % CO2 in Dulbeccos Modified EagleMedium (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japan) kultiviert, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Biowest, Nuaillé, Frankreich) und einer Penicillin-Streptomycin-Lösung ( 100 Einheiten/mlPenicillin G und 100 µg/ml Streptomycinsulfat, Wako, Osaka, Japan).

Einen Tag vor der Transfektion wurden HeLa-Zellen mit einer Dichte von 600 Zellen/µL ausplattiert. Die Expression interessierender Gene wurde in HeLa-Zellen unter Verwendung von Stealth-RNAi-siRNA (mitochondrialer Transkriptionsfaktor A, TFAM: HSS144251, Glucocerebrosidase, GBA: HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) in Lipofectamine RNAiMAX-Transfektionsreagenz (ThermoFisher Scientific) zum Schweigen gebracht den Anweisungen des Herstellers (eine endgültige RNA-Konzentration von 10 nM).

Drei Tage nach dem siRNA-Knockdown wurde die gesamte zelluläre RNA unter Verwendung von TRIzolreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers (Thermo Fisher Scientific) isoliert. Die cDNA-Vorlagen wurden aus der gereinigten RNA unter Verwendung des ProtoScript II First StrandcDNA Synthesis Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) mit Oligo (dT)20-Primern synthetisiert. qPCR wurde unter Verwendung von TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu) durchgeführt , Japan) und in einem Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio) analysiert. Die in der vorliegenden Studie verwendeten PCR-Primer waren GBA vorwärts (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA rückwärts (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM vorwärts (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM rückwärts (GCATCTGGGTTCTGAGCTTTA), Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) vorwärts (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) und GAPDH umgekehrt (TGTGGTCATGAGTCCTTCCA).

Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Softwareversion 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Zweiseitige Student-T-Tests wurden verwendet, um arithmetische Mittelwerte zwischen zwei Gruppen zu vergleichen. Die Daten werden als Mittelwerte und ± Standardfehler der Mittelwerte dargestellt.

2.2. Immunfluoreszenzdetektion ektopischer mitochondrialer DNA und Bildanalyse

Einen Tag vor der Transfektion wurden HeLa-Zellen mit einer Dichte von 600 Zellen/µL ausplattiert. Die Expression von Genen von Interesse wurde in HeLa-Zellen unter Verwendung von Stealth RNAi siRNA (Thermo Fisher Scientific) in Lipofectamine RNAiMAX Transfektionsreagenz (ThermoFisher Scientific) gemäß der Richtlinie zum Schweigen gebracht Herstelleranweisungen (eine endgültige RNA-Konzentration von 10 nM).

Drei Tage nach dem siRNA-Knockdown wurden die Zellen einer Immunfluoreszenzfärbung unterzogen. Zum Nachweis mitochondrialer DNA, Anti-dsDNA-Antikörper (Abcam, Cambridge, UK, Klon 35I9, Cat# ab27156, RRID: AB_470907 oder EMD Millipore, Billerica, MA, USA, Klon AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID: AB_11213573) zeigte ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis als Hoechst 33258, DAPI oder Picogreen. Hier haben wir drei Primärantikörper kombiniert: Anti-dsDNA-Antikörper (35I9-DNA) (Abcam, Kat.-Nr. ab27156, RRID: AB_470907), Anti-Histon-H2B-Antikörper (Abcam, Kat.-Nr. ab134211) und Anti-Hitze- Shock-Protein-60 (Hsp60)-Antikörper (Abcam, Cat# ab46798, RRID: AB_881444).

Andere Antikörper können ausgewählt oder mit Histon fluoreszierend markiert werden, oder Hsp60 kann alternativ verwendet werden, aber es ist notwendig, die Bedingungen der Dreifachfärbung für jede Kombination zu optimieren.

Die Zellen wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und mit eiskaltem Methanol für 1 0 Min. bei 4 °C fixiert. Alternativ kann 4 % Paraformaldehyd (PFA) zur Fixierung verwendet werden, aber die Hintergrundsignale scheinen zu verschwinden in PFA-fixierten Proben viel größer. Nach der Fixierung wurden die Zellen dreimal jeweils 5 Minuten lang mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit Tween 20 (PBST) gewaschen. Die Zellen wurden mit PBS, das 0,2 % (w/v) Triton X-100 enthielt, 10 Minuten lang permeabilisiert.

Nach dreimaligem Waschen mit PBST für jeweils 5 Minuten wurden die Zellen 30 Minuten lang mit 2 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBST inkubiert. Die Zellen wurden mit einem einzelnen Primärantikörper, einem Anti-Histon-H2B-Antikörper (1/400, Abcam, Kat.-Nr. ab134211), verdünnt in 2 % (w/v) BSA in PBST O/N, bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBST für jeweils 5 Minuten wurden die Zellen mit Alexa Fluor 488-AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY(IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) verdünnt in 2 % (w/v) BSA in PBST für 1 Stunde bei Raumtemperatur (RT).

Nach dreimaligem Waschen für jeweils 5 Minuten mit PBST wurden die Zellen mit Primärantikörpern und Anti-dsDNA-Antikörper (35I9-DNA) (1/800, Abcam, Kat.-Nr. ab27156, RRID: AB_470907) und Anti-dsDNA-Antikörper inkubiert -Hsp60-Antikörper (1/400, Abcam, Kat.-Nr. ab46798, RRID: AB_881444), verdünnt in 2 % (w/v) BSA in PBST, wurden 1 Stunde lang bei RT oder über Nacht (O/N) angewendet 4◦C.

Nach dreimaligem Waschen mit PBST für jeweils 5 Minuten wurden die Zellen mit stark kreuzadsorbiertem Alexa Fluor 680-konjugiertem Donkey-Anti-Kaninchen-IgG(H+L) (1/200, Thermo Fisher Scientific, Kat.-Nr. A10043) inkubiert , RRID: AB_2534018) ​​und Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID: AB_2732073), verdünnt in 2 % (w/v) BSA in PBST für 1 Stunde bei RT.

Die Zellen wurden dreimal jeweils 5 Minuten lang mit PBST gewaschen und die Probe mit einem konfokalen A1R+-Mikroskop (Nikon, Tokio, Japan) analysiert.

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