Abstrakt

Hintergrund: Es wurde berichtet, dass Gelée Royale die Melaninsynthese reduzieren und die Expression von Proteinen und Genen, die mit der Melanogenese in Zusammenhang stehen, hemmen würde. In dieser Studie bewerten wir die antimelanogene und depigmentierende Aktivität von 10-Hydroxy-2-decansäure (10-HDA) aus dem Gelée Royale von Apis mellifera.

Einige Studien deuten darauf hinCistanchekann helfen, der Hautalterung vorzubeugenReduzierung von oxidativem StressUndEntzündung, beides kann dazu beitragenFalten, dunkle Fleckenund andere Zeichen des Alterns. Es ist jedoch unklar, obCistanchedürfendie Haut aufhellenoderPigmentierung reduzieren. Kurz gesagt: Obwohl Cistanche positive Auswirkungen auf die Haut haben kann, ist nicht klar, ob es zuverlässig angewendet werden kannHautaufhellungAgent. Es ist immer am besten, einen Dermatologen zu konsultieren, um sich über sichere und wirksame Methoden zur Pflege Ihrer Haut beraten zu lassen.

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Methoden:In dieser Studie bewerten wir die {{0}}HDA-Aufhellungsaktivität im Vergleich zu den Veränderungen der intrazellulären Tyrosinaseaktivität, des Melaningehalts und der mit der Melaninproduktion verbundenen Proteinspiegel in B16F1-Melanomzellen nach der Behandlung mit {{4 }}HDA. Darüber hinaus wurde der hautaufhellende Effekt bewertet, indem ein Cremeprodukt mit 0,5 Prozent, 1 Prozent und 2 Prozent 10-HDA drei Wochen lang auf die Haut von Mäusen (C57BL/6 J) aufgetragen wurde, um die Wirkung von DL zu beobachten *-Werte.

Ergebnisse:Die Ergebnisse zeigten, dass 10-HDA die MITF-Proteinexpression (IC50 0.86 mM) in B16F1-Melanomzellen hemmte. Die Western-Blot-Analyse ergab, dass 10-HDA die Aktivität von Tyrosinase und die Expression von Tyrosinase-verwandtem Protein 1 (TRP-1), TRP-2 und dem Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor (MITF) hemmte. in B16F1-Melanomzellen. Darüber hinaus zeigt das auf die Haut von Mäusen aufgetragene 10-HDA einen deutlich erhöhten durchschnittlichen Hautaufhellungsindex (L-Wert).

Schlussfolgerungen:Die Validierungsdaten zeigten das Potenzial von 10-HDA zur Unterdrückung der Hautpigmentierung. Das 10-HDA wird als Kandidat zur Hemmung der Melanogenese vorgeschlagen und könnte daher als kosmetisches Hautpflegeprodukt entwickelt werden.

Schlüsselwörter:Gelée Royale, 10-Hydroxy-2-decansäure, Melanogenese, Hautaufhellung, Melanogenese-Hemmer

Hintergrund

Gelée Royale (RJ) ist ein Sekret einer jungen Arbeitsbiene (Apis mellifera), das von den Hypopharyngeal- und Unterkieferdrüsen produziert wird. Die sich entwickelnde Bienenkönigin wurde ihr ganzes Leben lang ausschließlich damit gefüttert [1]. RJ bietet aufgrund der reichlichen Mengen an Proteinen, freien Aminosäuren, Lipiden, Vitaminen und Zuckern einen hohen Nährwert [2, 3]. Die bioaktiven Proteine ​​von RJ sind die wichtigsten Gelée Royale-Proteine ​​(MRJPs), Apisimin und Royalizing, die in mehreren Studien immunregulatorische und antibakterielle Wirkungen gezeigt haben [4–6]. 10-Hydroxy-2--Decansäure (10-HDA) war die Hauptfettsäure in RJ, die mehrere gesundheitsfördernde Wirkungen für den Menschen besitzt und antitumorale, antibakterielle und immunmodulatorische Aktivitäten gezeigt hat [7 –9]. 10-HDA kommt nur in RJ vor und wurde daher als Qualitätsindikator für Gelée Royale-Produkte verwendet [10, 11]. Mehrere pharmakologische Aktivitäten von RJ wurden bereits durch Tierversuche bestätigt, und die pharmakologischen Aktivitäten umfassen Antioxidation [12, 13], Entzündungshemmung [14], Antitumor [15, 16] und Antiagenese [17]. antibakterielle [18–20], gefäßerweiternde [21, 22], hypertensive [21, 22], antihypercholesterinämische [23], nephroprotektive [24] und hautaufhellende Wirkungen [25]. Aufgrund seines Nährwerts und seines Nutzens für die menschliche Gesundheit sind auf den Märkten immer mehr kommerzielle RJ-Produkte erhältlich.

Die Hautfarbe von Tieren und Menschen hängt vom Gehalt an Melaninpigmenten in der Haut ab. Die Rolle von Melanin besteht darin, die Haut vor Schäden durch UV-Licht zu schützen. Eine übermäßige Ansammlung von Melanin führt jedoch zu schwerwiegenden Hauterkrankungen wie Verfärbungen und Pigmentierung sowie zu beschleunigter Hautalterung [26]. Melanin wurde in den Melanozyten in der innersten Schicht der Epidermis über Melanogenesemechanismen synthetisiert [27]. Melanogenese ist ein komplexer Biosyntheseweg, der durch Tyrosinase, die Tyrosinase-verwandten Proteine ​​1 und 2 (TRP-1 und TRP-2) und den Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktor (MITF) gesteuert wird (28, 29). Tyrosinase ist ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym zur Steuerung der Melaninsynthese. Der erste Schritt der Melaninproduktion ist die Hydroxylierung von L-Tyrosin zu L-3,4-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA) und die Umwandlung von L-DOPA in Dopaquinon [30]. TRP-2 katalysiert die Produktion von 5,6--Dihydroxyindolcarbonsäure, umgewandelt aus Dopachrom, und das Produkt von TRP-2, 5,6--Dihydroxyindolcarbonsäure als Substrat für TRP-1 wird in Indol-5,6-Chinoncarbonsäure umgewandelt, was letztendlich zur Melaninsynthese führt [31, 32]. Die Hemmung der Melaninsynthese durch Störung der Melanogenese wäre der wichtigste Weg, um hyperpigmentierte Erkrankungen wie Melasma und Altersflecken zu verhindern oder zu verbessern. Daher wäre die Suche nach einer potenziellen, sicheren und wirksamen Verbindung zur Herunterregulierung dieser Faktoren bei der Melanogenese in der medizinischen und kosmetischen Industrie von großer Bedeutung [25, 33, 34].

Es wurde gezeigt, dass Gelée Royale die Melaninsynthese reduzieren könnte [22], aber der Hauptwirkstoff oder der Mechanismus, der diesen Aktivitäten von RJ zugrunde liegt, ist unbekannt. In unserer vorherigen Studie haben wir herausgefunden, dass 10-HDA die Tyrosinase-Aktivität hemmen kann (unveröffentlichte Daten). In dieser Studie wurde die hemmende Wirkung von 10-HDA auf Tyrosinase weiter untersucht. In-vitro-Modelle zur Melaninbiosynthese unter Verwendung einer B16F10-Melanomzellkultur und ein Tiermodell einer Maus mit Hautanwendung wurden beide durchgeführt, um die melanogenesehemmende Wirkung von 10-HDA zu untersuchen.

Methoden

Zubereitung von 10-HDA aus Gelée Royale

Gelée Royale wurde von Fu-Chang Beekeeping in Hualien, Taiwan, hergestellt. Larven im Alter von 3-Tagen wurden in Königinnenzellenbecher auf den Rahmen überführt, und jeder Rahmen enthielt 30 Königinnenbecher. Die Rahmen wurden in Bienenstöcke überführt und der RJ wurde 72 Stunden nach dem Übertragen der Larven gesammelt. Jeder Bienenstock enthält etwa 25.000 Honigbienen [35]. Die gesammelten RJ-Proben wurden bis zur weiteren Analyse bei −20 Grad aufbewahrt. Gelée Royale (40 g) wurde mit Methanol (400 ml × 4 × 30 Min.) unter Rückfluss erhitzt und der Überstand durch 30-minütige Zentrifugation bei 4500 xg geerntet. Der Überstand wurde unter reduziertem Druck konzentriert, um den Rohextrakt (10,76 g) mit der Bezeichnung RJM zu erhalten. In Methanol suspendiertes RJM wurde durch Kieselgel-Säulenchromatographie (SiO2 CC) gereinigt und dann mit Chloroform- und Methanol-Gradienten (300:1 bis 1:1) eluiert, um zehn durch TLC analysierte Fraktionen zu erhalten. Die Fraktionen 4 und 5 zeigten deutliche Flecken und wurden daher einer weiteren Reinigung und Analyse unterzogen. Die Fraktionen 4 und 5 wurden wiederholt mit SiO2 CC gereinigt (eluiert mit Chloroform/Methanol, 300:1 bis 1:1) und weiter mit Aceton kristallisiert, um 10-Hydroxy-2-decansäure ({{32}) zu erhalten. } HDA). Die chemische Struktur des gereinigten Produkts wurde durch NMR- und GC-Massenspektrenanalyse bestätigt. Die quantitative 10-HDA-Analyse wurde durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einem Waters 1525-Pumpsystem, ausgestattet mit einem Water 2489-Detektor, einer RP-8 GP250-Säule (4,6 mm) und einem Waters 717plus Autosampler. Die mobile Phase war eine Methanollösung (60:40 v/v mit hochreinem und entionisiertem Wasser), die mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,5 eingestellt, durch eine Membran (0,45 μm) filtriert und 5 Minuten lang entgast wurde. Die Flussrate der mobilen Phase wurde auf 1,0 ml/min eingestellt und die Detektion wurde bei 225 nm durchgeführt. Der Gehalt an 10HDA in der endgültigen gereinigten Probe beträgt 90 Prozent und wird für die weitere Analyse verwendet.

Zellkultur und 10-HDA-Behandlungen

B16F10-Melanomzellen (BCRC-Nummer: 60.031) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 Prozent (v/v) fötalem Rinderserum, bei 37 Grad in einem befeuchteten, CO2-kontrollierten (5 Prozent) Inkubator kultiviert . Die Zellen wurden mit einer geeigneten Zelldichte in ein 24-Well oder eine 6-Well-Platte ausgesät. Nach 1 Tag Inkubation wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von 10-HDA behandelt. Das Medium wurde in der Kontrollgruppe anstelle von 10-HDA verwendet. Anschließend wurden die Zellen geerntet und für verschiedene Tests verwendet.

Messung der Zelllebensfähigkeit

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch den {{0}}(4,5-Dimethylthiazol-2- yl)-2,5 -Diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-Assay gemäß gemessen Methode beschrieben von Carmichael et al. [36]. B16F10-Melanomzellen wurden in DMEM mit 10 Prozent FBS und 1 Prozent L-Glutamin (4 mM) in einem Inkubator mit 5 Prozent CO2 bei 37 Grad kultiviert. Kultivierte Zellen (1 × 104 Zellen/Vertiefung) wurden in eine 96-Vertiefungsplatte, 10-HDA (gelöst in Dimethylsulfoxid (DMSO)) ausgesät, verdünnt mit dem Medium in einer Konzentration von 1, 0,5, 0,1 mM und 1 mM Kojisäure wurden in die Vertiefungen gegeben. Das Medium wurde als Rohling verwendet. Nach 24-stündiger Inkubation bei 37 Grad unter 5 Prozent CO2 wurde das Medium aus jeder Vertiefung entfernt, dann wurden die Vertiefungen zweimal mit PBS (1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung) gewaschen. In jede Vertiefung wurden 200 μl MTT-Lösung (2 mg/ml) gegeben. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 100 μl DMSO nach 4-stündiger Inkubation beendet. Die Absorption jeder Vertiefung wurde bei 540 nm mit einem Immunoassay-Lesegerät (BIO-TEK, Winooski, VT) gemessen [20–23]. Die Zelllebensfähigkeit wurde durch die folgende Gleichung bestimmt: Zelllebensfähigkeit (Prozent)=[(AB)/C] × 100 Prozent, A: Probenabsorptionsvolumen, B: Blindabsorptionsvolumen, C: Kontrollabsorptionsvolumen.

Messung des zellulären Melaningehalts

Der intrazelluläre Melaningehalt von B16F10-Melanomzellen wurde mit der von Bilodeau et al. beschriebenen modifizierten Methode gemessen [37]. Am Ende der Kultivierung der B16F10-Melanomzellen wurden die Zellen geerntet und mit PBS gewaschen. Die geernteten Zellen wurden in kaltem Lysepuffer (20 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1 Prozent Triton X-100, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)) lysiert. Nach 30-minütiger Zentrifugation bei 15,000×g wurden die Pellets 1 Stunde lang bei 60 Grad in 1 N NaOH mit 20 Prozent DMSO gelöst. Der Proteingehalt im Überstand wurde mit dem Bradford-Assay bestimmt. Die Absorption bei 405 nm wurde gemessen und der Melaningehalt anhand eines bekannten Standards an synthetischem Melanin berechnet. Melaninspiegel (Prozent)=[(AB)/ C] × 100 Prozent; A: Absorptionsvolumen der Probe; B: Leerabsorptionsvolumen; C: Absorptionsvolumen kontrollieren.

Messung der zellulären Tyrosinase-Aktivität

Ein Tyrosinase-Aktivitätstest wurde gemäß der zuvor von Martinez-Esparza et al. [38] beschriebenen Methode mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt. B16F10-Melanomzellen wurden in 20 mM Natriumphosphat (pH 6,8), 1 Prozent Triton Der Proteingehalt jedes Überstands wurde mithilfe des Bradford-Assays mit Rinderserumalbumin (BSA) als Proteinstandard bestimmt. Die Tyrosinase-Aktivität wurde in einem Reaktionsgemisch (1 ml) bestimmt, das 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,8), 2 mM L DOPA und 300 µg überstehende Proteine ​​enthielt. Nach 15-minütiger Inkubation bei 37 Grad wurde die Absorption bei 475 nm mit einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen. Tyrosinase-Aktivität (Prozent)=[(AB)/C] × 100 Prozent; A: Absorptionsvolumen der Probe; B: Leerabsorptionsvolumen; C: Absorptionsvolumen kontrollieren.

Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden dreimal in eiskaltem PBS gewaschen und in RIPA-Puffer (pH 7,4, 50 mM Tris, 0,1 Prozent SDS, 50 mM NaCl, 1 Prozent NP-40, 1 mM PMSF, 10 µg/ml Aprotinin und 10 µg/ml Leupeptin). Ein Aliquot des Lysats wurde zur Bestimmung des Proteingehalts mit der Methode des Bradford-Assays unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard verwendet. Die Proteine ​​(40 µg) wurden durch 10-prozentige SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine Hybond-C Extra-Nitrozellulosemembran (Amersham Bioscience, UK) geblottet. Die Membranen wurden mit 5 Prozent fettfreier Milch in Tris-Puffer-Salzlösung (TBS), die 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 150 mM NaCl enthielt, 30 Minuten lang blockiert. MITF, Tyrosinase, Dopachrom-Tautomerase 2 (TRP-2), TRP-1 und -Actin (als interne Kontrolle) wurden jeweils unter Verwendung polyklonaler Kaninchen-Antikörper nachgewiesen. Die Membranen wurden weiter mit polyklonalen Ziegen-Sekundärantikörpern gegen Kaninchen-IgG-H&L (HRP) inkubiert. Alle gebundenen Antikörper wurden dann mit Super Signal® West Pico Chemiluminescent Substrate (ECL) (Thermo Scientific) nachgewiesen. Die Signalintensität jeder Bande wurde mit einem Densitometersystem Gel Doc TM / Chemi Doc TM Universal Hood II (Bio-Rad), ausgestattet mit einem Integrator, quantifiziert und mit der der internen Kontrolle normalisiert.

Bestimmung der depigmentierenden Aktivität bei Mäusen

Die Depigmentierungsaktivität wurde über das Mausmodellsystem nach dem modifizierten Protokoll von Tai et al. getestet. [39]. Die Studie wurde von der Ethikkommission der National Formosa University genehmigt (Genehmigungsnummer: 10,401). Fünf Wochen alte weibliche schwarze Mäuse (C57BL/6 J) mit einem Gewicht von 20 bis 25 g wurden vom National Animal Laboratory Center, Taipei, gekauft. Während aller Experimente wurden die Tiere in einem klimatisierten Raum mit konstanter Temperatur (25 Grad ± 2 Grad) gehalten und in einem 12-Stunden-Licht-Dunkel-Zyklus gehalten. Die Tiere wurden vor dem Experiment 7 Tage lang akklimatisiert. Nach dem Rasieren der Haare erhielten die Tiere 1-Tage Ruhe. Gelproben, die 10-HDA enthielten, wurden durch Dispergieren der Arzneimittel in Vaseline hergestellt. Insgesamt vierzig Mäuse wurden gleichmäßig in fünf Gruppen aufgeteilt und jede Gruppe wurde zweimal täglich mit 0,1 g Vaseline (Kontrolle), 1 Prozent Kojisäure in Vaseline, 0,5 Prozent, 1 Prozent oder 2 Prozent 10-HDA in Vaseline bestrichen . Die Anwendungen wurden drei Wochen lang fortgesetzt und der Hautaufhellungsindex (L-Wert) wurde jeden Tag auf derselben Hautfläche mit einem DermaLab® Combo (Cotex Technology, Dänemark) gemessen, einem kolorimetrischen Instrument, das ein hochintensives Weiß verwendet LED als Lichtquelle. Das kolorimetrische Gerät ist an einen Computer angeschlossen [40]. Wir haben nur den L-Parameter berücksichtigt und der L-Wert war die relative Helligkeit, die von totalem Schwarz (L=0) bis totalem Weiß (L=100) reichte. Der anfängliche Hautaufhellungsindex L-Wert wurde an der Haut jeder Maus bestimmt, bevor die getesteten Substanzen aufgetragen wurden.

statistische Analyse

Alle Ergebnisse dieser Studie wurden unter Verwendung des allgemeinen linearen Modellverfahrens analysiert, das im Statistical Analysis System-Softwarepaket Version 9.1 (Statistical Analysis System Institute, 2002) verfügbar ist. Duncans Multiple-Range-Test [41] wurde verwendet, um Unterschiede zwischen den Mittelwerten der Behandlungen festzustellen. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Ergebnisse

Wirkung von 10-HDA auf die Lebensfähigkeit von B16F1-Melanomzellen

Die optimale Dosis aus dem Zelllebensfähigkeitstest durch MTT in B16F1-Melanomzellen ist in Abb. 1 dargestellt. Es zeigte sich deutlich, dass 10-HDA bei Konzentrationen von 0,1 nicht zytotoxisch für B16F1-Melanomzellen war. {8}},5 und 1 mM, und Kojisäure war in einer Konzentration von 1 mM für Melanomzellen nicht zytotoxisch. Die Lebensfähigkeit der Zellen nahm bei Melanomzellen, die 1,5 mM 10-HDA ausgesetzt waren, signifikant ab (20 Prozent Reduktion) (P < 0.05) (Daten nicht gezeigt) und 5 mM Kojisäure. Daher wurden in nachfolgenden Experimenten Konzentrationen von 0,1, 0,5, 1 mM 10-HDA und 1 mM Kojisäure angewendet.

Hemmung der Tyrosinaseaktivität und Melaninsynthese in B16F10-Melanomzellen durch 10-HDA

Kojisäure ist ein wirksames und bekanntes Mittel gegen Melanogenese und wurde in dieser Studie als Positivkontrolle verwendet. 10-HDA unterdrückte die Melaninsynthese und Tyrosinaseaktivität im Vergleich zur Kontrolle der unbehandelten B16F1-Melanomzellen signifikant (p < 0.05). Bei einer Dosis von 1 mM induzierte 10- HDA eine Verringerung der zellulären Tyrosinaseaktivität um 28 ± 2,4 Prozent (P < 0.01) und 40.4 ± 3 .0 Prozent Reduktion der zellulären Melaninsynthese (P < 0,001), während Kojisäure (1 mM) auch die Tyrosinaseaktivität und die Melaninsynthese signifikant um 14,4 ± 3,7 Prozent (P < 0,05) und 19,3 ± 1,5 Prozent (P) reduzierte < 0,001) (Abb. 2 und 3).

Unterdrückung der Tyrosinase-, TRP-1- und TRP{1}}-Proteinexpression in B16F10-Melanomzellen durch 10-HDA

Um zu untersuchen, ob 10-HDA die melanogene Proteinexpression beeinflussen kann, wurde eine Western-Blot-Analyse unter Verwendung des Lysats von B16F10-Melanomzellen durchgeführt, die mit 10-HDA behandelt wurden (Abb. 4). Das 10-HDA hemmte die Tyrosinase-, TRP-1- und TRP{7}}-Expression in B16F1-Melanomzellen im Vergleich zu denen der unbehandelten Zellen dramatisch (Abb. 4b – d). Das -Actin, ein Haushaltsprotein, das als interne Kontrolle verwendet wurde, zeigte keine Veränderung. Das 10-HDA hemmte die Proteinexpressionsniveaus melanogener Enzyme ähnlich wie Kojisäure.

Hemmende Wirkung des 10-HDA auf die Proteinebene im Zusammenhang mit melanogenen Faktoren in den B16F10-Zellen

Während des Prozesses der Melanogenese in Säugetierzellen spielt MITF die wichtigste regulatorische Rolle bei der Synthese des TRP-Signalwegs, einschließlich TYR, TRP{{0}} und TRP-2 [25, 26]. Die Wirkung des 10-HDA auf die MITF-Expression wurde mittels Western Blot bewertet. B16F1{{10}}-Melanomzellen wurden verschiedenen Konzentrationen von 10- HDA (0,1, 0,5 und 1 mM) ausgesetzt, was zu einer Herunterregulierung der MITF-Expression durch 10-HAD führte ( Abb. 4e). Der IC50-Wert für die 10-HDA-Unterdrückung der MITF-Expression wurde auf 0,86 mM geschätzt. Die vorliegenden Ergebnisse legen nahe, dass die MITF-Proteinspiegel durch die 10-HDA reduziert werden. Der Hypopigmentierungseffekt des 10-HDA könnte das Ergebnis einer herunterregulierten MITF-Genexpression sein, die dann die Protein- und Genexpression von Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 unterdrücken würde.

Bewertung der depigmentierenden Aktivität von 10-HDA in vivo an Mäusen

Um über die Dosierung beim Menschen zu spekulieren, verwendeten wir Mäuse als Tiermodell, um die depigmentierende Aktivität von {{0}}HDA zu untersuchen. Nach der Rasur wurden die Mäuse mit 1 Prozent Kojisäure in Vaseline, 0,5 Prozent, 1 Prozent oder 2 Prozent 10-HDA in Vaseline behandelt und der Hautaufhellungsindex wurde gemessen und aufgezeichnet. Für diese In-vivo-Studie verwendeten wir Kojisäure als Positivkontrolle. Kojisäure wird weltweit häufig zur Behandlung von Hautdepigmentierungen eingesetzt. Nach der ersten Behandlungswoche war der Hautaufhellungsgrad bei den mit 10- HDA behandelten Mäusen im Vergleich zur Kontrolle deutlich erhöht, und dieser Anstieg hielt bis zum Ende des Experiments an. Die depigmentierende Aktivität von 0.5, 1 und 2 Prozent 10-HDA war vergleichbar mit der von 1 Prozent Kojisäure. Unsere Ergebnisse zeigten, dass 10-HDA bereits bei einer Konzentration von 0,5 Prozent die Hautaufhellung auf der Haut von Mäusen deutlich fördern konnte (Abb. 5). Daher scheint 10-HDA ein guter Kandidat als Hautaufheller zur Behandlung von Hauthyperpigmentierung zu sein.

Diskussion

Die Melaninsynthese wird durch die komplexe Enzymkaskade aus Tyrosinase, TRP1 und TRP2 gesteuert. Der Grad der Melanogenese-bedingten Gen- und Proteinhemmung spielt eine wichtige Rolle für die Wirksamkeit eines Depigmentierungsmittels, das üblicherweise zur Behandlung von Hyperpigmentierung oder in kosmetischen Produkten eingesetzt wird [28]. Um die tatsächliche hemmende Wirkung von 10-HDA auf die Melanogenese aufzuklären, wurden der Melaningehalt und die intrazelluläre Tyrosinaseaktivität der B16F10-Zellen im gleichen Konzentrationsbereich untersucht. Die Ergebnisse in Abb. 2 und 3 zeigten, dass 10-HDA eine höhere Hemmwirkung auf die Melaninsynthese in B16F10-Zellen aufwies als Kojisäure. Die Daten zeigten, dass 10- HDA die Melanogenese in B16F10-Melanomzellen blockiert.

Die Melanogenese wird in Melanozyten von Säugetieren von mindestens drei regulatorischen Proteinen dominiert, Tyrosinase, TRP1 und TRP2 [29]. Die Expression von TRP-1, TRP-2 und MITF wurde alle in den B16F10-Melanomzellen gehemmt, die mit 10-HDA behandelt wurden. MITF ist ein wichtiger Transkriptionsfaktor zur Regulierung der Expression melanogener Enzyme wie Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2 [42, 43]. Gemäß unseren Western-Blot-Daten (Abb. 4) würden mit 10-HDA behandelte Säugetierzellen die Expression aller geschwindigkeitsbestimmenden Enzyme, einschließlich Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2, reduzieren. und verhindern eine abnormale Ansammlung von Melanin während des Melanogeneseprozesses. Diese Daten legen nahe, dass 10- HDA den Prozess der Melanogenese durch Hemmung der MITF-Expression hemmen könnte. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass 10-HDA die Melanogenese hemmt, indem es die Produktion von MITF-Protein, Tyrosinase und Melanin herunterreguliert. Der Hemmweg von 10-HDA auf die MITF-Expression unterschied sich von dem anderer Melanogenese-Inhibitoren wie Kojisäure, Arbutin und Ascorbinsäure, die keinen Einfluss auf die MITF-Expression hatten [44, 45]. Dies deutet darauf hin, dass 10-HDA ein hervorragendes Potenzial für die Verwendung als sicheres und natürliches Hautaufhellungsmittel für funktionelle Kosmetika hat [46].

Das Melanom, ein Hautkrebs, entsteht durch eine bösartige Veränderung der Melanozyten. Melanome, die in chronisch sonnengeschädigter Haut, Schleimhautoberflächen und Akralhaut auftraten, wurden durch Überaktivierung von BRAF und NRAS [47], Verlust des CDKN2A-Locus [48], Überexpression des MITF [49] und Überaktivierung von Kit [50] verursacht ], mGluR1 überaktivieren [51, 52]… et al. In dieser Studie könnte 10-HDA die MITF-Expression in B16F10-Melanomzellen hemmen. Dies deutete darauf hin, dass 10-HDA das Potenzial hat, der Inhaltsstoff für Hautmedikamente oder Krebsmedikamente gegen Melanome zu sein.

RJ wurde für viele dermatologische Präparate verwendet, darunter zur Hauterfrischung, zur Hautregeneration, zur Verjüngung, zur Heilung von Verbrennungen oder zur Wundheilung [53, 54]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass einige ungesättigte Fettsäuren in RJ die Melaninsynthese und Tyrosinaseaktivität hemmen könnten, was zu einer Herunterregulierung der Melanogenese führt [55], und wir haben gezeigt, dass der Depigmentierungseffekt von RJ das Ergebnis der Anwesenheit von {{3 sein könnte }}HDA. Da die Haut von Mäusen der von Menschen ähnelt, verwendeten wir Mäuse als In-vivo-Tiermodell zur Untersuchung der depigmentierenden Aktivität von 10-HAD. Wie in Abb. 5 gezeigt, war der Hautaufhellungsindex der Hautfarbe bei Mäusen, die mit 10-HAD behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrolle signifikant erhöht. Darüber hinaus haben Koya-Miyata et al. Wir untersuchten die kollagenproduktionsfördernde Aktivität von 10-HDA in Fibroblastenzelllinien, die den transformierenden Wachstumsfaktor - 1 (TGF- 1) produzieren, der ein wichtiger Faktor für die Kollagenproduktion ist [55] . Daher scheint 10-HDA eine sehr vielversprechende natürliche Verbindung zur Hautregeneration und Behandlung von Hyperpigmentierung zu sein.

Abschluss

10-HDA hemmte nicht nur die Tyrosinaseaktivität, sondern auch die melanogenen Enzymexpressionen, einschließlich Tyrosinase, TRP-1 und TRP-2, indem es MITF in den B16F10-Melanomzellen unterdrückte. Infolgedessen war das Pigment Melanin in B16F10-Melanomzellen reduziert. Darüber hinaus zeigte das In-vivo-Tiermodell die depigmentierende Aktivität von 10-HDA bei topischer Anwendung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass 10-HDA einen Kandidaten hat, der ein sicherer und natürlicher Melanogenese-Hemmer für die Kosmetikindustrie sein könnte, wobei die Suche nach einer natürlichen und wirksamen Verbindung eines der sehr wichtigen Ziele für die Entwicklung eines besseren Hautpflegeprodukts ist .

Abkürzungen

10-HDA: 10-Hydroxy-2-decansäure; BSA: Rinderserumalbumin; DMEM: Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium; DMSO: Dimethylsulfoxid; EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure; L-DOPA: L-3,4- Dihydroxyphenylalanin; MITF: Mikrophthalmie-assoziierter Transkriptionsfaktor; MRJP: Hauptproteine ​​des Gelée Royale; MTT: 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid; PBS: phosphatgepufferte Kochsalzlösung; PMSF: Phenylmethansulfonylfluorid oder Phenylmethylsulfonylfluorid; DC: Dünnschichtchromatographie; TRP-1: Tyrosinase-verwandtes Protein 1; TRP- 2: Tyrosinase-verwandtes Protein 2

Danksagungen

Wir danken Frau Li-Yu Lee von Fu-Chang Beekeeping für die Zubereitung von Gelée Royale

Finanzierung

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie, Taiwan, ROC (MOST102–2622-B-150-002-CC2 & MOST 103–2313-B-150 -001 -MY2 bis unterstützt CC Peng).

Verfügbarkeit von Daten und Materialien

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten.

Autorenbeiträge

CCP konzipierte und gestaltete die Experimente. HZS und IPL führten die Experimente durch. CCP und PCK analysierten die Daten. CCP, PCK und JCL steuerten Reagenzien/Materialien/Analysetools bei. CCP und IPL haben das Papier verfasst und überarbeitet. Alle Autoren stimmten der endgültigen Fassung des Manuskripts zu.

Informationen der Autoren

CCP, Doktor der Biotechnologie, außerordentlicher Professor an der Abteilung für Biotechnologie der National Formosa University. HZS, Master in Biotechnologie, Absolvent der Abteilung für Biotechnologie der National Formosa University. IPL, Doktor der Biotechnologie, Manager der Abteilung für Forschung und Entwicklung, Challenge Bioproducts Co., Ltd. PCK, Doktor der Chemie, außerordentlicher Professor der Abteilung für Biotechnologie, National Formosa University. JCL, General Manager bei Honey Bee Town Co., Ltd.

Ethikgenehmigung

Alle Tierversuche wurden von der Ethikkommission der National Formosa University (Genehmigungsnummer: 10.401) genehmigt und entsprachen den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren.

Einwilligung zur Veröffentlichung

Gilt in diesem Abschnitt nicht. Bei diesem Artikel handelt es sich nicht um eine klinische Studie mit menschlichen Teilnehmern und dieses Manuskript enthält keine individuellen klinischen Daten.

Konkurrierende Interessen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben

Anmerkung des Herausgebers

Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Angaben zum Autor

1 Abteilung für Biotechnologie, National Formosa University, Huwei, Yunlin, Taiwan. 2 Abteilung für Forschung und Entwicklung, Challenge Bioproducts Co., Ltd., Douliou, Yunlin, Taiwan. 3 Honey Bee Town Co., Ltd., Nr.77-2 Huaxi, 970 Hualien City, Taiwan.

Eingegangen: 9. März 2017 Angenommen: 21. Juli 2017

Online veröffentlicht: 09. August 2017

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