Die schützende Wirkung von Herba Cistanches auf Statin-induzierte Myotoxizität in vitro
Mar 24, 2022
Kontakt: Audrey Hu WhatsApp/hp: 0086 13880143964 E-Mail:audrey.hu@wecistanche.com
Elaine Wat a,b,1, Chun Fai Ng a,b,1, Chi Man Koon a,b, Eric Chun Wai Wong a,b, Brian Tomlinson c, Clara Bik San Lau a,b,n
ein Institut für Chinesische Medizin, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong
b State Key Laboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hong Kong
c Abteilung für klinische Pharmakologie, Abteilung für Medizin und Therapeutika, The Chinese University of Hong Kong, Shatin, New Territories, Hongkong
Abstrakt:
Ethnopharmakologische Relevanz: KräuterCistanchen(HC,CistancheDeserticola, oderCistancheTubulus) ist ein chinesisches Kraut, das traditionell bei Muskelproblemen eingesetzt wird. Frühere Studien zeigten, dass HC-Extrakt Muskelschäden reduzieren und die ATP-Speicherung bei Ratten nach dem Training verbessern kann. Seine Wirkung auf die Statin-induzierte Muskeltoxizität wurde jedoch nie untersucht.
Ziel:Ziel dieser Studie war es festzustellen, ob der wässrige Extrakt von HC (HCE) die Simvastatin-induzierte Toxizität in L6-Ratten-Skelettmuskelzellen verhindern kann und ob Verbascosid der wichtigste bioaktive Bestandteil ist, der zu den Wirkungen beiträgt
Materialen und Methoden:MTT wurde durchgeführt, um die Wirkungen von HCE ({{0}}–2000 mg/ml) oder Verbascosid (0–160 mM) auf mit Simvastatin (10 mM) behandelte L6-Zellen zu bestimmen. Der Annexin-V-FITC/PI-Apoptose-Assay und der Caspase-3-Assay wurden durchgeführt, um die schützende Rolle von HCE auf den Simvastatin-induzierten Zelltod zu bestimmen und um zu bewerten, ob HCE seine schützende Wirkung über den Caspase-Weg ausübt. Die ATP-Produktion wurde gemessen, um zu untersuchen, ob HCE die Simvastatin-induzierte Reduktion der ATP-Produktion in vitro verhindern könnte.
Ergebnisse:Simvastatin erhöhte signifikant den apoptotischen Zelltod in L6-Zellen. HCE übte eine signifikante dosisabhängige Reduktion auf Simvastatin-induzierte apoptotische Zellen aus, möglicherweise über einen Caspase-3-Weg. Simvastatin reduzierte die ATP-Produktion in L6-Zellen, was dosisabhängig durch HCE verhindert wurde. Es gab nur einen Trend, aber keine signifikante Wirkung (außer bei hoher Dosis) von Verbascosid auf den Schutz vor Simvastatin-induzierter Muskeltoxizität.
Schlussfolgerungen:Zusammenfassend haben wir zum ersten Mal gezeigt, dass HCE eine dosisabhängige Schutzwirkung auf die durch Simvastatin induzierte Toxizität in vitro ausüben kann, was aufgrund des Vorhandenseins von Verbascosid unwahrscheinlich war. Unsere Studie schlug die potenzielle Verwendung von HC in der Situation einer Simvastatin-induzierten Muskeltoxizität vor.
Schlüsselwörter:KräuterCistanchen, StatinCholesterin, Hyperlipidämie, Muskeltoxizität, Verbascosid, Caspase-3
1. Einleitung
HMG-CoA-Reduktase-Hemmer (Statine), die weltweit meistverkaufte verschreibungspflichtige Arzneimittelklasse in der Geschichte, sind gut dokumentiert, um Patienten beiderlei Geschlechts in unterschiedlichem Alter mit mittlerem und hohem Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen (CVD) zu helfen (Golomb und Evans, 2008). Anschließend wurden verschiedene Statine entwickelt und klinisch zugelassen, darunter Pravastatin, Atorvastatin, Fluvastatin, Lovastatin, Pitavastatin, Rosuvastatin und Simvastatin. Im Allgemeinen wirken alle Statine, indem sie die Reduktion von HMG-CoA zu Mevalonsäure während der frühen Phase des Mevalonat-Wegs hemmen, um die Cholesterinproduktion zu reduzieren (Kromer und Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). Obwohl Statine normalerweise gut vertragen werden, ist eine der wichtigsten und bekanntesten klinischen Nebenwirkungen die Skelettmuskeltoxizität (Rhabdomyolyse) (Kobayashi et al., 2008). Anomalien der Skelettmuskulatur können von gutartiger Myalgie bis hin zu schwerer Myopathie reichen. Während eine Vielzahl von Mechanismen vorgeschlagen wird und für die Muskelnebenwirkungen von Statin verantwortlich sein könnte, wird angenommen, dass mitochondriale Mechanismen eine wichtige Rolle spielen (Golomb und Evans, 2008). Mevalonat ist nicht nur ein Vorläufer von Cholesterin, sondern auch für andere Verbindungen, darunter Selenoproteine, Dolichol und Ubichinon (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). Die Fähigkeit von Statinen, Mevalonat zu hemmen, würde daher auch die Produktion von Selenoproteinen wie Glutathionperoxidase (GPx) hemmen, die wichtige Enzyme zur Aufrechterhaltung des antioxidativen Abwehrmechanismus sind (Kromer und Moosmann, 2009). Statine könnten auch zu einer Ubichinon-Verarmung führen, was zu einer Verringerung des Sauerstoffverbrauchs und der ATP-Synthese führt (Beltowski et al., 2009). Darüber hinaus zeigten zunehmende In-vitro- und In-vivo-Studien, dass Statin auch direkt auf Gewebemitochondrien einwirken kann, um dosisabhängig einen Ca2þ-abhängigen Membranpermeabilitätsübergang (MPT) zu induzieren (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006 ). Es ist auch mit erhöhten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und mitochondrialem oxidativem Stress verbunden, was zum Zelltod führt und somit zu Leber- und Muskelschäden beiträgt (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
KräuterCistanchen, die ganze getrocknete Pflanze von Cistanche deserticola YC Ma, oder Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (Familie der Orobanchaceae), sind parasitäre Pflanzen, die überwiegend in den Wüstengebieten Nord- und Nordostchinas wachsen (Siu und Ko, 2010).KräuterCistanchenist ein Yang-belebendes chinesisches Tonikum, das vor allem zur Behandlung von Niereninsuffizienz mit Symptomen wie Impotenz, Unfruchtbarkeit, vorzeitiger Ejakulation eingesetzt wird. Die schwere und süßliche Natur des Krauts befeuchtet auch den Darm und hilft, Verstopfung zu lindern. Es ist auch ein chinesisches Kraut, das Patienten traditionell bei Schmerzen in Lenden und Knien verschrieben wird, und ist ein Kraut, das häufig in chinesischen Formulierungen zur Behandlung von Muskelproblemen verwendet wird (Siu und Ko, 2010; Xiong et al., 1998). Interessanterweise stimmt dies auch mit den modernen wissenschaftlichen Studien überein, die die Anti-Müdigkeits-Aktivitäten eines Polysaccharid-reichen und Phenylethanoid-reichen Extrakts demonstriertenKräuterCistanchenbei Ratten nach dem Training durch Verringerung von Muskelschäden und Verbesserung der ATP-Speicherung (Cai et al., 2010). Jüngste Arbeiten zeigten, dass ein Methanolextrakt von Herba Cistanches die mitochondriale ATP-Erzeugung verbessern könnte (Leung und Ko, 2008). Siu und Ko (2010) haben das gezeigtKräuterCistanchenkönnten auch den mitochondrialen Glutathionstatus verbessern, indem sie die Niveaus der Glutathionsynthese und GPx vermitteln und so das Gewebe in den Herzen von Ratten vor oxidativem Stress schützen. Das haben auch Siu und Ko (2010) gezeigtKräuterCistanchenkönnte den mitochondrialen Ca2þ-Gehalt verringern und dadurch die Ca2þ-abhängige MPT reduzieren. Außerdem,KräuterCistanchenhat sich in In-vivo-Studien auch als starkes Antioxidans und Radikalfänger in verschiedenen Organen erwiesen, wodurch oxidativer Stress und ROS-Aktivitäten reduziert werden (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). Interessanter, bei einem Versuch, die aktive Fraktion zu bestimmen, die zur Anti-Ermüdungsaktivität von beiträgtKräuterCistanchenwurde festgestellt, dass Verbascosid der Hauptbestandteil in der aktiven Fraktion war (Cai et al., 2010). Es wurde auch gezeigt, dass Verbascosid die Muskelermüdung bei Kröten verringert, möglicherweise aufgrund seiner antioxidativen Aktivitäten (Liao et al., 1999), was darauf hindeutet, dass Verbascosid die bioaktive Komponente sein könnte, die zu den vorteilhaften Wirkungen von Herba Cistanches beiträgt.
Das Ziel dieser Studie war es festzustellen, ob die Verwendung von pflanzlichem Cistanches-Wasserextrakt (HCE) die durch Simvastatin in vitro induzierte Muskeltoxizität verringern könnte. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Verwendung von HCE die durch Simvastatin verursachten Nebenwirkungen der Muskeltoxizität korrigieren könnte. Es wurde auch versucht festzustellen, ob die vorteilhaften Wirkungen vonKräuterCistanchenwerden auf das Vorhandensein von Verbascosid zurückgeführt.
2. Materialien und Methoden
2.1. Authentifizierung und Zubereitung von Kräutermaterialien
Rohes pflanzliches Material vonKräuterCistanchenwurde von einem renommierten Lieferanten in Guangzhou, China, gekauft.KräuterCistanchenwurde unter Verwendung von Dünnschichtchromatographie (TLC) gemäß Chinese Pharmacopoeia (CP), 2010, mit Verbascosid und Echinacosid als chemischen Markern chemisch authentifiziert (Daten nicht gezeigt). Nach chemischer Authentifizierung Herbarbelegexemplar vonKräuterCistanchenwurde im Museum des Instituts für Chinesische Medizin an der Chinesischen Universität von Hongkong (CUHK) mit der Belegexemplarnummer 2014–3434 hinterlegt.
Kurz gesagt wurde 1 kg des rohen Krauts 1 h lang eingeweicht, gefolgt von zweimaliger Extraktion durch Erhitzen für 1 h unter Rückfluss bei 100 Grad unter Verwendung von 10 l destilliertem Wasser für jede Extraktion. Die wässrigen Extrakte (HCE) wurden vereinigt und filtriert. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei 60 Grad eingeengt. Der konzentrierte Extrakt wurde zur Trockne lyophilisiert. Der Ausbeuteprozentsatz betrug 50,1 % Gew./Gew. Eine kleine Menge wurde verwendet, um die Menge an Verbascosid und Echinacosid unter Verwendung von Ultraleistungsflüssigkeitschromatographie (UPLC) zu bestimmen. Das gesamte extrahierte Pulver wurde vakuumverpackt und bis zur Verwendung gelagert.
2.2. UPLC-Analyse des wässrigen Extrakts
UPLC-Analysen wurden unter Verwendung des Acquity Ultra Performance LC-Systems von Waters (Waters, USA) durchgeführt. Alle für UPLC-Analysen erforderlichen Lösungsmittel wurden vom Department of Chemistry der Chinese University of Hong Kong bezogen. Verbascosid und Echinacosid wurden vom National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, China, bezogen. Die Probenlösung wurde in eine Waters Acquity UPLC BEH C18-Säule (10{{20}} 2,1 mm2 ID, Partikelgröße 1,7 mm) mit Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column ( 5-2,1 mm2 ID, Partikelgröße 1,7 mm). Alle Lösungsmittel wurden mit 0,45 mm Millipore-Filterscheibe (Millipore) vorfiltriert und entgast. Die Gradientenelution wurde unter Verwendung der folgenden Lösungsmittelsysteme durchgeführt: mobile Phase A – Acetonitril; mobile Phase B – doppelt destilliertes Wasser/Ameisensäure (99,9/ 0,1; v/v). Die Elution wurde mit einem Gradientenverfahren wie folgt durchgeführt: 0–5 min, 88 Prozent B; 5–10 min, von 88 Prozent B auf 83 Prozent B. Die verwendete Flussrate betrug 0,4 ml/min und die Detektion wurde bei 331 nm gemäß CP (2010) durchgeführt. Jede Probe (5 ul) wurde nach Filtration durch eine 0,2-mm-Filterscheibe in die Säule injiziert. Die Identifizierung der chemischen Marker erfolgte durch Vergleich der Retentionszeiten und der UV-Absorption der unbekannten Peaks mit denen der Standards. Eine Kalibrierungskurve wurde durch eine Reihe von Konzentrationen von Verbascosid und Echinacosid (40, 20, 10, 5, 2,5 und 1,25 mg/ml) zur Quantifizierung gezeichnet. Die Quantifizierung von Verbascosid und Echinacosid im Kräuterextrakt wurde dreifach durchgeführt. Das System wurde von einem Computer überwacht, der mit der MassLynx-Software von Waters zur Datenerfassung, -integration und -analyse ausgestattet war.
2.3. Zellkultur
Die Skelettmuskelzelllinie L6 der Ratte wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, USA) bezogen. Die Zellen wurden bei subkonfluenter Dichte in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, ATCC, Manassas, VA, USA) gehalten, das mit 10 Prozent v/v fötalem Rinderserum (FBS) und 1 Prozent Penicillin-Streptomycin (P/S) ergänzt war bei 37 Grad in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5 Prozent CO2 und 95 Prozent Luft inkubiert.
Um die Wirkungen von HCE auf die Statin-induzierte Muskeltoxizität zu bestimmen, wurden L6-Zellen mit Simvastatin bei 1 0 μM für 48 h behandelt, um Toxizität zu induzieren. HCE (in den Konzentrationen 0, 250, 500, 1000 und 2000 ug/ml) oder Verbascosid (in den Konzentrationen 0, 20, 40, 80 und 160 μM) wurden als Co-Behandlung mit einem Statin hinzugefügt, um festzustellen, ob die Kräuterextrakt könnte die durch Statine induzierte Toxizität in Skelettmuskelzellen verhindern, und dass Verbascosid ähnliche Schutzwirkungen wie der wässrige Kräuterextrakt ausüben könnte.
Herba Cistanche-Extrakt Schutzwirkung auf Simvastatin-induzierte Toxizität in vitro
2.4. In-vitro-Zytotoxizität
L6 Zellen (1x105/Well) wurden über Nacht in {{0}}Well-Flachbodenkulturplatten (Iwaki, Japan) ausgesät, gefolgt von einer Behandlung mit 10 μM Simvastatin, zusammen mit oder ohne verschiedene Dosen von HCE ( 0–2000 ug/ml) oder Verbascosid (0–160 μM), für 48 h. Zu den Kontrollvertiefungen wurde reines Medium (DMEM) gegeben. Der Kräuterextrakt und die Verbindung wurden in DMEM gelöst.
Nach der 48-stündigen Behandlung wurde das Medium von allen Zellen verworfen und 30 ul von 5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,{{ 8}}Diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma, USA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden zu jeder Vertiefung gegeben und die Platten wurden weitere 3 Stunden bei 37 Grad inkubiert. Der Überstand wurde dann entfernt und 100 ul DMSO wurden in jede Vertiefung gegeben, um die violetten Formazan-Kristalle aufzulösen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Die Extinktion jeder Probe wurde bei 540 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (Biotek μ-Quant, USA) abgelesen. Die Ergebnisse wurden als Prozentsatz der MTT-Absorption in Bezug auf Kontrollzellen ausgedrückt.
2.5. Annexin-V-FITC/PI-Färbungsassay
L6-Zellen (3 x 105/Well) wurden mit Simvastatin behandelt, zusammen mit oder ohne verschiedene Dosen von HCE oder Verbascosid. Die Zellen wurden dann gesammelt, gewaschen und mit dem Annexin-V-FITC-Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Trevigen, MD, USA) gefärbt. Kurz gesagt, die Zellen wurden zweimal mit 1 × Bindungspuffer gewaschen und in 100 &mgr;l Markierungslösung, die 1 &mgr;l Annexin-V-FITC-Konjugat und 10 &mgr;l PI enthielt, im Dunkeln für 15 min bei Raumtemperatur kubiert. Die Fluoreszenz der Proben wurde durch Durchflusszytometrie (Becton Dickinson FACSCanto II, USA) nachgewiesen.
2.6. Caspase-3-Aktivitätsassay
Die Aktivität von Caspase 3 wurde unter Verwendung eines fluorometrischen Immunosorbent-Enzymassays (Sigma) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. Kurz gesagt wurden mit Simvastatin behandelte L6-Zellen (3 × 10 5 /Vertiefung) zusammen mit oder ohne verschiedene Dosen von HCE-Verbascosid unter Verwendung des Lysepuffers lysiert. Freies 7-Amino-4-methylcumarin (AMC), das durch die proteolytische Spaltung des Substrats durch Caspase 3 erzeugt wurde, wurde gemessen und fluorimetrisch mit einer Anregungswellenlänge von 360 nm und einer Emissionswellenlänge von 460 nm mit einer BMG FLUOstarOptima-Mikroplatte gemessen und quantifiziert Leser (BMG LABTECH GmbH, Deutschland).
2.7. Zellulärer ATP-Assay
L6 Zellen (3x105/Well) wurden mit Simvastatin behandelt, zusammen mit oder ohne verschiedene Dosen von HCE oder Verbascosid. Nach der Behandlung wurden die Zellen gesammelt und der ATP-Gehalt wurde unter Verwendung des im Handel erhältlichen kolorimetrischen Kits (Abcam, UK) durch Messung des Glycerinphosphatgehalts der lysierten Zellen und Ablesen bei 570 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegeräts (Biotek μ-Quant, USA) gemessen ). Die Messung der ATP-Produktion wurde als Prozentsatz relativ zur Kontrollgruppe ausgedrückt.
2.8. statistische Analyse
Die Daten wurden als Mittelwert 7SD dargestellt, Prism 5 für Windows (Version 5.0c, GraphPad Software, Inc., USA) wurde für die statistische Analyse verwendet. Signifikante Unterschiede zwischen allen Gruppen wurden durch einfache ANOVA, gefolgt von Bonferroni's MultipleComparison Test, bewertet. Eine Wahrscheinlichkeit von po0.05 wurde als statistisch signifikant angesehen.
3. Ergebnisse
3.1. UPLC-Analyse von wässrigem Herba Cistanches-Extrakt
Abb. S1A zeigt das UPLC-Profil einer Standardmischung, die Echinacosid und Verbascosid enthält. Die Retentionszeitpunkte jedes dieser Marker wurden mit dem UPLC-Profil von verglichenKräuterCistanchenwässriger Extrakt (Abb. S1B). Die Menge an Echinacosid und Verbascosid darinKräuterCistanchenDer wässrige Extrakt wurde zu {{0}},45 Prozent w/w bzw. 0,085 Prozent w/w gefunden.
3.2. Wirkung von HCE und Verbascosid auf die In-vitro-Zytotoxizität von Simvastatin in L6-Skelettmuskelzellen
Wie in 1A gezeigt, verursachte Simvastatin eine signifikante Zytotoxizität gegenüber L6-Zellen, was sich in der signifikanten Verringerung der Lebensfähigkeit von L6-Zellen bei 10 mM Simvastatin widerspiegelt. Die Behandlung mit HCE verhinderte dosisabhängig und signifikant die Simvastatin-induzierte Zytotoxizität bei 500, 1000 und 2000 mg/ml. Verbascosid übte einen Trend zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von L6-Zellen aus, die gleichzeitig mit Simvastatin behandelt wurden. Keine der Konzentrationen hatte jedoch eine statistische Signifikanz erreicht (Fig. 1B).
Abb. 1. Schutzwirkung von (a) HCE; und (b) Verbascosid auf Simvastatin-induzierte Zytotoxizität in L6-Zellen. Die Werte stellen Mittelwerte von 7SD (n¼3) dar. Ein signifikanter Unterschied zwischen der Behandlung mit Simvastatin allein und der Kontrollgruppe unter Verwendung des Student-t-Tests: ### po0.{{10}}01. Signifikanter Unterschied zwischen allen mit Simvastatin behandelten Gruppen mit oder ohne HCE-Verbascosid-Co-Behandlung unter Verwendung einer einfachen ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.
3.3. Wirkung von HCE und Verbascosid auf den Simvastatin-induzierten Zelltod in L6-Skelettmuskelzellen
Um die Art des durch Simvastatin induzierten Zelltods zu untersuchen und die schützende Rolle von HCE oder Verbascosid auf den durch Simvastatin induzierten Zelltod zu bestimmen, wurde der Anteil apoptotischer Zellen durch Propidiumiodid (PI)-Färbung nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigten, dass Simvastatin einen signifikanten Anstieg des Anteils früher apoptotischer Zellen (Annexin V-FITC positiv und PI negativ, Q4–2) und später apoptotischer/toter Zellen (Annexin V-FITC positiv und PI positiv, Q2– 2) im Vergleich zur Kontrollgruppe. Die Co-Behandlung mit HCE reduzierte den Anteil von früh apoptotischen und spät apoptotischen/toten Zellen dosisabhängig bis zu 1000 mg/ml (Abb. 2A). Diese Schutzwirkung wurde auch in Verbascosid-Co-Behandlungsgruppen beobachtet. Keine der getesteten Konzentrationen hatte jedoch eine statistische Signifikanz erreicht (Fig. 2B).
Abb. 2. Wirkung von Simvastatin mit oder ohne gleichzeitige Behandlung mit HCE oder Verbascosid auf die Externalisierung von Phosphatidylserin in L6-Zellen. Die Zellen wurden mit Annexin-V FITC und I gefärbt und durch Durchflusszytometrie nachgewiesen
3.4. Wirkung von HCE und Verbascosid auf die Aktivität von Caspase 3 in mit Simvastatin behandelten L6-Skelettmuskelzellen
Wie in 3A gezeigt, induzierten 10 mM Simvastatin signifikant Caspase 3-Aktivität in L6-Zellen, was darauf hindeutet, dass Simvastatin Apoptose in L6-Zellen durch die Caspase-Kaskade induzierte. In L6-Zellen, die gleichzeitig mit Simvastatin und HCE behandelt wurden, reduzierte HCE jedoch dosisabhängig und signifikant die Caspase-3-Aktivität, was auf die Fähigkeit von HCE hindeutet, Simvastatin-induzierte Apoptose durch die Caspase-Kaskade zu verhindern. Obwohl Verbascosid andererseits auch einen Trend zur Reduzierung der Simvastatin-induzierten Zunahme der Caspase-3-Enzymaktivität ausübte, erreichte nur die Konzentration bei 160 mM statistische Signifikanz ( 3B ).
Abb. 3. Schutzwirkung von (a) HCE; und (b) Verbascosid auf die Simvastatin-induzierte enzymatische Caspase-3-Aktivität in L6-Zellen. Die Werte stellen Mittelwerte von 7SD (n¼3–5) dar. Signifikanter Unterschied zwischen Simvastatin-Behandlung allein und Kontrollgruppen unter Verwendung des Student-t-Tests: ###po0.001. Signifikanter Unterschied zwischen allen mit Simvastatin behandelten Gruppen mit oder ohne HCE- oder Verbascosid-Co-Behandlung unter Verwendung einer einfachen ANOVA: *po0.05, **p 0,01, ***po0,001.
3.5. Wirkung von HCE auf die Simvastatin-induzierte Reduktion der ATP-Produktion in L6-Skelettmuskelzellen
Simvastatin (10 mM) reduzierte die ATP-Produktion in L6-Zellen signifikant um etwa 60 Prozent im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 4A). Die gleichzeitige Behandlung mit HCE schwächte dosisabhängig die Verringerung der ATP-Produktion in mit Simvastatin behandelten Zellen ab, von denen nur die Konzentrationen bei 500, 1000 und 2000 mg/ml statistische Signifikanz erreicht hatten. Obwohl Verbascosid andererseits einen Trend zur Wiederherstellung der ATP-Produktion bei 50 mg/ml ausübte, erreichte es keine statistische Signifikanz (Fig. 4B).
Abb. 4. Schützende Wirkung von (a) HCE und (b) Verbascosid auf die Simvastatin-induzierte Verringerung der ATP-Produktion in L6-Zellen. Die Werte stellen Mittelwerte von 7SD (n¼3–5) dar. Signifikanter Unterschied zwischen Simvastatin-Behandlung allein und Kontrollgruppen unter Verwendung des Student-t-Tests: ###po0.001. Signifikanter Unterschied zwischen allen mit Simvastatin behandelten Gruppen mit oder ohne gleichzeitige Behandlung mit HCE oder Verbascosid unter Verwendung einer einfachen ANOVA: *po0,05, **po0,01.
4. Diskussion
Mit der zunehmenden Prävalenz von Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) und Patienten mit diagnostizierter Hypercholesterinämie weltweit ist die Verwendung von Statinen üblicher geworden. Obwohl Statine im Allgemeinen sehr gut vertragen werden, ist Muskelschädigung eine häufig berichtete Nebenwirkung im Zusammenhang mit der Einnahme von Statinen, die Wochen oder Monate nach Beginn der Behandlung akut auftreten kann (Fine, 2003). Muskelsymptome können von leichten Problemen, z. B. Schmerzen, Empfindlichkeit oder Schwäche mit oder ohne Erhöhung der Kreatinkinase (CK), bis zum schwersten Zustand der Rhabdomyolyse reichen (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). Aufgrund des Auftretens dieser Nebenwirkungen und der Tatsache, dass es keine wirksame Behandlung der Statin-induzierten Muskeltoxizität gibt, werden Statine zu wenig eingesetzt. In einer breiten Umfrage unter 10.409 französischen Probanden, die durch ein Telefoninterview durchgeführt wurde, berichteten 10 Prozent der Patienten, die mit Statinen behandelt wurden, über muskuläre Symptome, von denen 30 Prozent dieser symptomatischen Patienten zu einem Behandlungsabbruch führten (Rosenbaum et al., 2013).
Wir haben zum ersten Mal gezeigt, dass der Wasserextrakt vonKräuterCistanchen, ein häufig verwendetes traditionelles chinesisches Kraut, könnte eine schützende Wirkung gegen Simvastatin-induzierte Toxizität in vitro in L6-Skelettmuskelzellen ausüben, was auf das Potenzial hindeutetKräuterCistanchenwässriger Extrakt (HCE) wegen seiner schützenden Rolle vor Statin-induzierter Muskeltoxizität, die eine anerkannte häufige Nebenwirkung bei Patienten ist, die Statine einnehmen. Die starke Fähigkeit von HCE zum Schutz vor Statin-induzierter Muskeltoxizität wäre daher von großem Potenzial.
Gemäß der traditionellen Theorie der TCM steht Yang im Zusammenhang mit dem mitochondrialen Energiestoffwechsel im Körper, und es wurde festgestellt, dass die Verschreibung von Yang-belebenden Kräutern die mitochondriale ATP-Erzeugung verbessert (Ko und Leung, 2007). Interessanterweise beobachteten wir eine Verringerung der ATP-Produktion in mit Simvastatin behandelten L6-Skelettmuskelzellen, und diese Verringerung der ATP-Produktion wurde durch die gleichzeitige Behandlung mit HCE signifikant verbessert. In unserer Studie mit L6-Ratten-Skelettmuskelzellen zeigten wir eine durch Simvastatin verursachte Verringerung der Zelllebensfähigkeit. Diese Verringerung der Zelllebensfähigkeit wurde durch die Co-Behandlung von signifikant verbessertKräuterCistanchendosisabhängig. Obwohl der genaue Mechanismus der Statin-induzierten Muskeltoxizität nicht vollständig aufgeklärt wurde, wurde vermutet, dass die Statin-induzierte Apoptose gesunder Skelettmyozyten ein beitragender Faktor ist, der Myopathie verursacht, die häufigste Nebenwirkung von Statin-Anwendern (Dirks und Jones, 2006). . In unserer Studie beobachteten wir einen signifikanten Anstieg apoptotischer Zellen, der durch Simvastatin induziert wurde, was mit einer signifikant erhöhten Caspase-3-Aktivität verbunden war. Diese Daten stimmen auch mit früheren Studien überein, die zeigten, dass verschiedene Statine Apoptose in Skelettmyoblasten, Myotuben und in differenzierten primären menschlichen Skelettmuskelzellen durch Aktivierung von Caspase-9- und Caspase-3-Aktivitäten induzieren können (Dirks und Jones, 2006). Unser HCE konnte diese Simvastatin-induzierte Erhöhung der Caspase-3-aktivierten Apoptose dosisabhängig verhindern.
KräuterCistanchen
Außerdem deutete die frühere Literatur darauf hin, dass Verbascosid einer der wichtigsten aktiven Bestandteile darin istKräuterCistanchen. Verbascosid, auch bekannt als Acteosid, gehört zu den Phenylethanoidglykosiden, einer natürlich vorkommenden Gruppe wasserlöslicher Polyphenolverbindungen (Liao et al., 1999). Zuvor wurde gezeigt, dass Verbascosid ein starkes Antioxidans ist, das starke ROS-fangende und antioxidative Aktivitäten aufweisen könnte (Liao et al., 1999). In unserer Studie haben wir die Wirkung von Verbascosid in Konzentrationen von 0–160 mM getestet, um festzustellen, ob Verbascosid die Hauptkomponente in unserem HCE ist, die zu den beobachteten positiven Wirkungen beiträgt. Da wir gezeigt haben, dass unser HCE im Konzentrationsbereich von 250–2000 mg/ml aktiv ist, basierend auf unseren HPLC-Ergebnissen, die darauf hindeuten, dass unser HCE Verbascosid in einer Konzentration von 0,085 Gew.-% enthielt /wt, die aktive Konzentration von Verbascosid sollte zwischen 0,2125–1,7 mg/ml (dh 0,34–2,72 mM) liegen, sollte Verbascosid der aktive Bestandteil sein? Dennoch konnten wir im getesteten Konzentrationsbereich keine signifikante positive Wirkung von Verbascosid beobachten, obwohl wir einen dosisabhängigen Trend für eine positive Wirkung von Verbascosid auf L6-Skelettmuskelzellen beobachteten. Diese Daten legten nahe, dass die in L6-Skelettzellen beobachtete vorteilhafte Wirkung unseres HCE wahrscheinlich nicht auf die Wirkung von Verbascosid allein zurückzuführen ist, was darauf hindeutet, dass andere Komponenten als Verbascosid für die beobachteten vorteilhaften Wirkungen verantwortlich sein könnten. Es ist auch möglich, dass Verbascosid mit anderen bioaktiven Verbindungen im Extrakt interagiert, um zu den positiven Wirkungen beizutragen. Zusätzliche Experimente mit Bioassay-geführter Fraktionierung werden hilfreich sein, um weitere Einblicke in die Entdeckung der bioaktiven Komponenten zu geben, die für den Beitrag zu den beobachteten Schutzwirkungen von HCE auf die Simvastatin-induzierte Muskeltoxizität verantwortlich sind.
Zusammenfassend weist die vorliegende Studie darauf hin, dass HCE starke Schutzwirkungen auf die durch Simvastatin induzierte Verringerung der Lebensfähigkeit von Muskelzellen in vitro ausüben könnte. Diese Ergebnisse liefern den vorläufigen Beweis dafür, dass unser wässriger HC-Extrakt von therapeutischem Wert als funktionelles Lebensmittel oder Nutrazeutika für hyperlipidämische Patienten sein könnte, die aufgrund von Statin-induzierter Myotoxizität die Statinbehandlung abbrechen müssen.
DanksagungDiese Studie wurde vom Food and Health Bureau HKSAR, Health and Medical Research Fund No. 11120831.
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