Die Beziehung zwischen Cyclooxygenase (COX-2) und Hypoxie-induzierter Krankheit

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Intrazelluläres Prostaglandin E2 trägt zum Hypoxie-induzierten proximalen tubulären Zelltod bei

Coral Garcia-Pastorl, Selma Benito-Martinez, Ricardo J. Bosch1, Ana B. Fernandez-Martinez, Francisco J. Lucio-Cazana

Proximale tubuläre Zellen (PTC) sind besonders anfällig für Hypoxie-induzierte Apoptose, ein relevanter Faktor fürNierenerkrankung. Wir stellten hier die Hypothese auf, dass der PTC-Tod unter Hypoxie durch Cyclooxygenase (COX-2)-abhängige Produktion von Prostaglandin E,(PGE,) vermittelt wird, was in humanen proximalen tubulären HK-2-Zellen aufgrund von Hypoxie bestätigt wurde (1 Prozent O,)-induzierte Apoptose (i) wurde durch eine COX-2(cyclo-Oxygenase)-Hemmer und durch Antagonisten von Prostaglandin (EP)-Rezeptoren und (ii) wurde mit einem Anstieg der intrazellulären PGE (iPGE) aufgrund einer Hypoxie-induzierbaren Faktor-1 --abhängigen transkriptionellen Hochregulierung von COX in Verbindung gebracht{{3 }}(Zyklo-Oxygenase). Die Apoptose wurde auch durch Inhibitoren des Prostaglandin-Aufnahmetransporters PGT verhindert, was anzeigte, dass iPGE zur Hypoxie-induzierten Apoptose beiträgt (im Gegensatz dazu war der durch Hypoxie/Reoxygenierung induzierte PTC-Tod ausschließlich auf extrazelluläres PGE zurückzuführen). Somit ist iPGE ein neuer Akteur in der Pathogenese von Hypoxie-induzierten tubulären Verletzungen und PGT könnte ein neues therapeutisches Ziel für die Prävention von Hypoxie-abhängigen Läsionen bei Nierenerkrankungen sein.

Es ist allgemein bekannt, dass tubuläre Hypoxie sowohl für akute als auch für chronische Erkrankungen ein relevanter Faktor istNierenerkrankung'2 Proximale Tubuluszellen (PTC) sind aufgrund ihrer energieaufwändigen Reabsorptionsaktivitäten in Bezug auf den Sauerstoffverbrauch hoch aktiv und daher anfällig für Hypoxie. Es konnte gezeigt werden, dass Apoptose bei kultivierten PTC, die Hypoxie ausgesetzt sind, eine relevante Rolle spielt, aber die Signalwege, die für die Aktivierung der apoptotischen Maschinerie verantwortlich sind, wurden nicht untersucht. Wir und andere haben herausgefunden, dass Prostaglandin E, (PGE), ein wichtiger Lipidmediator zahlreicher physiologischer und pathologischer Prozesse in derNiere, spielt eine relevante Rolle bei der Signalübertragung, die nach Behandlung mit Cisplatin7, Albumin8 oder Leptin und Gentamycin zur PTC-Apoptose führt. In allen Fällen wurde festgestellt, dass der PGE-Anstieg von einer verstärkten Expression von Cyclooxygenase-2(COX-2) abhängig war.(Cyclooxygenase), ein induzierbares Enzym, das zusammen mit COX-1l ​​der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Synthese von Prostaglandinen ist. Im MenschenNiere, Basal-COX-2(Cyclooxygenase)Der Ausdruck ist weniger intensiv als der von COX-1. COX-2(Cyclooxygenase)wurde in Podozyten und Teilen der Henle-Schleife und in Nierengefäßen unter physiologischen Bedingungen identifiziert10. In pathologischen Zuständen kann COX-2-Immunreaktivität jedoch in viel mehr Zelltypen innerhalb des gefunden werdenNiereeinschließlich PTC, und trägt möglicherweise zu Nierenschäden bei. Interessanterweise erhöht Hypoxie die Expression von COX-2(Cyclooxygenase)und/oder die Produktion von PGE,12-i7 in vielen Zelltypen. Tatsächlich haben wir zuvor festgestellt, dass Hypoxie den intrazellulären Gehalt an PGE sowie dessen Freisetzung in das extrazelluläre Medium erhöht8. Daher ist es theoretisch möglich, dass PGE die apoptotische Wirkung von Hypoxie auf PTC vermittelt.

Die meisten Studien zur PGE-abhängigen Apoptose konzentrierten sich im Wesentlichen auf Mechanismen, an denen extrazelluläres PGE beteiligt ist, da weithin anerkannt ist, dass PGE seine biologischen Wirkungen durch die Aktivierung von plasmamembranüberspannenden G-Protein-gekoppelten PGE-Rezeptoren (Prostaglandinrezeptoren der E-Serie) ausübt EP1-4)1. Dennoch ist in einigen Modellen intrazelluläres PGE (iPGE) für den apoptotischen Zelltod relevant720-22. Dies impliziert, dass PGE, um Apoptose zu induzieren, wieder das intrazelluläre Medium erreichen und eine Untergruppe von EP-Rezeptoren aktivieren muss, die sich innerhalb der Zelle befinden (iEP-Rezeptoren). Da die Aufgabe des Einfangens von PGE hauptsächlich vom Prostaglandin-Aufnahmetransporter (PGT) 23-26 erledigt wird, führt die PGT-Hemmung zur Verhinderung des iPGE-vermittelten apoptotischen Zelltods7.

Vor diesem Hintergrund haben wir in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ein COX-2(Cyclooxygenase)-abhängiger Anstieg der iPGE-Spiegel vermittelt Hypoxie-induzierte Apoptose bei PTC.

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Methoden

Reagenzien.

AG1478, Bromkresolgrün (BG), PGE, AH6809, GW627368X, Kristallviolett, Trypanblaulösungen, Bromsulfophthalein (BRS), 3-(5'-Hydroxymethyl2'-furyl)-1-benzylindazol (YC1), und Actinomycin D wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) gekauft. Z-VAD-FMK und Celecoxib stammten von Calbiochem (Darmstadt, Deutschland) bzw. Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA). TriReagent wurde von Vitro (Madrid, Spanien) erworben, und PVDF-Membranen und Western-Blotting-Luminol-Reagenz wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) erworben. ProLong Gold-Antifade-Reagenz mit 4,6-diamidino{{14 }}Phenylindol (DAPI), Annexin-V-FITC(Fluoresceinisothiocyanat)/Propidiumiodid (PI)-Apoptose-Nachweiskit und 2',7'-Dichlorfluoresceindiacetat(DCFH-DA)-Sonde wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) bzw. Molecular Probes (Oregon, USA). Antikörper wurden aus den folgenden Quellen bezogen: Anti-PGE und Anti-COX-2(Cyclooxygenase)Antikörper stammten von Abcam (Cambridge, UK); Anti-Bax und Anti-Bcl-2 waren von Santa Cruz Technologies (Santa Cruz, CA, USA); Anti-HIF-1a-Antikörper und -Kaninchen-Alexa-Fluor 488 stammten von BD Biosciences (Palo Alto, CA, USA) bzw. Invitrogen (Carlsbad, CA, USA); Anti- --Aktin und Kaninchen-Anti-Maus-IgG-Peroxidase-Konjugat wurden von Sigma (St. Louis, MO, USA) bezogen.

Zellkultur und experimentelle Bedingungen.

Humane proximale tubuläre HK-2-Zellen wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, MD, USA) erworben. Die Zellen wurden in 5 % CO bei 37 Grad C in DMEM/F12, ergänzt mit 10 % fötalem Rind, gehalten Serum (FBS), 1 Prozent Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B und 1 Prozent Glutamin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und 1 Prozent Insulin-Transferrin-Selen (ThermoFisher, Grand Island, NY, USA). In allen Experimenten Zellen wurden bei 70-90 Prozent Konfluenz plattiert, und wenn sie vollständig befestigt waren, wurden sie unter hypoxischen (1 Prozent Sauerstoff) oder normoxischen Bedingungen (21 Prozent Sauerstoff) kultiviert.HypoxieExperimente wurden in einem In vivo200 durchgeführtHypoxieWorkstation (Ruskin Technology, West Yorkshire, Vereinigtes Königreich). ZumHypoxie/Reoxygenierungsexperimenten, denen Zellen unterzogen wurdenHypoxiefür 24 h, und danach wurden die Zellen unter normoxischen Bedingungen für bis zu 3 h (Reoxygenierungsperiode) inkubiert.

Immunfluoreszenzanalyse von iPGE und Western-Blot-Analyse von COX-2(Cyclooxygenase)und HIF-1 .

Zellen für die Immunfluoreszenzanalyse und die Western-Blot-Analyse wurden jeweils auf Deckgläschen aus Glas (4 × 10 4 Zellen/Deckglas aus Glas) oder in Platten mit sechs Vertiefungen (15 × 10 4 Zellen/Vertiefung) aufgeteilt und wie in „Ergebnisse“ beschrieben inkubiert. Dann wurden Immunfluoreszenz- und Immunoblot-Analyse im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt. Antikörper-Arbeitsverdünnungen waren: 1/50 für PGE, 1/1000 für COX-2(Cyclooxygenase)/HIF-1a/a-rabbit-Alexa-Fluor 568 und 1/5000 für -actin. Die Immunfluoreszenzdetektion wurde unter Verwendung eines konfokalen Leica SP5-Mikroskops (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) durch den Confocal Microscopy Service (ICTS 'NANBIOSIS'U17) des Biomedical Research Networking Center on Bioengineering, Biomaterials, and Nanomedicine (CIBER-BBN at the Universität Alcal, Madrid, Spanien)

Transiente Transfektion.

Transiente Transfektion mit siRNA PGT (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), dem Säuger-Expressionsvektor pcDNA3, enthaltend die cDNA der Wildtyp-Human-15--Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase (p15-PGDH) oder der Luciferase-Reporterplasmidkonstrukte für menschliche COX-2(Cyclooxygenase)phPES2-Luc, MenschHypoxieResponse-Element (HRE)p9HIF1-Luc und R. reniformis pRL-CMV (Promega, Madison, WI) und die Bestimmung der Luciferase-Aktivität wurden wie an anderer Stelle beschrieben durchgeführt27,28.

Zellzahl und Zell-/Kernmorphologie.

Die Anzahl adhärenter Zellen wurde spektrophotometrisch mit einer modifizierten Kristallviolett-Färbemethode bestimmt2. Um Anzeichen von Apoptose nachzuweisen, wurde die Zellmorphologie unter Verwendung von Phasenkontrastmikroskopie beobachtet. Zellkerne wurden nach DNA-Färbung mit DAPI wie zuvor beschrieben sichtbar gemacht0. Typische apoptotische Morphologie, die untersucht wurde, umfasste Zellschrumpfung, Kernkondensation und -fragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern. Zur Quantifizierung wurden unter jeder experimentellen Bedingung blind sechs Felder untersucht, um den Prozentsatz an Zellkernen mit Apoptose-ähnlichem Aussehen abzuschätzen.

Durchflusszytometrie-Apoptose-Assay und Zelllebensfähigkeits-Assay durch Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlusstest.

An der Platte anhaftende Zellen wurden durch Trypsinisierung abgelöst und zusammen mit den zuvor aus dem Kulturmedium gewonnenen abgelösten Zellen für den Assay verwendet.

Das Annexin-V-FITC/PI-Apoptose-Nachweiskit ermöglichte den Durchflusszytometrie-Nachweis von apoptotischen und nekrotischen HK-2-Zellen, wie zuvor beschrieben7. Frühe und späte apoptotische Zellen waren positiv für die Annexin-V-Färbung und beide und Annexin V Färbung. Nekrotische Zellen waren nur positiv gegenüber PI und lebende HK-2-Zellen zeigten keine Färbung.

Der Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstest wurde verwendet, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu beurteilen. Lebensfähige Zellen (weiß) und tote Zellen (blau) wurden unter Verwendung eines Lichtmikroskops und eines Hämocytometers gezählt.

Statistische Analyse.

Jedes Experiment wurde mindestens dreimal wiederholt. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. Sie wurden einer Einweg-Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von einem Bonferroni-Test für mehrere Vergleiche unterzogen. Das Signifikanzniveau wurde auf P kleiner als oder gleich 0,05 festgelegt.

Ergebnisse

Hypoxie induziert den Zelltod der proximalen tubulären HK-2-Zellen.

Hypoxiereduzierte die Anzahl der HK-2-Zellen, wie durch Kristallviolett-Assay bestimmt wurde (Abb. la), und induzierte auch eine Zellrundung und Ablösung von der Platte (Abb. lb, oberes Feld). Wie erwartet,Hypoxielöste ein Modell des Zelltods mit klaren morphologischen Merkmalen der Apoptose aus (siehe Kernfärbung mit DAPI in Fig. 1b, unteres Bild, links), wie Zellschrumpfung mit signifikanter Kernkondensation, Fragmentierung und Bildung von apoptotischen Körpern.Hypoxie-induzierte Apoptose wurde weiter bestätigt durch die Zunahme der Annexin-V-FITC-Färbung, wie durch Durchflusszytometrie bestimmt, und ihre Verhinderung mit dem Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK ( 1c ).Hypoxiestellten auch eine Abnahme der Anzahl lebensfähiger Zellen fest, induzierten jedoch keine statistisch signifikanten Änderungen in der Anzahl nekrotischer Zellen (Fig. 1c, Einschub).

Abbildung 1. Hypoxie induziert den Zelltod der proximalen tubulären HK-2-Zellen.(a) Verringerte Zellzahl (Kristallviolett-Assay). (b) Morphologische Merkmale der Apoptose. Repräsentative Phasenkontrast-Mikrofotografien (oberes Feld, Originalvergrößerung, 10-fach) DAPI-Färbungs-Mikrofotografien (unteres Feld, Originalvergrößerung, 40-fach). (c) Zunahme der Apoptose (Durchflusszytometriestudien). Annexin V plus-Zellen umfassen Annexin V plus /Propidiumiodid-Zellen (dh frühe apoptotische Zellen mit erhaltener Plasmamembranintegrität) und Annexin V plus /Propidiumiodid plus-Zellen (dh spätapoptotische Zellen). Einschub: Arten von Zellpopulationen (Annexin V-/Propidiumiodid-Plus-Zellen sind nekrotische Zellen und Annexin V-/Propidiumiodid-sind lebende Zellen). Die Ergebnisse werden als Prozentsätze in Bezug auf die Gesamtzahl der Ereignisse ausgedrückt. Allgemeine Informationen: (1) Die Zellen wurden für 24 h unter normoxischen (21 % O2) oder hypoxischen (1 % O2) Bedingungen inkubiert, wie in „Methoden“ angegeben. Pan-Caspase-Inhibitor Z-VAD-FMK (25 μM) war 1 h vor Expositionsbeginn zugesetztHypoxie. (2) Mikrofotografien sind repräsentative Beispiele von drei unabhängigen Experimenten. Balken und Fehlerbalken in Diagrammen: Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 3 verschiedenen Experimenten *S<0.01 vs.=""><0.01 vs="">Hypoxie;**P<0.01 vs.="" normoxia="" and="">Hypoxiezuzüglich ZVAD.

COX-2(Cyclooxygenase)Der /iPGE,/EP-Rezeptorweg vermittelt den durch Hypoxie induzierten proximalen tubulären HK-2-Zelltod.

Um die Rolle des COX zu beurteilen-2(Cyclooxygenase)/iPGE2/EP-Rezeptorweg inHypoxie-induzierten HK-2-Zelltod haben wir die Zellen zuerst mit Celecoxib, einem COX-2(Cyclooxygenase)Inhibitor1; AH6809, ein Antagonist von EP1-, EP2- und EP3-Rezeptoren oder GW627368X, ein Antagonist von EP4-Rezeptor33; oder mit Bromkresolgrün oder Bromsulfophthal in beiden Inhibitoren von PGT435. PGT wurde auch durch Transfektion mit siRNA niedergeschlagen.

Abbildung 2. COX-2(Cyclooxygenase)Der /iPGE,/EP-Rezeptorweg vermittelt den durch Hypoxie induzierten proximalen tubulären HK-2-Zelltod.(a) Verhinderung des Zelltods durch Inhibitoren des Signalwegs. Obere Tafel; Die Balken zeigen den Prozentsatz des gesamten Zelltods (links) oder den Prozentsatz an apoptotischen Annexin-V-plus-Zellen (rechts). Bevor man ausgesetzt wirdHypoxie, Zellen wurden für 1 h mit 3 μM Celecoxib (COX-2) vorinkubiert(Cyclooxygenase)Inhibitor）; 10 μM AH6809, （EP1-3-Rezeptor-Antagonist）, 10 μM GW627368X (EP4-Rezeptor-Antagonist); oder mit 50 μM Bromkresolgrün (BG) oder 25 μM Bromsulfophthalein (BrS), zwei PGT-Inhibitoren. Unteres Feld: Links: Verhinderung des Zelltods durch Knockdown von PGT durch Transfektion mit siRNA (Trypanblau-Tauchausschlusstest). Einschub: Wirksamkeit des Knockdowns von PGT (Western-Blot-Analyse) Rechts: Konzentrationsabhängigkeit der präventiven Wirkung von Bromkresolgrün (BG). (b) Verhinderung des Zelltods durch Transfektion mit einem Säuger-Expressionsvektor, der Prostaglandin-inaktivierendes Enzym 15--Hydroxy-Prostaglandin-Dehydrogenase (15- PGDH) cDNA enthält (Trypan-Blau-Farbstoff-Ausschlusstest). Einschub: Expression von {{ 11}}PGDH (Western-Blot-Analyse) in transfizierten Zellen. (c)Hypoxieinduziert einen PGT-sensitiven Anstieg von iPGE,Links: PGE,-abhängige Immunfluoreszenz allein oder kombiniert mit Kernfärbung mit DAPI wird gezeigt (ursprüngliche Vergrößerung, 40×) Rechts: Quantitative Annäherung an die im linken Feld präsentierten Bilder unter Verwendung der Image J-Software. (d) Inhibitor der EGFR-Aktivierung AG1478 verhindert nicht den HK-2-Zelltod EGFR. Zellen wurden für 1 h mit 1 &mgr;M AG1478 vorinkubiert, bevor sie behandelt wurdenHypoxie. （e） Der PGT-Inhibitor BG verändert nicht die Expression von Bax und Bcl-2 in HK-2-Zellen unterHypoxie(Western-Blot-Analyse). (f) Prävention vonHypoxie/Reoxygenierungs-induzierter Zelltod durch Inhibitoren des Signalwegs (Trypanblau-Farbstoff-Ausschlusstest). Zellen wurden mit Inhibitoren des Signalwegs vorinkubiert und ausgesetztHypoxiewie in (a). Dann wurden die Zellen 3 h lang Normoxie ausgesetzt. Allgemeine Informationen: (1) Die Zellen wurden 24 Stunden lang unter normoxischen (21 % O2) oder hypoxischen (1 % O2) Bedingungen inkubiert, wie unter „Methoden“ angegeben. (2) Mikrofotografien sind repräsentative Beispiele von drei unabhängigen Experimenten. (3) Lösungsmittel der Inhibitoren (luL/ml Medium) veränderten die Wirkung von nichtHypoxieauf Zelltod (Ergebnisse sind nicht gezeigt). (4) Western-Blot-Analyse: Gleiches Protein wurde durch Sondieren mit einem Anti- --Actin- oder einem Anti-GAPDH-Antikörper bestätigt. (5)Balken und Fehlerbalken in Diagrammen: Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 3 verschiedenen Experimenten.*S<0.01><0.01>HypoxieoderHypoxie/Reoxygenierung.

Wie in Abb. 2a gezeigt,Hypoxie-induzierter proximaler tubulärer Zelltod wurde in allen Fällen verhindert. Die Hemmung der Apoptose durch Celecoxib deutete darauf hin, dass COX-2(Cyclooxygenase)spielt dabei eine relevante RolleHypoxie-induzierten apoptotischen Zelltod (Abb. 2a, oberes Feld, rechts). Genauer gesagt, die Tatsache, dass Apoptose durch Antagonismus von EP-Rezeptoren verhindert wurde, deutet darauf hin, dass Apoptose durch COX vermittelt wird-2(Cyclooxygenase)-abhängige Produktion von PGE. Andererseits ist es sehr wahrscheinlich, dass iPGE dazu beiträgtHypoxie-induzierten HK-2-Zelltod, weil er verhindert wurde durch: (i) Hemmung von PGT (Abb. 2a) oder (i) Überexpression von 15-PGDH (Abb. 2b), die iPGE2 durch seine inaktiviert Oxidation25 (zu beachten ist, dass das Transfektionsverfahren selbst die Empfindlichkeit von HK-2-Zellen gegenüber erhöht hatHypoxie: Der Zelltod betrug 45-55 Prozent für die Transfektion unter Kontrollbedingungen im Vergleich zu 15-20 Prozent bei nicht transfizierten Zellen). Weitere Unterstützung zum Beitrag von iPGE, zuHypoxie-induzierten HK-2-Zelltod, sind unsere bisherigen ErkenntnisseHypoxieeinen Anstieg des Zellgehalts von iPGE bestimmt,1 und dass dieser Anstieg durch PGT-Inhibitoren verhindert wurde (Abb. 2c).

MAPK-Signalwege können Apoptose induzieren, da iEP-Rezeptoren den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR)36 transaktivieren, was zur Aktivierung der MAP-Kinasen ERK1/2 und p38 in HK-2-Zellen führt0, fragten wir uns, ob prä -Inkubation von HK-2-Zellen mit dem Inhibitor der EGFR-Aktivierung AG1478 verhindertHypoxie-induzierten Zelltod. Wir fanden negative Ergebnisse (Abb. 2d) und daher ist es unwahrscheinlich, dass die Transaktivierung von EGFR den HK-2-Zelltod unter vermitteltHypoxie.

In mehreren experimentellen Modellen wurde die Reduktion von mitochondrial stammendem ATP währendHypoxiebewirkt eine Erhöhung des Expressionsverhältnisses des pro-apoptotischen Proteins Bax zum anti-apoptotischen Protein Bcl-2, was zur Freisetzung von Cytochrom C in das Cytosol, Aktivierung von Caspase 9 und anschließender Spaltung und Aktivierung des nachgeschalteten Effektors führt Kaspasen37,38. Jedoch Vorinkubation mit PGT-Inhibitor BG in HK-2-Zellen unterHypoxieführte nicht zu Veränderungen, die mit einer antiapoptotischen Verschiebung im Gleichgewicht zwischen der Expression von Bc-2 und Bax (Fig. 2e) vereinbar sind, was eine Rolle dieser Proteine ​​in HK-2-Zellen nicht unterstützt Tod unterHypoxie.

Nach einer hypoxischen Exposition können Episoden einer Reoxygenierung (Ischämie/Reperfusionsschaden) zusätzliche Zellschäden hervorrufen. Das "Paradoxon" der Reoxygenierungsverletzung kann unter Berücksichtigung dessen verstanden werden, dass Zellen als Reaktion darauf spezifische Veränderungen in Enzymaktivitäten, Mitochondrienfunktion, Zytoskelettstruktur, Membrantransport und antioxidativer Abwehr erfahrenHypoxie, die dann kollektiv für Reoxygenierungsschäden prädisponieren39. Die Reoxygenierung trägt zu einer akuten Nierenschädigung während eines ischämischen Schlaganfalls, einer Nierentransplantation, eines Kreislaufversagens oder einer Nieren- und Herz-Kreislauf-Operation bei. In diesem Zusammenhang ist der potenzielle therapeutische Wert der Hemmung vonHypoxie/Reoxygenierungs-induzierter proximaler tubulärer Zelltod durch Eingriff in COX-2(Cyclooxygenase)/iPGE,/iEP-Rezeptorweg ist offensichtlich. Daher haben wir gefragt, ob iPGE konkret vermitteltHypoxie-induzierten Zelltod oder auch vermitteltHypoxie/reoxygenationsinduzierter Zelltod (ein in vitro-Modell, das in vivo renale Ischämie/Reperfusionsverletzung nachahmt). Wie in Abb. 2f gezeigt, wurde der Zelltod (wie durch den Trypanblau-Tauchausschlusstest festgestellt) durch COX-2 verhindert.(Cyclooxygenase)Inhibitor Celecoxib sowie durch die EP-Rezeptorantagonisten AH6809 oder GW627368X. Wie bei Abb. 2a deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass COX-2 eine relevante Rolle spieltHypoxie/Reoxygenation-induzierter Zelltod und insbesondere, dass der Zelltod durch COX vermittelt wird-2(Cyclooxygenase)-abhängige Produktion von PGE, da sie durch Antagonismus von EP-Rezeptoren verhindert wurde. Da der Zelltod jedoch nicht durch die PGT-Inhibitoren Bromkresolgrün oder Bromsulfophthalein verhindert wurde (Abb. 2f und ergänzende Abbildung 2d), ist dies wahrscheinlicherHypoxie/reoxygenierungsinduzierter HK-2-Zelltod wird ausschließlich durch extrazelluläres PGE vermittelt.

HIF-1 -abhängige transkriptionelle Regulation von COX-2(Cyclooxygenase)Genexpression trägt zu aHypoxie-induzierter Anstieg von iPGE in proximalen tubulären HK-2-Zellen. Die PGE-Biosynthese beinhaltet die Freisetzung von Arachidonsäure aus Membranglycerophospholipiden durch Phospholipase A, gefolgt von der Umwandlung von Arachidonsäure durch COX-Isoenzyme in Prostaglandin H und schließlich durch die Isomerisierung der Prostata in H zu PGE durch Prostaglandin E-Synthasen wie mikrosomale PGE-Synthase-1 (mPGES-1)19. Das haben wir gefundenHypoxie-induzierte Apoptose in HK-2-Zellen wird höchstwahrscheinlich durch eine COX-2 vermittelt(Cyclooxygenase)-abhängige Steigerung der PGE-Produktion (Abb.2). Da COX-2(Cyclooxygenase)ist ein Enzym, dessen Expression induziert werden kannHypoxie, haben wir angenommen, dass aHypoxie-induzierter Anstieg von PGE, Produktion in HK-2-Zellen könnte die Folge einer erhöhten Expression von COX-2 sein(Cyclooxygenase). Um unsere Hypothese zu bestätigen, untersuchten wir (i) die Wirkung vonHypoxiezum Ausdruck von COX-2(Cyclooxygenase)Protein und mRNA und (ii) die Wirkung von COX-2(Cyclooxygenase)Inhibitor Celecoxib auf derHypoxie-induzierter Anstieg von iPGE, Unsere Ergebnisse zeigten diesHypoxievorübergehend bestimmte transkriptionelle Hochregulierung von COX-2(Cyclooxygenase)Ausdruck (Abb. 3a,b) und dass COX-2(Cyclooxygenase)Hemmung stumpfte den Anstieg von iPGE in HK-2-Zellen abHypoxie(Abb.3c). Interessant,Hypoxiebestimmte auch die vorübergehende Hochregulierung der mPGES-1-Proteinexpression (Fig. 3a, Einschub), beeinflusste aber nicht die mPGES-1-mRNA-Expression (Fig. 3b, Einschub). Diese Ergebnisse zeigten, dass eine erhöhte Expression von COX-2(Cyclooxygenase)und mPGES-1 ist verantwortlich für dieHypoxie-induzierter Anstieg von iPGE.

Abbildung 3. HIF-la-abhängige transkriptionelle Regulation von COX-2(Cyclooxygenase)Die Genexpression trägt zu dem durch Hypoxie induzierten Anstieg von iPGE in proximalen tubulären HK-2-Zellen bei.(a)Der Ausdruck von COX-2(Cyclooxygenase)Protein wird vorübergehend durch erhöhtHypoxie(Western-Blot-Analyse). Einschub: Expression mPGES-1-Protein wird auch vorübergehend hochreguliert durchHypoxie. (b)Ausdruck COX-2(Cyclooxygenase)mRNA wird vorübergehend durch erhöhtHypoxie. Einschub: Die Expression von mPGES-1-mRNA wird nicht beeinflusst vonHypoxie. (c)Prävention durch Celecoxib, ein COX-2(Cyclooxygenase)Inhibitor, des Anstiegs von iPGE, induziert durchHypoxie. Die Zellen wurden für 1 h mit 3 &mgr;M Celecoxib vorinkubiert. Links∶PGE,-abhängige Immunfluoreszenz allein oder kombiniert mit Kernfärbung mit DAPI wird gezeigt (ursprüngliche Vergrößerung, 40×). Rechts: Quantitativer Ansatz für die im linken Bereich präsentierten Bilder mit der Image J-Software. (d) Beitrag von Transkriptionsmechanismen. Links: Transkriptionsinhibitor Actinomycin D (Act. D) verhindert aHypoxie-induzierter COX-Anstieg-2(Cyclooxygenase)Proteinexpression (Western-Blot-Analyse). Die Zellen wurden für 1 h mit 1 ug/ml Act vorbehandelt. D bevor sie ausgesetzt werdenHypoxiefür 3 h. Rechts: Anstieg der Aktivität eines COX-2(Cyclooxygenase)Reporter-Konstrukt. (e) Inhibitor von HIF-la YC-1 verhindertHypoxie-induzierte transkriptionelle COX-2(Cyclooxygenase)Hochregulierung. Die Zellen wurden für 1 h mit 0,5 uM YC-1 vorinkubiert. Links: Prävention von COX-2(Cyclooxygenase)Hochregulierung. Zellen wurden ausgesetztHypoxiefür 8 Std. Mitte: Verhinderung der Zunahme der Aktivität eines COX-2(Cyclooxygenase)Reporter-Konstrukt. Rechts: Hemmung der Aktivität eines HRE-gesteuerten Reporterkonstrukts. Zellen wurden ausgesetztHypoxiefür 8 h. (f) Der HIF-la-Inhibitor YC-1 erhöht den apoptotischen Zelltod (durchflusszytometrische Studien). Bevor man ausgesetzt wirdHypoxiewurden die Zellen für 1 h mit 0,5 μM YC-1 vorinkubiert. Einschub∶ YC-1 hemmt dieHypoxie-induzierte Zunahme der HIF-1a-Expression (Western-Blot-Analyse). Allgemeine Informationen: (1) Die Zellen wurden 24 Stunden lang unter normoxischen (21 Prozent O,) oder hypoxischen (1 Prozent O,) Bedingungen inkubiert, wie unter „Methoden“ angegeben. (2) Mikrofotografien sind repräsentative Beispiele von drei unabhängigen Experimenten. (3) Western-Blot-Analyse: Gleiches Protein wurde durch Sondieren mit einem Anti- --Aktin-Antikörper bestätigt (4) Balken und Fehlerbalken in Diagrammen: Jeder Balken repräsentiert den Mittelwert ± SEM von 3 verschiedenen Experimenten *P<0.01 vs.="" other="">

Um den Beitrag von Transkriptionsmechanismen zum Anstieg von COX weiter zu untersuchen-2(Cyclooxygenase)Proteinexpression unterHypoxie, Ausdruck von COX-2(Cyclooxygenase)wurde in HK-2-Zellen bewertet, die vor der Behandlung mit dem Transkriptionsinhibitor Actinomycin D vorinkubiert wurdenHypoxiefür 5 Std. Wie in Abb. 3d gezeigt,Hypoxie-induzierter COX-Anstieg-2(Cyclooxygenase)die Proteinexpression wurde durch Actinomycin D verhindert.Hypoxieermittelte auch eine Zunahme der Aktivität eines COX-2(Cyclooxygenase)Promotorkonstrukt, das zuvor in HK-2-Zellen transfiziert wurde (Abb. 3d rechts). Zusammengenommen legen die in Fig. 3d gezeigten Ergebnisse nahe, dass Transkriptionsmechanismen zu a beitragenHypoxie-induzierter COX-Anstieg-2(Cyclooxygenase)Proteinexpression. Dennoch gab es eine Diskrepanz zwischen dem Zeitpunkt der Aktivierung des COX-2-Promotors und dem Zeitpunkt der maximalen COX-2(Cyclooxygenase)mRNA-Expression: während der vorübergehende Anstieg von COX-2(Cyclooxygenase)Die mRNA-Expression war nach 2 h maximal (Abb. 3b), der COX-2-Promotor wurde nach 3 h aktiviert (Abb. 3d), was wahrscheinlich den Beitrag posttranskriptioneller Mechanismen zum Anstieg der COX{{6) widerspiegelt }}(Cyclooxygenase)Ausdruck4. Dementsprechend spekulieren wir, dass COX-2(Cyclooxygenase)mRNA wird unter stabilisiertHypoxie, was zu erhöhten COX-Werten führen würde-2(Cyclooxygenase)mRNA-Expression ohne (zu diesem Zeitpunkt) Beitrag einer erhöhten Aktivität der COX-2(Cyclooxygenase)Promoter. Es ist jedoch auch möglich, dass eine Zeitverzögerung zwischen der Aktivierung des Promotors und der Akkumulation von messbarem Substrat ebenfalls zu der Diskrepanz zwischen dem Zeitpunkt der Aktivierung des COX-2-Promotors und dem Zeitpunkt der maximalen COX{{1) beitragen kann }}(Cyclooxygenase)mRNA-Expression.

HIF-1 ist ein heterodimerer Transkriptionsfaktor, der aus der sauerstoffabhängigen -Untereinheit und der konstitutiv exprimierten -Untereinheit besteht. UnterHypoxie, HIF-1 akkumuliert und gelangt in den Zellkern, wo es nach Dimerisierung mit HIF-1 den Transkriptionsfaktor HIF-1 erzeugt. HIF-1 fördert dann die Expression seiner Zielgene durch Bindung anHypoxie-Responsive Elements (HREs) sind in ihrer regulatorischen Region vorhanden und orchestrieren anschließend zelluläre adaptive Reaktionen auf den KampfHypoxie 3. Angesichts dessenHypoxiekann COX aktivieren-2(Cyclooxygenase)Expression in HIF-1--abhängiger Weise durch ein funktionelles HRE, das in der COX-2-Promotorsequenz vorhanden ist2, untersuchten wir die Rolle von HIF-1 in aHypoxie-induzierter COX-Anstieg-2(Cyclooxygenase)Ausdruck. Wir untersuchten auch die Aktivität eines COX-2-Promotorkonstrukts, das in HK-2-Zellen transfiziert wurde. Wie in Fig. 3e gezeigt, Vorinkubation mit HIF-1, einem Inhibitor YC-1, der stumpf wurdeHypoxie-induzierter Anstieg der HIF-la-Expression und Aktivität eines HRE-Reporterkonstrukts, führte zur Verhinderung des Anstiegs sowohl der Expression von COX-2(Cyclooxygenase)und Aktivität des COX-2(Cyclooxygenase)Promoterkonstrukt in HK-2 unterzogenHypoxie. Zusammenfassend stützen die in Abb. 3a-e gezeigten Ergebnisse die Vorstellung, dass HIF-1 --abhängige transkriptionelle Hochregulierung von COX-2(Cyclooxygenase)ist zuständig für dieHypoxie-induzierter Anstieg von iPGE2.

Obwohl die Folgen der Aktivierung von HIF-1a aufHypoxie-induzierte Apoptose umstritten sind (wahrscheinlich, weil sie kontextabhängig sein können), haben wir (vorläufig) die Rolle von HIF-1a in unserem experimentellen System analysiert. Da wir zuvor diesen Eingriff in die COX-2(Cyclooxygenase)/iPGE, EP-Rezeptorweg hemmt die Erhöhung der HIF-la-Expression, ausgelöst durchHypoxie8,56 fragten wir, ob die Hemmung von HIF-la zur Verhinderung von führtHypoxie-induzierte HK-2-Zellapoptose. Wie in Fig. 3f gezeigt, nahm die Vorinkubation mit YC-1, einem HIF-1-Inhibitor, tatsächlich zuHypoxie-induzierte Apoptose. Daher ist es unwahrscheinlich, dass HlF-la

Diskussion

GewebeHypoxiewird in der Pathophysiologie von sowohl chronischer Nierenerkrankung als auch akuter Nierenschädigung als von entscheidender Bedeutung angesehen, da PTC der anfälligste Teil der Nierentubuli istHypoxie. Hier untersuchten wir die Rolle von PGE bei dem verursachten SchadenHypoxiezu menschlichem PTC und fanden heraus, dass die erhöhte Produktion von iPGE von einer HIF-la-abhängigen Hochregulierung von COX herrührt-2(Cyclooxygenase)Genexpression und erhöhte Expression von mPGES-1, trägt dazu beiHypoxie-induzierter apoptotischer Zelltod in HK-2-Zellen. Angesichts der Tatsache, dass tubuläre Hypoxie ein relevanter Faktor sowohl für akute als auch für chronische Nierenerkrankungen ist-2, weisen diese Ergebnisse auf den Prostaglandin-Transporter PGT als neues therapeutisches Ziel bei Nierenerkrankungen hin.

Hypoxieerhöht nicht nur iPGE, sondern auch dessen Freisetzung in das extrazelluläre Medium8, so dass sezerniertes (extrazelluläres)PGE ebenfalls eine Rolle spielen könnteHypoxie-induzierte Apoptose (z. B. Auslösen apoptotischer Kaskaden durch die kanonische Aktivierung von EP-Rezeptoren, die sich an der Zellmembran befinden). Zwei frühere Studien haben gezeigt, dass der Zelltod unterHypoxiewar auch wegen COX-2(Cyclooxygenase)-abhängige Produktion von PGE,1345. Andererseits wird in bestimmten Zelltypen (Fibroblasten, Mikroglia, Neuronen und Zelllinien der akuten lymphoblastischen Leukämie) PGE.-induzierte Apoptose durch PGE.-abhängige Aktivierung von EP-Rezeptoren vermittelt 46-48. Das haben wir hier gefundenHypoxie-induzierte HK-2-Zellapoptose wurde ebenfalls durch Antagonismus von EP-Rezeptoren verhindert (Fig. 2a, oberes Feld, rechts). Aber weil EP-Rezeptoren klassischerweise als Plasmamembranrezeptoren beschrieben wurden – so dass sie für iPGE unzugänglich sind2-, spekulieren wir, dass die EP-Rezeptoren, die die apoptotische Wirkung von iPGE vermitteln, in hypoxischen HK-2-Zellen a Teilmenge, die sich intrazellulär befindet (dh iEP-Rezeptoren).

Im Gegensatz zur Rolle von iPGE2 inHypoxie-induzierte Apoptose in HK-2-Zellen fanden wir heraus, dass nur extrazelluläres PGE vermitteltHypoxie/Reoxygenierung-induzierten HK-2-Zelltod, weil er nicht durch Inhibitoren von PGT verhindert wurde (Fig. 2f). Obwohl die pathologischen Mechanismen der Zellschädigung nachHypoxie/Reoxygenation nicht vollständig verstanden sind, wird angenommen, dass der Zelltod größtenteils durch die Produktion von übermäßigen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erfolgt. Dies gilt insbesondere für HK-2-Zellen49,50. Wie auch immer, obwohlHypoxieauch die Produktion von ROS erhöhen kann, gibt es unseres Wissens nach keine Hinweise darauf, dass ROS eine Rolle spieltHypoxie-induzierter Tod von HK-2-Zellen. Dies deutet darauf hin, dass die tödlichen Wirkungen von Hypoxie und Hypoxie/Reoxygenierung in HK-2-Zellen durch unterschiedliche Mechanismen vermittelt werden, was erklären könnte, warum BG und BS davor schützenHypoxieaber nicht dagegenHypoxie/Reoxygenierung. Folglich könnte die Hemmung von PGT therapeutischen Nutzen bei PTC gegen Hypoxie-induzierte Zellschädigung bieten, aber nicht gegen die schädliche Wirkung vonHypoxie/Reoxygenierung.

HIF-1 -abhängige Hochregulierung von COX-2(Cyclooxygenase)war ein kritisches Ereignis fürHypoxie-induzierte HK-2-Zellapoptose (Abb. 3e). Unsere Beobachtung, dass der HIF-Inhibitor YC-1 den apoptotischen Zelltod verstärkt (Abb. 3f), ist jedoch rätselhaft, obwohl frühere Berichte bereits ähnliche Ergebnisse gezeigt haben1. Eine mögliche Erklärung ist ein hypothetisches Szenario, in dem HIF-la nicht nur die pro-apoptotische Hochregulierung von COX-2 vermittelt.(Cyclooxygenase)sondern auch die Hochregulierung von Schutzmolekülen. Tatsächlich regulierte HIF-1- die Expression von Schutzmolekülen dagegenHypoxiewie die lange nicht-codierende RNA DARS-AS1' und microRNA-2103 wurden spezifisch in HK-2-Zellen gefunden. Obwohl diese Beweisstücke unser hypothetisches Szenario stützen, sollten jedoch spezifische Experimente durchgeführt werden, um es zu bestätigen.

Untersuchung der Reaktion von Nierenzellen aufHypoxiekann unser Verständnis der Nierenpathologie verbessern. Wir haben, wenn auch in vorläufiger Weise, die Rolle einer Erhöhung des Expressionsverhältnisses des pro-apoptotischen Proteins Bax zum anti-apoptotischen Protein Bcl-2 untersuchtHypoxie-induzierte Apoptose in HK-2-Zellen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Hemmung von PGL nicht zu Veränderungen führte, die mit einer antiapoptotischen Verschiebung des Gleichgewichts zwischen der Expression von Bcl-2 und Bax (Abb. 2e) vereinbar waren, was eine Rolle dieser Proteine ​​​​in nicht unterstützt iPGE-abhängiger HK-2-Zelltod unterHypoxie. Nach unserem besten Wissen gibt es nur zwei Studien zur Auswirkung der Bcl{{0}}/Bax-Achse auf die durch Hypoxie induzierte Apoptose bei PTC, und beide betrafen anoxische" oder nahezu anoxische O,-Konzentrationen5 Wenn PTC 0,2 Prozent O. ausgesetzt wurde, blieb die Bax-Expression unverändert und die Apoptose war mit einem verringerten Grad der Bcl-2-Expression verbunden Vorhandensein von Apoptose, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.Daher sollten andere Mechanismen in Betracht gezogen werden, die nicht unbedingt quantitativeÄnderungen in der Bcl-2- oder Bax-Expression beinhalten: zum Beispiel erfordertdie Induktion von Apoptose in kultivierten Gliomzellen durch iPGE2 nur seine physikalische Assoziation mit Bax, die die Translokation von Bax zu Mitochondrien auslöst.202 Somit verdient der Mechanismus, durch den iPGE zur Apoptose von HK-2-Zellen beiträgt, weitere Untersuchungen.

Unsere Gruppe hat herausgefunden, dass ein COX-2(Cyclooxygenase)-abhängiger Anstieg von iPGE, vermittelt den apoptotischen Tod in HK-2-Zellen, die Cisplatin ausgesetzt sind, apoptotische Körperchen7" undHypoxie(unsere aktuellen Ergebnisse). Da PGE schnell nach außen aus der Zelle freigesetzt wird, nachdem es synthetisiert wurde2, spielt sein Transport nach innen durch PGI eine entscheidende Rolle bei der iPGE-induzierten Apoptose in HK-2-Zellen. Wann immer diese PTC-Schädigung durch iPGE vermittelt wird, könnte die Behandlung mit PGT-Inhibitoren daher ein nützlicher therapeutischer Ansatz mit potenziellen Anwendungen sein, wie z schädliche Wirkung vonHypoxieauf PTC.