Tubulosid B aus Cistanche Salsa rettet die neuronalen PC12-Zellen vor 1-Methyl-4-phenylpyridinium-Ionen-induzierter Apoptose und oxidativem Stress

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Guoqing Zheng, Xiaoping Pu, Li Lei, Pengfei Tu, Changling Li

Abstrakt:

Das NeuroprotektivumWirkungen von Tubulosid B aus Cistanche, eines der aus den Chinesen isolierten PhenylethanoideKräutermedizin Cistanche-Salsa, auf durch 1-Methyl-4-phenylpyridiniumionen (MPP plus ) induzierte Apoptose und oxidativen Stress in neuronalen PC12-Zellen untersucht. Mit MPP behandelte PC12-Zellen erlitten einen apoptotischen Tod, wie durch MTF-Assay, Durchflusszytometrie und DNA-Agarose-Gelelektrophorese bestimmt wurde; Die intrazelluläre Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) wurde durch DCFH-DA-Färbung mit konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (LSCM) gemessen. Die gleichzeitige Behandlung mit Tuhulosid B schwächte die MPP＋-induzierte Zytotoxizität, die DNA-Fragmentierung und die intrazelluläre Akkumulation von ROS deutlich ab. Diese Ergebnisse weisen stark darauf hin, dass Tubulosid B MPP-induzierte Apoptose und oxidativen Stress verhindert. Tubulosid B kann als ein angewendet werdenAnti-Parkinson-KrankheitAgenten.

Einführung

Pathologisch ist die sporadische Parkinson-Krankheit (PD) typischerweise durch einen Verlust katecholaminerger Neuronen, insbesondere dopaminerger Neuronen der Substantia nigra pars compacta (SNc), und das Vorhandensein charakteristischer Intraneuronen gekennzeichnet Einschlüsse, die Lewy-Körperchen genannt werden, in betroffenen Gehirnregionen. Obwohl eine Vielzahl von Faktoren an der Pathogenese von PD beteiligt sind, bleiben die Mechanismen, die an der Initiierung und Progression von PD beteiligt sind, ungewiss. Auch wenn die Ursache von PD weiterhin geklärt ist, deuten mehrere Beweislinien stark auf die Beteiligung von oxidativem Stress hin, der schließlich führend ist zu neuronalem Tod oder Apoptose durch die übermäßige Bildung freier Radikale [1], [2], [3]. Die Tatsache, dass das nigrale dopaminerge System große Mengen an freien Radikalen produzieren kann und relativ geringe Mengen an antioxidativem Abwehrsystem hat, unterstützt diese Hypothese weiter. Sowohl In-vivo- als auch In-vitro-Studien zeigten eine durch oxidativen Stress vermittelte Neurotoxizität von MPP＋, einem aktiven Metaboliten von l-Methyl-4-phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) auf dopaminerge Neuronen [4 ], [5]. Die Beteiligung von freien Radikalen, die übermäßig durch oxidativen Stress produziert werden, als unmittelbare Ursache von neurodegenerativen Erkrankungen wie PD deutet auf eine zentrale Rolle von Antioxidantien hin. Tubulosid B (Abb. l) war eine der Phenylethanoidverbindungen, die aus den Stängeln von isoliert wurdeCistanche-Salsa. Frühere Studien hatten ergeben, dass viele Phenylethanoide, einschließlich Tubulosid B, eine starke Radikalfänger-Aktivität zeigten[6], [7].

In Anbetracht dieser Ergebnisse untersuchten wir in der vorliegenden Studie die Wirkung von Tubu]nside B auf die durch MPP plus induzierte Neurotoxizität in vitro unter Verwendung der Sympathikus-Phäochromozytom-Zelllinie PC12, die im Laufe der Jahre erfolgreich zur Untersuchung der neuronalen Funktion eingesetzt wurde [8]. [9].

Anti-Parkinson-Krankheit:Zistanche

Materialen und Methoden

Materialien

Tubulosid B ausCistanche-Salsawurde freundlicherweise von Dr. Li Lei (Department of Natural Products, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing, China) zur Verfügung gestellt. Die Reinheit der Verbindung betrug laut HPLC-Analyse mehr als 98 Prozent. Modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) von Dulbecco, Pferdeserum und fötales Kälberserum wurden von GIBCO BRL bezogen, 1-Methyl-Phenylpyridinium-Ion (MPP plus ), Poly-L-Lysin, 3-(4, 5 -Dimethylthiazol-2 -yl)-2,5- Diphenyltetrazoliumbromid (MTT), Propidiumiodid (PI), RNase A, Proteinase K und 2;7'-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) wurden von Sigma bezogen.

Zellkultur

PCI2-Zellen wurden in DMEM gehalten, das mit 10 % Pferdeserum, 5 % fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 ug/ml Streptomycin ergänzt war. Die Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator kultiviert, der mit 95 Prozent Luft und 5 Prozent CO2 bei 37 Grad belüftet wurde. Alle Experimente wurden 24-48 h nach dem Aussäen der Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden routinemäßig durch 0,25-prozentige Trypsinisierung geerntet, als sich die Zellen dem subkonfluenten Stadium näherten, und in 25-cm-Kulturflaschen, die im Verhältnis 1:8 aufgeteilt waren, ausplattiert.

Analyse der Zelllebensfähigkeit

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde unter Verwendung eines modifizierten MTT-Assays bestimmt, wie zuvor beschrieben [10], kurz gesagt, PC12-Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 104 Zellen pro Well ausgesät. Die Kulturen wurden 48 h lang gezüchtet, und dann wurde das Medium zu einem gewechselt, das verschiedene Konzentrationen von Tubulnsid B oder MPP＋ enthielt. Nach Inkubation für bis zu 48 h und 72 h wurde MTr-Lösung (5 mg/ml in DMEM) zu den 96--Well-Platten gegeben und die Zellen wurden für 4 h bei 37 Grad inkubiert. Nachdem das Medium entfernt worden war, wurden die Zellen und Farbstoffkristalle durch Zugabe von 200 &mgr;l DMSO solubilisiert, und die Absorption wurde bei 570 nm (540 nm als Referenz) mit einem Mikroplattenlesegerät Modell 550 (Bio-Rad) gemessen. Die Zelllebensfähigkeit wurde auch unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens analysiert. Die Zellen wurden gesammelt, vorsichtig pelletiert und mit einer 0,6-prozentigen Lösung von Trypanblau für 3 Regen gefärbt. Anschließend wurde der Anteil nicht gefärbter Zellen in zehn zufällig ausgewählten Mikroskopfeldern bewertet. Als positives Medikament wurden 100 ng／ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF) verwendet.

Nachweis von Apoptose durch Durchflusszytometrie

Apoptotische Zellen wurden durch Durchflusszytometrie unter Verwendung von Propidiumiodid (PI) nachgewiesen [11]. Kurz gesagt, etwa 1 × 106 Zellen, die mit Testsubstanzen inkubiert wurden, wurden durch Zentrifugation geerntet und einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit 70 Prozent Ethanol für 24 h bei - 20 Grad fixiert und einmal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann in 300 &mgr;l PBS resuspendiert, das 0,5 mg/ml RNase und 0,5 mg/ml PI enthielt. Nach einer weiteren Inkubation für 30 min im Dunkeln wurde eine Durchflusszytometrie mit einem FACScan (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt.

Wir wandten das Protokoll von Moore [12] an, das nur fragmentierte DNA isolierte, und die Experimente wurden normalisiert, indem eine gleiche Anzahl von Kulturen aus jeder Testgruppe verwendet wurde. Kurz gesagt, 3 × 106 Neuronen von jeder der behandelten Proben wurden in ausgewogener Salzlösung von Hank (1000 g für 10 min) gewaschen und die am Boden des Röhrchens gebildeten Pellets wurden homogenisiert mit 1 ml Lysepuffer (10 mM Tris bei pH 7,4, 5 mM EDTA, 1 Prozent Triton X-100) für 20 min auf Eis. Nach Zentrifugation bei 11 000 g für 20 Regen bei 4 Grad wurden Überstände, die fragmentierte DNA enthielten, entfernt und mit 20 mg/ml RNase A bei 37 Grad für 1 Stunde und 0,1 mg/ml Proteinase K bei 56 Grad verdaut für weitere 1 Std. Die fragmentierte DNA wurde unter Verwendung von Phenol und Chloroform extrahiert und bei 10,000g für 1 Regen bei 4°C zentrifugiert. Die wässrige Phase wurde in ein neues Eppendorf-Röhrchen überführt, mit 2 Volumina eiskaltem Ethanol gemischt und dann für mindestens 1 h auf -20 Grad gestellt, um DNA auszufällen. Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 15 000 g bei 4 Grad wurden die Überstände entfernt und die DNA-Pellets einmal mit 80 prozentigem Ethanol gewaschen (15.000 g für 15 Minuten bei 4 Grad), luftgetrocknet und in 20 μl TE gelöst Puffer bei pH 7,6. Die gesamte Probe wurde dann auf einem 1,5-prozentigen Agarosegel für 1 Stunde bei 85 V einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde untersucht und mit einem Ultra Violet Products Gel Documentation System (GELDOC-2000, Bio-Rad, USA) fotografiert.

Messung der intrazellulären ROS-Bildung

Die Bildung von intrazellulären Peroxiden wurde mit einem konfokalen Rasterlasermikroskop unter Verwendung einer nicht fluoreszierenden Verbindung, 2"7"-Dichlorfluoresceindiacetat (DCFH-DA) [13] nachgewiesen, das innerhalb der Zellen durch endogene Esterasen zur ionisierten freien Säure verestert wird, 2 ;7"-Dichlorfluorescein. 2",7-Dichlorfluorescin kann durch Hydroantioxidantien zu fluoreszierendem 2"7"-Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert werden. Die Zellen wurden mit 10 &mgr;M DCFH-DA für 30 Minuten bei 37 Grad inkubiert. Die Kulturen wurden zweimal mit Hanks ausgewogener Salzlösung gewaschen und in demselben Medium abgebildet. Die Bildgebung wurde unter Verwendung eines konfokalen Rasterlasermikroskops durchgeführt, DCF wurde bei 488 nm angeregt und der Emissionsfilter war ein 510-nm-Sperrfilter. Um einen gültigen Vergleich zu ermöglichen, wurden für alle Beobachtungen die gleichen Erfassungsparameter verwendet. Die optimale vertikale Position in der Mitte der Zellen wurde eingestellt, und dann wurde das Feld schnell gescannt. Da die Beleuchtung bei der Anregungswellenlänge von 488 nm aufgrund der Oxidation dieses Farbstoffs eine erhöhte Fluoreszenz verursachte, wurde jedes Feld genau gleich lange belichtet. Grundlinienwerte von nicht stimulierten Zellen wurden als Kontrollwerte verwendet, um sie mit MPP-behandelten Zellen in Gegenwart oder Abwesenheit von Tubulosid B zu vergleichen. Nach dem Scannen wurde die durchschnittliche relative Fluoreszenzintensität in 15-20 neuronalen Zellkörpern pro Mikroskopfeld in vier quantifiziert getrennte Kulturen pro Behandlungszustand.

Zistanche

statistische Analyse

Alle erhaltenen Werte wurden als Mittelwerte ±SD ausgedrückt. Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Gruppen wurde durch den Student-t-Test bestimmt; Berechnete p-Werte von weniger als 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse

Wie in Abb. 2 gezeigt, erzeugte MPP plus eine dosisabhängige Abnahme der Lebensfähigkeit der PCI2-Zellen. Im Gegensatz dazu führte EGF, ein bekannter neurotropher Faktor, zu einem signifikanten Schutz der Zelllebensfähigkeit bei 100 ng/ml MPP＋-induzierte zytotoxische Wirkungen wurden auch in Gegenwart von Tubulosid B abgeschwächt (5, 10, 50 oder 100 ug-ml-1 ), wenn auch mit geringerer Wirksamkeit als das Referenzarzneimittel (Abb. 3)． Tubulosid B zeigte bei diesen Konzentrationen dosisabhängige zytoprotektive Wirkungen und die Verbindung allein verursachte keine offensichtliche Zytotoxizität (Daten nicht gezeigt)． Gelelektrophorese des DNA-Extrakts von PCI 2-Zellen, die 48 h mit 200 µM MPP plus behandelt wurden, zeigte DNA-Laddering. ein klassisches Kennzeichen der Apoptose, Tubulosid B, führte bei Dosen von 10 und 100 μg·ml-1 zur Bildung der DNA-Leiter (Abb. 4). Abb. 5 zeigt typische Histogramme der durchflusszytometrischen Analyse des durch MPP induzierten apoptotischen Zelltods in PC12-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von Tubulosid B．Quantifizierung des Zellzyklusprofils mit PI ergab die Anzahl der Zellen mit subdiploiden Merkmalen (M1-Region), was auf apoptotische DNA-Fragmentierung hinweist． In unbehandelten Zellen war die apoptotische subdiploide Fraktion minimal bis zu 5–94 % von insgesamt 10000 Zellen (Abb. 5 A). Nach 48 h Exposition gegenüber MPP＋ stieg der Prozentsatz der Apoptose auf 43．02;j; (Abb. 5 B)． Bei Zugabe zur Zellkultur hemmte Tubulosid B die MPP-induzierte Apoptose dosisabhängig. Bei einer Konzentration von 10 ug·ml-1 war der Schutz durch Tubulosid B nicht statistisch signifikant, aber bei 50 und 1 00ug·ml-1, eine 45％ bzw. 63％ Abnahme． wurde beobachtet, was zu einem Anstieg des Prozentsatzes überlebender Zellen führte (Abb. 5D, E).

Die Akkumulation von intrazellulärem ROS kann durch die Verwendung von DCFH-DA nachgewiesen werden. PC12-Zellen, die 48 Stunden lang mit 200 uM MPP behandelt wurden, zeigten nach Färbung mit DCFH-DA-Farbstoff eine intensive Fluoreszenz innerhalb der Zelle (Abb. 6). Die gleichzeitige Behandlung mit Tubulosid B (in Dosen von 10 und 100 ug·ml) hemmte die durch MPP＋一 induzierte ROS-Produktion (reduzierter Prozentsatz betrug 24．52％ bzw. 55．63％)．

Diskussion

Die Pathogenese von PD beinhaltet starken oxidativen Stress, reduzierte Antioxidantienspiegel und mitochondriale Defekte. alle sind dafür bekannt, Apoptose in mehreren zellulären Systemen zu induzieren. Insbesondere wurde gezeigt, dass freie Radikale den aktiven Zelltod in Neuronen auslösen[14]． MPTP erzeugt ein irreversibles und schweres Parkinson-ähnliches Syndrom, das beim Menschen eine selektive Degeneration der nigrostriatalen dopaminergen Neuronen verursacht. Dieses Neurotoxin wurde verwendet, um Tiermodelle von PD zu erstellen. wo es den mitochondrialen Komplex I und diese mitochondrialen Tage hemmt. Funktion verursacht Apoptose[16]．Daher wurde MPP plus β-induzierte Neurotoxizität in dopaminergen Neuronen ausgiebig als ätiologisches Modell von PD zum Screenen von neuroprotektiven Wirkstoffen verwendet．

In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass der durch MPP plus induzierte Zelltod durch oxidativen Stress in PC12-Zellen durch Tubulosid B reduziert wurde. Weiterhin haben wir gezeigt, dass Tubulosid B auch in einer dosisabhängigen Weise vor dem durch MPP plus induzierten DNA-Laddering schützt und Apoptose, gemessen unter Verwendung von DNA-Gelelektrophorese und durchflusszytometrischer Analyse. Darüber hinaus hemmte die gleichzeitige Behandlung mit höheren Konzentrationen von Tubulosid B die MPP-induzierte ROS-Produktion. Somit hat Tubulosid B multifunktionale neuroprotektive Wirkungen gezeigt. An den Wirkungen von Tubulosid B können mehrere Mechanismen einzeln oder in Verbindung beteiligt sein. Die antioxidative Wirkung ist ein möglicher Mechanismus für die durch Tubulosid B vermittelte Neuroprotektion. Xiong Q fand heraus, dass Tubulosid B eine starke Aktivität zum Abfangen freier Radikale auf das 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl-Radikal und das von Xanthin]Xanthinoxidase erzeugte Superoxid-Anion-Radikal zeigte [6].

Von mehreren Phenylethanoiden wurde kürzlich berichtet, dass sie freie Radikale fangende Eigenschaften besitzen und durch oxidativen Stress verursachte toxische Verletzungen schützen. Durch MPP plus produzierte ROS wie Wasserstoffperoxid, Superoxidanion und Hydroxylradikale schädigen leicht biologische Moleküle, was letztendlich zu apoptotischem oder nekrotischem Zelltod führen kann. Somit kann Tubulosid B direkte Abfangwirkungen gegen ROS haben. Obwohl unsere Daten nicht den genauen Ort festlegen, an dem Tubulosid B zur Unterdrückung der ROS-Akkumulation wirkt, deuten sie doch darauf hin, dass der neuroprotektive Mechanismus die Stimulation von Antioxidantien-Wegen beinhaltet. Eine Untersuchung der Molekularstruktur von Tubulosid B weist auch darauf hin, dass es eine starke Fähigkeit besitzt, freie Radikale abzufangen (persönliche Mitteilung).

Andere Mechanismen könnten ebenfalls relevant sein. Zum Beispiel kann Tubulosid B die Fähigkeit haben, der Toxizität von MPP entgegenzuwirken＋, indem es die Öffnung der mitochondrialen Permeabilitätsübergangspore und -dysfunktion hemmt. Darüber hinaus sollte auch geprüft werden, ob Tubulosid B eine direkte wachstumsfördernde Wirkung auf neuronale Zellen hat. Der genaue Mechanismus der neuroprotektiven Wirkung von Tubulosid B bleibt unklar. Zusätzliche Studien sind erforderlich, um das vollständige Bild seiner neuroprotektiven Wirkung aufzuklären.

Schlussfolgernd hat Tubulosid B aus Cistanche-Salsa-Extrakt offensichtliche schützende Wirkungen auf MPP plus -induzierte Apoptose und oxidativen Stress. Seine neuroprotektiven Wirkungen gegen MPP＋-Toxizität könnten wichtig sein und darauf hindeuten, dass es therapeutisches Potenzial bei der Prävention und Behandlung von PD haben könnte.

Behandlung von PD: cistanche

Verweise

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9. Yao Z, Drieu K, Szweda LI, Papadopoulos V. Freie Radikale und Lipidperoxidation vermitteln keinen Amyloid-induzierten neuronalen Zelltod. BrainRes 1999; 847: 203- 10

10. Yamamoto T, Yuyama K, Nakamura K, Kato T, Yamamoto H. Kinetische Charakterisierung der Stickoxidtoxizität für PC12-Zellen: Effekt der Halbwertszeit der NO-Freisetzung. EurJ Pharmacol 2000; 397:25-33

11. Nicoletti l, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani E Riccardi C. Eine schnelle und einfache Methode zur Messung der Thymozyten-Apoptose durch Propidiumiodid-Färbung und Durchflusszytometrie. J Immunol Methods 1991; 139: 271-9

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13. Mark RJ, Keller JN, Kruman I, Mattson MP. Basisches FGF dämpft durch Amyloidpeptid induzierten oxidativen Stress, mitochondriale Dysfunktion und Beeinträchtigung der Na ＋-K ＋ -ATPase-Aktivität in hippocampalen Neuronen. Hirnforschung 1997; 756: 205-14

14. Merad-Boudia M, Nicole A, Santiard-Baron D, Saille C, CeballosPicot L Mitochondriale Beeinträchtigung als frühes Ereignis im Prozess der Apoptose, die durch Glutathion-Mangel in neuronalen Zellen induziert wird: Relevanz für die Parkinson-Krankheit. Biochem Pharmaco11998; 56: 645-55

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16. Y. Mizuno, N. Sone, K. Suzuki, T. Saitoh. Studies on thetoxicity of 1-me ethyl-4-phenylpyridiniumion (MPP ＋) against mitochondrias of the mouse brain.J Neurol Sci 1988; 86: 97-110