Urin-Exosomen identifizieren Entzündungswege bei Vancomycin-assoziierter akuter Nierenverletzung

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 und im Namen der direkten Ermittler †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, USA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 School of Medicine, Universität von Kalifornien, San Diego, CA 92093, USA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Division of Renal Diseases and Hypertension, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, USA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 School of Medicine, University of Colorado, Aurora, CO 80045, USA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, USA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Michigan Medical System, Ann Arbor, MI 48109, USA; satishpr@med.umich.edu

* Korrespondenz: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Die Mitgliedschaft der direkten Ermittler ist in den Danksagungen angegeben.

Abstrakt:

Hintergrund:Vancomycin wird üblicherweise als Erstlinientherapie für grampositive Organismen wie Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus verwendet. Vancomycin-induzierte AkutNiereVerletzung(V-AKI) wurde bei bis zu 43 Prozent der Patienten berichtet, insbesondere bei Patienten mit höheren angestrebten Talspiegeln. Der genaue Mechanismus der Verletzung beim Menschen bleibt schwer fassbar, wobei neuere Beweise auf die Apoptose der proximalen Tubuluszellen gerichtet sind. In dieser Studie untersuchten wir den Proteingehalt von Harnexosomen bei Patienten mit V-AKI, um Biomarker für Verletzungsmechanismen und mögliche Reaktionen weiter aufzuklären. Methoden: Urinproben von Patienten mit V-AKI, die in die DIRECT-Studie aufgenommen wurden, und übereinstimmende gesunde Kontrollen aus dem UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository wurden in die Analyse eingeschlossen. Exosomen wurden unter Verwendung des Lösungsmittelausschlussprinzips und einer durch Polyethylenglykol induzierten Präzipitation extrahiert. Proteinidentität und -quantifizierung wurden durch markierungsfreie Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) bestimmt. Der mittlere Spitzenwert von Serumkreatinin betrug 3,7 ± 1,4 mg/dL und die Zeit bisNiereVerletzungbetrug 4,0 ± 3,0 Tage. Bei der Entlassung zeigten 90 Prozent der Patienten eine teilweise Genesung; 33 Prozent erholten sich bis zum 28. Tag vollständig. Proteomanalysen an fünf V-AKI- und 7 Kontrollproben ergaben 2009 Proteine ​​in allen Proben und 251 Proteine, die signifikant mit V-AKI assoziiert sind (Pi-Wert > 1). Die wichtigsten diskriminierenden Proteine ​​waren ComplementC3, Complement C4, Galectin-3--Bindungsprotein, Fibrinogen, Alpha-2-Makroglobulin, Immunglobulin Heavy Constant Mu und Serotransferrin.

Fazit:Exosomen im Urin zeigen eine Hochregulierung von entzündlichen Proteinen nach nephrotoxischer Verletzung bei V-AKI. Weitere Studien sind für eine große Patientenstichprobe erforderlich, um diese Ergebnisse zur Aufklärung pathophysiologischer Mechanismen und zur Validierung potenzieller Biomarker für Verletzungen zu bestätigen.

Schlüsselwörter:Vancomycin; AKI; Nephrotoxizität; Exosomen; Entzündung; ergänzen; Immunwege

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1. Einleitung

Vancomycin ist ein Glykopeptid-Antibiotikum, das zur Behandlung von Methicillin-resistenten Staphylococcus-aureus-Infektionen bei kritisch kranken Patienten eingesetzt wird. Nephrotoxizität ist ein schwerwiegendes unerwünschtes Ereignis, von dem 10–20 % der behandelten Patienten betroffen sind, und ist mit einer längeren Krankenhausaufenthaltsdauer, 30-Raten für Wiedereinweisungen in Tageskliniken und einer Gesamtmortalität an 30-Tagen verbunden [1]. Vancomycin-assoziierte akuteNiereVerletzung(V-AKI) ist dosisabhängig und setzt nach 4–17 Tagen Therapiebeginn ein. Obwohl V-AKI seit langem als Hauptnebenwirkung von Vancomycin gilt, sind die Mechanismen der Nephrotoxizität noch kaum verstanden. Das Verständnis der durch Vancomycin ausgelösten zellulären und molekularen Reaktionen ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis von Mechanismen und die Entwicklung von Strategien zur Minimierung des Risikos von V AKI und der damit verbundenen Kosten bei gleichzeitiger Maximierung seiner Wirksamkeit bei der Behandlung von Infektionen. Die toxische Nierenreaktion scheint durch eine direkte Wirkung von Vancomycin auf das Epithel der proximalen Tubuli verursacht zu werden [2]. Bisher wurden toxikogenomische Standardansätze angewendet, um V-AKI in Mausmodellen zu untersuchen, aber Studien am Menschen fehlen [3–5]. Tiermodelle zeigen, dass die Verabreichung von Vancomycin oxidativen Stress induziert, der zu Nierenschäden beitragen kann [6,7]. Ein möglicher Verletzungsmechanismus ist das Einfangen des Medikaments in den proximalen Tubuluszellen, da es von den organischen Kationentransportern (OCTs) über die basolaterale Membran und in die proximale Tubuluszelle transportiert wird, aber es wurden keine aktiven Efflux-Transportmechanismen identifiziert [6 –8].

Exosomen sind membranabgeleitete mikrozytische Vesikel, die eine Schlüsselrolle bei der interzellulären Kommunikation und der Protein-/Nukleinsäureabgabe spielen und das Potenzial für die Entdeckung neuer Biomarker bieten, um die klinische Diagnose von zu unterstützenNiereVerletzung[9]. Es wurde vorgeschlagen, dass Exosomen eine größere Spezifität und Sensitivität für die Entdeckung von Biomarkern aufweisen, was auf die Stabilität der Proben im Vergleich zu transkriptomischen und proteomischen Ansätzen unter Verwendung herkömmlicher Serum- und Urinproben zurückzuführen ist [9]. In dieser Studie haben wir die Hypothese getestet, dass die Veränderung der exosomalen Proteine ​​im Urin als Reaktion auf V-AKI hilft, Verletzungsmechanismen aufzuklären und neue Biomarker bei Patienten mit bestätigter arzneimittelinduzierter Nierenschädigung zu identifizieren. Dafür haben wir Probanden aus der Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT)-Studie eingesetzt, einer internationalen, multizentrischen Kohorte von klinisch entschiedenen Fällen von arzneimittelinduzierten akuten ErkrankungenNiereVerletzungund populationsbasierte Kontrollen, um pharmakogenomische Prädiktoren unter Verwendung einer genomweiten Assoziation zu untersuchen. Details der DIRECT-Studie sind im Abschnitt „Methoden“ und in einer aktuellen Veröffentlichung unseres Labors beschrieben [10].

2. Ergebnisse

Urinproben von 22 Probanden, 10 V-AKI-Fällen und 12 Kontrollen wurden in die Analysen eingeschlossen. Die demografischen Daten der Patienten waren bei V-AKI-Fällen und Kontrollen ähnlich und sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Wie erwartet war die Prävalenz von Bluthochdruck, Diabetes und Herzinsuffizienz bei V-AKI-Fällen höher als bei Kontrollen (Tabelle 1).

Alle V-AKI-Fälle entwickelten das AKI-Stadium 2 oder höher gemäß den Kriterien der Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) (Abbildung 1) [11]. Der Beginn der V-AKI erfolgte 4,0 ± 3,0 Tage nach Beginn der Behandlung mit Vancomycin. Der zeitliche Verlauf der Veränderungen des Serumkreatinins (Scr) nach der Krankenhausaufnahme bis zur Krankenhausentlassung und danach ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Veränderungen des Serumkreatinins im V-AKI-Verlauf. Diese Abbildung zeigt die Veränderungen des Serum-Kreatinins in 10 Fällen im Verlauf einer Vancomycin-assoziierten AkuterkrankungNiereVerletzungvon der Krankenhauseinweisung bis zum 90. Tag nach der Verletzung. Die Zeitpunkte entsprechen den Studienzeitpunkten des Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT). Abkürzungen: SCr=Serumkreatinin, Krankenhaus=Krankenhauseinweisung, Predrug=vor Arzneimittelexposition, DIRI=Arzneimittelinduzierte Nierenschädigungsdefinition erfüllt, DrugDC {{8} } Absetzen des Medikaments oder Dosisreduktion, Nadir Scr=niedrigstes Serum nach V-AKI, Hospital Disch= Entlassung aus dem Krankenhaus

Baseline-Risikofaktoren in V-AKI-Fällen umfassten Sepsis (30 Prozent), Herzerkrankungen (30 Prozent), Diabetes Mellitus (30 Prozent), Anämie (20 Prozent), Radiokontrast-Exposition (10 Prozent), Lebererkrankungen (10 Prozent) und Hypoalbuminämie (10 Prozent) (Abbildung 2).

V-AKI-Fälle hatten höchstens drei Vancomycin-Dosierungsepisoden erhalten. Die Tagesdosen von Vancomycin reichten von 1000 bis 4000 mg. Die mittlere (Interquartilbereich (IQR)) Anzahl der Tage, die in jeder Dosisepisode verbracht wurden, ist in Abbildung 3 dargestellt. 29,6 ± 16,3 bzw. 38,0 ± 13 mg/l. Der Konzentrationsunterschied zwischen den einzelnen Episoden war jedoch nicht statistisch signifikant (Episode 1 vs. 2 p=0.5, Episode 2 vs. 3 p=0.41).

Weitere Ergebnisdaten sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Angesichts der Schwere der Verletzung benötigten 20 Prozent der Patienten eine Nierenersatztherapie. Die Krankenhaussterblichkeit lag bei 10 Prozent. Nach der Entlassung aus dem Krankenhaus erholten sich 90 Prozent der Patienten nicht von V-AKI. Sechs Patienten hatten Scr am Tag 28 nach der Verletzung und vier am Tag 90. Am Tag 28 hatten zwei von sechs (33 Prozent) Patienten AKD, aber keiner der vier verbleibenden Patienten hatte am Tag 90 AKD.NiereBiopsien wurden in 20 Prozent der V-AKI-Fälle durchgeführt (Tabelle 2).

Die 12 Proben, die für Analysen geeignet waren, nachdem sie den Filter zum Abgleichen der Peptide mit ihren verwandten Spektren auferlegt hatten, enthielten insgesamt 2009 Proteine. Diese Proteine ​​wurden weiter analysiert. Zunächst wurde eine Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) durchgeführt, um das Gesamtproteom jeder Probe zu vergleichen. Diese Analyse ergab eine signifikante Trennung (PERMANOVA p-Wert=0.037) zwischen AKI- und Kontrollproben (Abbildung 4), was den Phänotyp auf systemischer Ebene auch auf Exosom-Proteinebene rekapituliert und somit unser Vertrauen in diese Datensätze erhöht . Die Stärke der Assoziation zwischen jedem Protein und dem V-AKI-Status wurde anhand der Pi-Wert-Metrik eingestuft, die die p-Wert-Signifikanz mit Fold-Change kombiniert [12].

Abbildung 4. Proteomzusammensetzung unterscheidet Urin-Exosomen von V-AKI-Patienten und Kontrollen. (A) Hauptkoordinatenanalyse von Probenproteomen. Die Bray-Curtis-Distanzmetrik wurde verwendet, um Unterschiede zwischen Probenproteomen zu berechnen, und ein Hauptkoordinatendiagramm ist gezeigt. Eine Trennung entlang der Achsen 1 und 3 wurde zwischen AKI-Proben (rot) und Kontrollproben (blau) beobachtet. (B) Boxplot, der den Bray-Curtis-Abstand zwischen Kontroll- und AKI-Proben zusammenfasst. Die in (A) gezeigte statistische Trennung zwischen AKI und Kontrollproben wurde unter Verwendung eines Permutationsanalyse-Varianztests (PERMANOVA) getestet. Boxplots werden gezeigt, die die Ergebnisse zusammenfassen, wenn die Abstände von Kontroll- oder AKI-Proben mit Kontrollproben verglichen werden.

Als nächstes ergaben binäre Vergleiche zwischen V-AKI- und Kontrollproben 42 Proteine, die signifikant mit dem AKI-Phänotyp assoziiert waren, und 26 Proteine, die mit dem Kontrollphänotyp assoziiert waren (Pi-Score > 1) (Ergänzungstabelle S1). Ein Vulkandiagramm, das die Signifikanz und Faltungsänderung jedes Proteins darstellt, ist in Abbildung 5A dargestellt. Die am stärksten diskriminierenden Proteine ​​für V-AKI-Fälle waren Fibrinogen, Komplement C3, Komplement C4, Galectin-3--bindendes Protein, Alpha-2-Makroglobulin, Immunglobulin Heavy Constant Mu und Serotransferrin (Abbildung 5B). Unter signifikanten Proteinen wurde eine Genset-Anreicherungsanalyse durchgeführt, um Kategorien von Proteinen zu identifizieren, die bei V-AKI-Patienten verändert wurden, und die Ergebnisse sind in der Ergänzungstabelle S1 zusammengefasst. Es wurde gezeigt, dass mehrere Proteine, die mit dem AKI-Phänotyp assoziiert sind, Funktionen haben, die mit der Entzündung und/oder dem vermittelnden Entzündungsphänotyp verbunden sind. Um zu testen, ob diese Proteinveränderungen mit Veränderungen in der zugrunde liegenden Zytokin-Signalgebung in Zusammenhang stehen könnten, wurde eine Zytokin-Inferenz durchgeführt, die auf eine starke Beziehung zwischen AKI-assoziierten Proteinen und den Zytokinen IL10, IL6 und TNF hinwies. Diese Zytokine enthielten 2,8-, 2,3- und 2,1--mal mehr Verbindungen zu AKI-assoziierten Proteinen als zu Kontroll-assoziierten Proteinen, wie in Abbildung 5C zusammengefasst. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke von AKI-assoziierten Proteinen und abgeleiteten Zytokinen zeigten überwiegend proinflammatorische Verbindungen zwischen AKI-assoziierten Proteinen, wie in 5D zusammengefasst.

Abbildung 5. Assoziationen auf Proteinebene mit V-AKI. (A) Volcano-Diagramm, das die Fold-Change- und t-Test-Signifikanz jedes Proteins für den V-AKI-Status anzeigt. Die 10 wichtigsten Proteine, die mit AKI und dem Kontrollstatus assoziiert sind, sind in Blau bzw. Rot dargestellt. Andere assoziierte Proteine ​​basierend auf einem Pi-Score > 1 sind gelb dargestellt. (B) Ein Pi-Score, der sowohl die Fold-Change- als auch die t-Test-Signifikanz berücksichtigt, wurde für jedes Protein berechnet, und die Proteine ​​mit den stärksten Assoziationen werden aufgetragen. (C) Mit AKI assoziierte Topcytokine oder Kontrollproteine. Es wurde ein netzwerkbasierter Zytokin-Inferenzansatz gewählt, und die Zytokine, die die stärksten Anreicherungswerte entweder gegenüber AKI oder Kontroll-assoziierten Proteinen zeigen, werden gezeigt. Rote Balken stellen Zytokine dar, die mit AKI-assoziierten Proteinen verwandt sind, blaue Balken stellen Zytokine dar, die mit Kontroll-assoziierten Proteinen verwandt sind. (D) Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk von AKI-assoziierten Proteinen und AKI-angereicherten abgeleiteten Zytokinen. Der äußere Rand von Proteinknoten ist in Abhängigkeit von Assoziationen mit entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Zytokinen gefärbt. Die Größe jedes Knotens repräsentiert die Stärke der statistischen Assoziation jedes Proteins mit dem AKI-Status.

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3. Diskussion

Wir berichten über einen neuartigen Ansatz zur Verwendung von Exosomen im Urin, um pathophysiologische Mechanismen zu informieren, die an medikamenteninduzierten Prozessen beteiligt sindNiereVerletzungunter Verwendung von Vancomycin als prototypischem Nierengift. Eine der Stärken dieser Studie ist die Einbeziehung gut charakterisierter Daten auf Patientenebene aus der DIRECT-Studie [10], die entwickelt wurde, um Mechanismen einschließlich der Genomik von arzneimittelinduzierten Erkrankungen aufzuklärenNiereVerletzung. Patienten mit AKI im Stadium 2 oder höher waren zu Studienbeginn konventionellen Risikofaktoren ausgesetzt. Alle Studienteilnehmer hatten signifikant erhöhte Plasma-Talspiegel von Vancomycin, obwohl sie Tagesdosen erhielten, die unter dem allgemein akzeptierten Nephrotoxizitäts-Schwellenwert von 4 g pro Tag lagen [13]. Viele Probanden erholten sich bei der Entlassung aus dem Krankenhaus nicht vollständig von V-AKI und litten im Monat nach der Verletzung an einer akuten Nierenerkrankung. Wie erwartet erhielten nur wenige Patienten eine Nierenbiopsie.

Exosom/extrazelluläre Vesikel (EV)-Proteomik im Urin zeigte, dass die gezielten diskriminierenden Proteine ​​für V-AKI-Fälle C3-Komplement, C4-Komplement, Galectin-3--bindendes Protein, Fibrinogen, Alpha-2-Makroglobulin, Immunglobulin schweres konstantes mu umfassten und Serotransferrin. Diese Exosomenbefunde informieren über Verletzungsmechanismen auf subzellulärer/supramolekularer Ebene für V-AKI und dienen möglicherweise als Biomarker entlang des Kontinuums des medikamenteninduzierten Krankheitsprozesses.

Exosomen, die in Blut und Urin vorhanden sind, spielen eine wichtige Rolle bei der interzellulären Kommunikation, Gerinnung und Abfallentsorgung [14]. Nach toxinbedingter AkutNiereVerletzungkönnen Exosomen, die aus tubulären Epithelzellen freigesetzt werden, Verletzungssignale übermitteln, um die Infiltration von Makrophagen zu rekrutieren und eine tubulointerstitielle Entzündung zu fördern [15]. Wir argumentierten, dass sich der Proteingehalt von Exosomen zwischen V-AKI-Fällen und gesunden Kontrollen unterscheiden würde. 251 Proteine ​​waren in V-AKI fehlreguliert, und diese schienen überwiegend an den Entzündungs- und Gerinnungswegen beteiligt zu sein. Unter diesen 251 Proteinen zeigte unsere Analyse, dass C3-Komplement, C4-Komplement, Galectin-3--Bindungsprotein, Fibrinogen, Alpha-2-Makroglobulin, Immunglobulin Heavy Constant Mu und Serotransferrin signifikant mit V-AKI-Fällen assoziiert waren.

Basierend auf unseren Ergebnissen, dass C3 und C4 zu den am besten unterscheidenden V-AKI-Exosomenproteinen gehörten, schlagen wir vor, dass die Aktivierung eines Komplementsystems an der Vancomycin-induzierten renalen tubulären Verletzung beteiligt ist. Dies steht auch in guter Übereinstimmung mit der veröffentlichten Literatur, dass die Aktivierung des Komplementsystems eine Rolle bei der Immunkomplex-Glomerulonephritis und einer Vielzahl von Nierenerkrankungen spielt [16]. Komplementaktivierungs-vermittelter Nierenschaden bei AKI aufgrund von Ischämie oder Nephrotoxin-Exposition wurde mit systemischen Entzündungsereignissen in Verbindung gebracht, die eine entfernte Organverletzung und Patientensterblichkeit auslösen und dazu beitragen [17]. In Modellen der Ischämie-Reperfusion (IR)-Verletzung führen Hypoxie, ATP-Mangel und mitochondriale Schädigung zur Bildung freier Sauerstoffradikale bei Reperfusion [18]. Zytokine, Chemokine und Komplementaktivierung verstärken die Entzündung, was zu einer akuten tubulären Verletzung führt. Zusätzlich sind C3a- und C5a-Rezeptor-defiziente Mäuse vor IR-Schäden geschützt [19,20]. Es wurde gezeigt, dass IR-Schädigung die lokale Produktion von Komplementkomponenten durch hochreguliertNiereEndothel- und Tubuluszellen [16,21]. Mehrere Studien an Tiermodellen und menschlichen Probanden haben eine erhöhte Ablagerung von Komplementproteinprodukten wie C3 und C4 entlang der tubulären Basalmembran nach einem Trauma oder einer Verletzung in der identifiziertNiere. Es wurde festgestellt, dass diese erhöhten Ablagerungen nicht signifikant in der peritubulären oder glomerulischen Region vorhanden sind, sondern stark in der tubulären Membran konzentriert sind, wie in Biopsien von Menschen- und Tiermodellnieren zu sehen ist [17]. Exosomen und EVs können zirkulierende Komplementkomponenten transportieren, wenn die Komplementaktivierung fehlreguliert ist [22,23]. Mehrere zelluläre Experimente und klinische Beobachtungen haben bestätigt, dass freigesetzte EVs die Komplementproteine ​​tragen und modulieren und gleichzeitig ihre Produktion unter Entzündungsbedingungen auch die Anzahl der zirkulierenden Vesikel beeinflussen kann [23]. Diese gegenseitige Abhängigkeit der beiden Prozesse führt zu dem Schluss, dass EVs das Potenzial haben, Biomarkerquellen, Ziele und therapeutische Wirkstoffe für Komplement- und immunmodulatorische Verbindungen zu sein, die im Rahmen der Entzündungsmechanismen von AKI von hoher Relevanz sind. Unser Befund, dass die V-AKI-Proben im Vergleich zu gesunden Kontrollen, zeigt die Rolle von Immunantworten auf die direkte Toxizität von Vancomycin in Tubuluszellen der Niere. Zusätzlich zu all dem oben genannten Proteingehalt stellen aus Urin gewonnene Exosomen/EVs auch potenzielle nicht-invasive Biomarker als Alternativen zur Nierenbiopsie dar, um die Rolle des Komplementsystems bei arzneimittelinduzierten Erkrankungen zu erkennen und darüber zu informierenNiereVerletzung.

Obwohl sich viele frühere Studien (siehe die nächsten Sätze für spezifische Referenzen) auf die Rolle von Galectin-3 (Gal-3) in konzentriert habenNiereVerletzung, gibt es nur wenige Daten zum Galectin-3-Bindungsprotein (Gal-3-bp). Gal-3 wird in den Sammelrohren der Niere exprimiert und fördert die Nephrogenese, moduliert Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen und reguliert Entzündungen [24–26]. Hendersonet al. untersuchten die Rolle von Gal-3 bei Entzündungen und stellten fest, dass Gal-3 eine Schlüsselkomponente bei chronischen Entzündungen und bei wiederkehrenden Gewebeverletzungen ist. Es erleichtert das "Abmauern" von Gewebeverletzungen und verzögert die Ausbreitung der Verletzung [27]. Außerdem haben Nishiyama et al. zeigten bei Ratten mit ischämischer AKI, dass Gal-3-mRNA hochreguliert war, und die folgende Reperfusion, Immunhistochemie zeigte erhöhtes Gal-3 über Nephronsegmente hinweg [25]. Tsuchiyamaet al. fanden heraus, dass die Verabreichung von Gal-3 bei Ratten mit nephrotoxischer Serumnephritis zu einer Verringerung der Proteinausscheidung im Urin, Halbmondbildung und verringerter Infiltration von Makrophagen in Glomeruli führte [28]. Dies deutet darauf hin, dass Gal-3 nach einer ischämischen oder immunvermittelten Verletzung eine Rolle bei der Regeneration spielt. Als verwandter Partner von Gal-3 wäre die grundlegende Rolle von Gal-3-bp und der Grund für seine Hochregulierung bei nephrotoxischer Schädigung durch Vancomycin und andere Wirkstoffe ein zwingender Schwerpunkt zukünftiger Untersuchungen.

Unsere Studie ergab auch, dass alle drei Untereinheiten von Fibrinogen fehlreguliert sind, in guter Übereinstimmung mit den zuvor veröffentlichten Daten. Fibrinogen ist ein lösliches dimeres Plasmamolekül und jedes Dimer besteht aus drei Polypeptiden: Alpha, Beta und Gamma [29]. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Hämostase und Gerinnung, hat sich aber auch als wichtig bei der Regulierung von Entzündungszuständen erwiesen [30–32]. Ajayet al. zeigten, dass die Verfügbarkeit von Fibrinogen für die Nierenfunktion, Entzündung und das Überleben wichtig ist [33]. Darüber hinaus könnte Fibrinogen eine antiadhäsive Wirkung auf Nierenepithelzellen haben, was vorteilhaft sein kann, indem es hilft, eine tubuläre Obstruktion zu verhindern [34]. Fibrinogen ist bei AKI signifikant erhöht und hochreguliert und wurde zuvor als potenzieller Biomarker für die Früherkennung von AKI evaluiert [29]. Hoffman et al. untersuchten die Veränderung des Fibrinogens nach Ischämie/Reperfusion und Cisplatin-Verabreichung bei Ratten, und die mRNA wurde 30 min nach einer bilateralen IR-Verletzung hochreguliert und erreichte einen Höhepunkt bei 48–72 h, während bei der Cisplatin-Verabreichung die mRNA-Expression von Fibrinogen war nach 24 h nachgewiesen [29]. Fibrinogen im Urin wurde bereits 3 Stunden nach der ischämischen Reperfusionsverletzung und 24 Stunden nach der Cisplatin-Verabreichung nachgewiesen, was einem starken Anstieg von entsprichtNiereVerletzungMolekül 1 (KIM-1) [29].

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Historisch wurden zwei verschiedene pathophysiologische Mechanismen für V-AKI allgemein anerkannt, akute tubuläre Nekrose durch direkte toxische Wirkungen und akute interstitielle Nephritis. Bei akuter tubulärer Nekrose erleidet das proximale tubuläre Nierenepithel einen Verlust der Zytoskelettintegrität, Nekrose und Apoptose [35]. Nekrotische Zellen setzen Moleküle frei, die das angeborene Immunsystem hochregulieren, Entzündungen induzieren und tubuläre Verletzungen beschleunigen [35]. In der aktuellen Studie haben wir Entzündungsmarker in den Urin-EVs von Patienten mit V-AKI nachgewiesen. Darüber hinaus fanden wir eine proinflammatorische Beziehung zwischen den Zytokinen IL10, IL6 und TNF und unseren wichtigsten AKI-unterscheidenden Proteinen. Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass die Pathophysiologie von V-AKI eine tubuläre Toxizität mit Hochregulierung der Entzündung während des Zeitraums von 24–72 h nach der Verletzung ist.

Es gibt mehrere Einschränkungen unserer Studie. Die kleine Stichprobengröße von 22 Patienten, die männlich und überwiegend Kaukasier waren, schränkt die Verallgemeinerbarkeit unserer Ergebnisse auf andere Geschlechter, Rassen und Ethnien ein. Eine zweite Einschränkung unserer Studie bestand darin, dass die Exosom-Urinprobe jedes Patienten unterschiedliche Mengen an Gesamtprotein aufwies, was die Messung spezifischer Proteine ​​erschwerte, insbesondere bei solchen mit niedrigeren absoluten Mengen. Obwohl dies nicht unbedingt die Einschränkung dieser Studie an sich ist, da die Fähigkeit jedes Individuums, Proteine ​​​​auf ihre Urin-Exosomen zu packen, von Natur aus unterschiedlich ist, schränken die geringeren Mengen an Proteinen bei einigen Personen unsere Fähigkeit für weitere Analysen und aussagekräftige Schlussfolgerungen ein, die verallgemeinert werden können größere Populationen. Eine dritte Einschränkung ist die Stichprobe zu einem einzigen Zeitpunkt, die unser Verständnis von zellulären Veränderungen einschränkt, die in verschiedenen Phasen des AKI-Kontinuums auftreten, z Veränderungen, oxidativer Stress, der durch die Akkumulation von Medikamenten induziert wird, und Hochregulierung der Immunwege in Reparatur. Die aktuelle Studie umfasste Patienten gemäß Definition der Scr-Schwellenwerte. Serum-Kreatinin ist ein unvollkommener Biomarker für die Nierenfunktion, da Erhöhungen von Scr häufig hinter der Verletzung zurückbleiben [36]. Dies schränkt die Sensitivität und Spezifität von Scr auf einen frühen Nachweis einNiereVerletzung[36], und Studien sind zur Identifizierung aufgetauchtNiereVerletzungBiomarker wie zNiere VerletzungMolekül 1 (KIM1) und Neutrophilen-Gelatinase-assoziiertes Lipocalin (NGAL) zur Früherkennung von Nephrotoxizität [37,38]. Wie bereits berichtet, haben Biomarker das Potenzial, sowohl offenkundige als auch subklinische Mengen arzneimittelinduzierter Substanzen zu erkennenNiereVerletzung[39,40].

4. Materialien und Methoden

4.1. Patientenauswahl

Urinproben von 10 Patienten mit V-AKI, die in die DIRECT-Studie aufgenommen wurden [10], und 12 gesunde Kontrollurinproben aus dem UAB-UCSD O'Brien Center Biorepository wurden in die Analyse eingeschlossen. Die Kontrollpersonen wurden nach Geschlecht, Rasse und Altersdekade den Studienpersonen zugeordnet und hatten keine Exposition gegenüber Vancomycin oder war bekanntNiereVerletzung. Die DIRECT-Studie ist eine internationale Studie, die die pharmakogenetischen Prädiktoren für arzneimittelinduzierte Erkrankungen untersuchtNiereVerletzungunter Verwendung einer genomweiten Assoziationsstudie von Fällen und populationsbasierten Kontrollen [10]. Die DIRECT-Studie wurde vom institutionellen Forschungsausschuss (IRB Nr. 121651) genehmigt und vor der Aufnahme wurde von allen Teilnehmern eine schriftliche Einverständniserklärung nach Aufklärung eingeholt, die die Bereitstellung der Verwendung gespeicherter Proben für zukünftige Analysen beinhaltete. AKI wurde in DIRECT als abrupte Verringerung der Nierenfunktion definiert, die durch eines der folgenden Kriterien nachgewiesen wurde: (1) absoluter Anstieg des Serumkreatinins (Scr) (größer als oder gleich 0,3 mg/dL oder größer als oder gleich 26,4 µmol/ L) (innerhalb von 48- h Zeitfenster) vom Scr-Referenzwert, (2) prozentualer Anstieg des Scr von mehr als oder gleich 50 Prozent (1,5-fach von der Referenz) innerhalb von sieben Tagen, (3) Verringerung des Urins Ausgang (dokumentierte Oligurie von<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) trotz angemessener Flüssigkeitszufuhr, falls zutreffend, (4) absolute Abnahme der Scr von größer als oder gleich 0,3 mg/dL oder größer als oder gleich 26,4 µmol/L (innerhalb von 48- h Zeitfenster) vom Referenz-Scr und (5) relative Abnahme des Scr von größer oder gleich 50 Prozent (1,5-fach gegenüber der Referenz) innerhalb von sieben Tagen. Patienten mit AKI im Stadium 2 oder höher nach Vancomycin-Exposition wurden in die Studie aufgenommen. Klinische Daten, einschließlich Demografie, Krankengeschichte, Befunde der körperlichen Untersuchung, Vitalfunktionen, Blut- und Urinchemie, Biopsieergebnisse und Daten zur Arzneimitteldosierung, wurden zu folgenden Zeitpunkten erhoben: (1) Krankenhausaufnahme, (2) Beginn der Vancomycin-Behandlung, ( 3) Höhepunkt der Verletzung, (4) Absetzen des Medikaments oder Dosisreduktion, (5) Auflösung der Verletzung, (6) Entlassung aus dem Krankenhaus, (7) 28 Tage und (8) 90 Tage nach der Verletzung. Eine Vancomycin-Dosierungsepisode wurde als Änderung der Dosis oder Häufigkeit definiert. Akute Nierenerkrankung (AKD) ist definiert als Persistenz von AKI im Stadium 1 oder größer größer als oder gleich 7 Tage nach der Exposition [41]. Patienten wurden bei Entlassung aus dem Krankenhaus als AKD kategorisiert, wenn das AKI-Stadium 1 oder höher anhielt und die Zeit von der Exposition bis zur Entlassung aus dem Krankenhaus länger als sieben Tage war. Von allen Teilnehmern wurden Urin- und Vollblutproben entnommen. Alle Fälle von V-AKI wurden von zwei unabhängigen Nephrologen (EM, JC, RL) beurteilt, um die Kausalität zu bestimmen. Eine vollständige Beschreibung der Methoden wurde bereits veröffentlicht [10].

4.2. Exosompräparation und proteomische Datenerfassung

Urin- und Blutproben wurden von DIRECT-Studienteilnehmern gesammelt und die Proben wurden vor der Exosomenpräparation bei –80 °C eingefroren. Die in dieser Analyse verwendeten Urinproben wurden aus dem Zeitraum ausgewählt, der der Niereninsuffizienz am nächsten lag, im Bereich von 24 bis 72 h nach der UntersuchungNiereVerletzung. Exosomen wurden aus gefrorenen AKI-Urinproben unter Verwendung eines internen Protokolls extrahiert, das auf der Grundlage des Lösungsmittelausschlussprinzips unter Verwendung von Polyethylenglycol (PEG)-induzierter Präzipitation entwickelt wurde, wie in Rao et al. Die kürzlich veröffentlichte Seite [42] der exosomalen Proteine ​​wurde vor der Geltrypsinisierung unter Verwendung von NuPAGE bisTris10-Prozent-Acrylamidgelen mit 12 Vertiefungen durchgeführt, um 40 &mgr;l Protein aus den Exosomen der Kontroll- und AKI-Urinproben aufzulösen.

Gelextrakte wurden mit einem Puffer kombiniert, um Proteolyse zu verhindern, der 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 Prozent Natriumdodecylsulfat (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM NaF enthielt (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM Beta-Glycerophosphat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM Beta-Glycerophosphat (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM Natrium Orthovanadat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM Natriumpyrophosphat (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) und 1× Complete Mini EDTA kostenlose Protease-Inhibitor-Tablette all in 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. Um Proteine ​​zu denaturieren, wurde ein gleiches Volumen von 8 M Harnstoff in 50 mM HEPES, pH 8,5, hinzugefügt, und es wurde eine Sondenbeschallung unter Verwendung von zwei 10--Intervallen bei 25 % Amplitude durchgeführt. Proteine ​​wurden reduziert, alkyliert und gequencht unter Verwendung von Dithiothreitol und Iodacetamid, wie zuvor beschrieben [43]. Proteine ​​wurden ausgefällt, indem Trichloressigsäure (Sigma, St. Louis, MO, USA) zu Proben auf Eis gegeben und Proteine ​​durch Zentrifugation bei 4 °C pelletiert wurden. Proteinpellets wurden zweimal mit eiskaltem Aceton gewaschen. Proteinpellets wurden bei 56 °C für 30 min getrocknet, dann in 1 M Harnstoff in 50 mM HEPES resuspendiert, dann über Nacht bei Raumtemperatur mit 6 µg LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, USA) verdaut, gefolgt von {{27} }h Verdau mit Trypsin für die Sequenzierung (Promega, Fitchburg, WI, USA) bei 37 ◦C. Proben wurden durch C18 Sep-Paks entsalzt und Proteine ​​wurden quantifiziert [44]. Insgesamt 1,0 ug Protein pro Probe wurden durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS [2]) unter Verwendung eines 85-minütigen Flüssigkeitschromatographiegradienten auf einem Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) analysiert. mit einem Massenspektrometer Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific) verbunden.

Die Chromatographie wurde an einer selbstgezogenen und gepackten 3{3}}-cm-Säule durchgeführt, die dreifach gepackt war mit 0,5 cm, 0,5 cm und 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18 bzw. 1,8 µm C18 und auf 60 ◦C erhitzt. Die Peptide wurden zuerst bei 500 bar geladen, gefolgt von einem Chromatographiegradienten im Bereich von 6 bis 25 % Acetonitril über 70 Minuten, gefolgt von einem 5-min-Gradienten bis 100 % Acetonitril, der 10 Minuten gehalten wurde. Die Elektrospray-Ionisation wurde durch Anlegen von 2000 V durch eine Edelstahl-T-Verbindung durchgeführt, die die analytische Säule und das Easy-nLC-System verband. Auf jede Probe folgten zwei Waschgänge, beginnend mit einem Gradienten von 3 bis 100 % Acetonitril über 15 min mit weiteren 10 min bei 100 % Acetonitril. Ein Masse-Ladungs-Bereich (m/z) von 375–1500 wurde nach Peptiden mit Ladungszuständen zwischen 2–6 gescannt. Für die Quantifizierung der Peaks wurden zentrierte Daten verwendet. Die Erfassung wurde in einem datenabhängigen Positiv-Ionen-Modus durchgeführt. Rohspektren wurden in Proteome Discoverer Version 2.1 gegen die Referenzdatenbank UniProt (www.uniprot.org (abgerufen am 5. November 2017)) für Homo sapiens unter Verwendung des Sequest-Algorithmus [18] zusammen mit einem umgekehrten Datenbankansatz zur Kontrolle von Peptiden und falschen Entdeckungen durchsucht Raten (FDR) auf 1 Prozent [17]. In silico Trypsin-Verdau, wie in den Suchparametern angegeben, zusammen mit einer Peptid-Mindestlänge von sechs Aminosäuren. Die Sucheinstellungen umfassten auch eine dynamische Modifikation für die Oxidation von Methioninen und eine statische Modifikation für die Carbamidomethylierung von Cysteinen. Die Vorläufer-Massentoleranz wurde auf 50 ppm und die Fragment-Massentoleranz auf 0,6 Da eingestellt.

Zusätzlich zu spektralen Übereinstimmungen und Proteinen, auf die beschränkt ist<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analyse von Proteomics-Daten

Aufzeichnungen der Proteomik-Datenanalyse wurden im Jupyter-Notebook-Format in ein Github-Repository hochgeladen (Zugriff am 3. März 2021)). Die Hauptkoordinatenanalyse (PCoA) wurde mit Qiime2 (Version 2019-7) [45] durchgeführt. Der Time Diversity Core-Metrics-Befehl wurde verwendet, um die Abstände zwischen den Proben unter Verwendung der Bray-Curtis-Metrik und der Visualisierung unter Verwendung eines PCoA zu berechnen. Die statistische Analyse der Abstände zwischen Kontroll- und V-AKI-Proben wurde unter Verwendung eines paarweisen PERMANOVA-Tests durch den Befehl „qiime diversity beta-group signifikant“ durchgeführt. Eine Boxplot-Visualisierung dieser Ergebnisse wurde über das Seaborn-Paket erstellt (Zugriff am 3. März 2021)). Binäre Vergleiche von V-AKI-Fällen und Kontrollpersonen wurden unter Verwendung des scipy-Pakets ( (Zugriff am 3. März 2021)) unter Verwendung eines unabhängigen t-Tests mit ungleicher Varianz durchgeführt. Die Stärke der Assoziation zwischen jedem Protein und dem V-AKI-Status wurde unter Verwendung der Pi-Wert-Metrik eingestuft, die die p-Wert-Signifikanz mit Fold-Change kombiniert [12]. Wie zuvor beschrieben [46] wurden hochrangige, signifikante Assoziationen mit einem pi-Wert > |1| definiert. Jede Proteinassoziation mit dem V-AKI-Status wurde in einem Vulkanplot dargestellt, um die Position der Proteine ​​mit dem höchsten Rang -10 weiter hervorzuheben. Die Genset-Anreicherungsanalyse wurde unter Verwendung des DAVID-Servers [47] durchgeführt, wobei signifikante Proteine ​​(pi-Wert > |1|) mit einem Hintergrund aller im Datensatz identifizierten Proteine ​​verglichen wurden. Cluster verwandter funktioneller Anreicherungen sind in der Ergänzungstabelle S1 angegeben.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Zytokine wurden zuerst gefiltert, um mindestens fünf Verbindungen zu signifikant veränderten Proteinen aufzuweisen. Dann wurde der Anteil an Verbindungen zwischen jedem Cytokin und V-AKI-assoziierten oder Kontroll-assoziierten Proteinen mit der Gesamtzahl an Verbindungen zwischen V-AKI oder Kontroll-assoziierten Proteinen verglichen. Um Unterschiede in der Anzahl der Verbindungen zu berücksichtigen, die jedes Cytokin mit anderen Proteinen hat, wurde dieser Wert als nächstes mit der Anzahl der Verbindungen verglichen, die jedes Cytokin mit allen signifikant veränderten Proteinen hatte. Die Anreicherungsbewertungen für ausgewählte Cytokine wurden für ihre Assoziationen mit entweder V-AKI- oder Kontroll-assoziierten Proteinen aufgetragen. Schließlich wurde eine verfeinerte Suche nach V-AKI-assoziierten Proteinen und den Zytokinen mit angereicherten Verbindungen zu V-AKI-assoziierten Proteinen für ihre Wechselwirkungen unter Verwendung von Cytoscape Version 3.5.1 visualisiert [50]. Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke wurden dekoriert, indem jedes V-AKI-assoziierte Protein gemäß seiner Pi-Score-Assoziation mit dem V-AKI-Status skaliert und durch eine abgeleitete Verbindung zu den angereicherten Zytokinen mit entzündungsfördernden oder entzündungshemmenden Wirkungen gefärbt wurde.

Drachenkräuter cistanchebehandeln kannNierenverletzung

5. Schlussfolgerungen

Wir versuchten, den Verletzungsmechanismus für V-AKI aus klinisch bestätigten Fällen besser zu verstehen, und stellten interessanterweise fest, dass Komplement, Galectin-3-bindendes Protein und Fibrinogen signifikant mit V-AKI assoziiert waren. Ergebnisse früherer Studien und unsere legen eine Rolle des Komplementsystems und der Entzündungswege bei V-AKI nahe. Während größere Studien erforderlich sind, um die molekularen Prozesse in den durch Vancomycin induzierten Schäden und den daraus resultierenden Reparaturwegen zu validieren, weisen die Ergebnisse darauf hin, dass Harn-Exosomen wichtige Informationen zu pathophysiologischen Mechanismen beitragen und als Biomarker für arzneimittelinduzierte dienen könnenNiereVerletzung.

Autorenbeiträge:

Konzeption, LA und SPR, Methodik, SV, SPR, DJG, RM; Software, DJG, RHM, Formalanalyse, LA, AL, RHM; Untersuchung, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; Schreiben – Erstellung des Originalentwurfs, AL, JA, VJ, LA; Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; Supervision, SV, SPR; Projektverwaltung, LA; Funding Acquisition, LA Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Finanzierung:

Diese Forschung wurde vom International Serious Adverse Events Consortium finanziert. MCT wurde durch T32 Training Grant DK007202 unterstützt.

Erklärung des Institutional Review Board: Die Studie wurde gemäß den Richtlinien der Deklaration von Helsinki durchgeführt und vom Institutional Review Board (oder Ethikkomitee) der University of California, San Diego Human Subjects Research Protections Program (IRB#121651) genehmigt.

Einverständniserklärung: Die Einverständniserklärung wurde von allen an der Studie beteiligten Probanden eingeholt

Danksagungen:

Wir möchten die Beiträge der DIRECT-Ermittler anerkennen: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjörg Rothe.

Interessenskonflikte:

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an.

Aus: „Urin-Exosomen identifizieren Entzündungswege bei Vancomycin-assoziierter akuter Nierenschädigung“ von Linda Awdishu

---Int. J.Mol. Wissenschaft. 2021, 22, 2784