Gesamtgenomsequenzierung zur Diagnose von neurologischen Wiederholungsexpansionsstörungen in Großbritannien: Eine retrospektive diagnostische Genauigkeit und prospektive klinische Validierungsstudie

Für mehr Informationen:ali.ma@wecistanche.com

Zusammenfassung

Hintergrund

Repeat-Expansion-Störungen betreffen etwa 1 von 3000 Personen und sind klinisch heterogene Krankheiten, die durch Expansionen von kurzen Tandem-DNA-Wiederholungen verursacht werden. Gentests sind oft ortsspezifisch, was zu einer Unterdiagnose von Menschen mit atypischen klinischen Präsentationen führt, insbesondere bei pädiatrischen Patienten ohne vorherige positive Familienanamnese. Die Gesamtgenomsequenzierung wird zunehmend als Erstlinientest für andere seltene genetische Erkrankungen eingesetzt, und wir wollten ihre Leistungsfähigkeit bei der Diagnose von Patienten mitneurologischDehnungsstörungen wiederholen.

Methoden

Wir bewerteten retrospektiv die diagnostische Genauigkeit der Sequenzierung des gesamten Genoms, um die häufigsten damit verbundenen Repeat-Expansion-Loci zu erkennenneurologischErgebnisse (AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, C9orf72, CACNA1A, DMPK, FMR1, FXN, HTT und TBP) unter Verwendung von Proben, die innerhalb des National Health Service in England von Patienten erhalten wurden, bei denen der Verdacht auf eine solche Erkrankung bestandneurologischStörungen; frühere PCR-Testergebnisse wurden als Referenzstandard verwendet. Die klinische Genauigkeit der Gesamtgenomsequenzierung zum Nachweis wiederholter Expansionen wurde prospektiv bei zuvor genetisch getesteten und nicht diagnostizierten Patienten untersucht, die 2013–17 für das 100 000 Genomes Project in Großbritannien rekrutiert wurden und bei denen der Verdacht auf eine genetische Veranlagung bestandneurologischStörung (familiäre oder früh einsetzende Formen von Ataxie, Neuropathie, spastische Paraplegie, Demenz, Motoneuronerkrankung,ParkinsonBewegungStörungen, geistige Behinderung oder neuromuskuläre Störungen). Wenn ein wiederholter Expansionsaufruf unter Verwendung von Gesamtgenomsequenzierung durchgeführt wurde, wurde PCR verwendet, um das Ergebnis zu bestätigen.

Ergebnisse

Die diagnostische Genauigkeit der Gesamtgenomsequenzierung zum Nachweis wiederholter Expansionen wurde anhand von 793 PCR-Tests bewertet, die zuvor im NHS von 404 Patienten durchgeführt wurden. Die Gesamtgenomsequenzierung klassifizierte 215 von 221 expandierten Allelen und 1316 von 1321 nicht-expandierten Allelen korrekt und zeigte eine Sensitivität von 97,3 Prozent (95-Prozent-KI 94,2–99,0) und eine Spezifität von 99,6 Prozent (99,1–99 ·9) über die 13 krankheitsassoziierten Loci im Vergleich zu den PCR-Testergebnissen. In Proben von 11 631-Patienten im 100 000 Genomes Project identifizierte die Gesamtgenomsequenzierung 81 Wiederholungsexpansionen, die auch durch PCR getestet wurden: 68 wurden als Wiederholungsexpansionen im gesamten pathogenen Bereich bestätigt, 11 waren keine -pathogene intermediäre Erweiterungen oder Permutationen, und zwei waren nicht-expandierte Wiederholungen (16 Prozent Falschentdeckungsrate).

Deutung

In unserer Studie zeigte die Sequenzierung des gesamten Genoms zum Nachweis von Wiederholungsexpansionen eine hohe Sensitivität und Spezifität und führte zur Identifizierung vonneurologischwiederholte Expansionsstörungen bei zuvor nicht diagnostizierten Patienten. Diese Ergebnisse unterstützen die Implementierung der Sequenzierung des gesamten Genoms in klinischen Labors für die Diagnose von Patienten mit aneurologischPräsentation im Einklang mit einer wiederholten Expansionsstörung.

Finanzierung

Medical Research Council, Department of Health and Social Care, National Health Service England, National Institute for Health Research und Illumina.

Einführung

Trotz der jüngsten Fortschritte in unserem Verständnis der genetischen Grundlagen seltenneurologischBei bis zu 70 Prozent der Patienten mit solchen Erkrankungen bleibt die genetische Diagnose unerkannt.1–3 Zum Teil liegt dies an den technischen Herausforderungen beim Testen auf komplexe und sich wiederholende genetische Varianten, einschließlich wiederholter Erweiterungen; solche Ausbreitungen betreffen schätzungsweise 1 von 3000 Personen (Anhang S. 1) und sind die Hauptursache für mehr als 40 neurogenetische Störungen,4 einschließlich der Huntington-Krankheit und des Fragile-X-Syndroms. Repeat-Expansion-Störungen sind klinisch und genetisch heterogen, und Repeat-Expansion kann mit verschiedenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Zum Beispiel können Expansionen in C9orf72 entweder als amyotrophe Lateralsklerose oder frontotemporale Demenz auftreten.5 Wiederholte Expansionen an verschiedenen Loci können auch ähnliche phänotypische Merkmale hervorrufen, was ihre klinische Unterscheidung erschwert: wiederholte Expansionen in mindestens zehn Genen für spinozerebelläre Ataxie, die häufig als Erwachsener vorhanden sind -onset Ataxia,6 und die in C9orf72 und AR können beide Motoneuronerkrankungen verursachen.7,8

Repeat-Expansion-Störungen werden durch eine Zunahme der Anzahl sich wiederholender kurzer Tandem-DNA-Sequenzen verursacht, und die Pathogenitätsschwellen für jede Störung sind locusspezifisch. Die Größe der Expansion variiert von weniger als 30 Wiederholungen (z. B. in CACNA1A) bis zu mehreren tausend Wiederholungseinheiten (z. B. in FMR1, DMPK, C9orf72 und FXN, die sich auf eine Größe von bis zu 5 kb erstrecken können). Repeat-Expansion weist eine molekulare Instabilität auf, die über Generationen und Gewebe hinweg zu Veränderungen der Repeat-Größe (im Allgemeinen zunehmende Länge) führen kann.4 Unter diesen Bedingungen führt eine Erhöhung der Anzahl von Repeats häufig zu einem früheren Ausbruch und schwereren Erkrankungen in der Folge Generationen.4 Das pädiatrische Auftreten von wiederholten Expansionsstörungen kann sich als Multisystemsyndrom ohne spezifische phänotypische Signaturen darstellen,9 und Kinder mit diesen Störungen werden daher mit größerer Wahrscheinlichkeit unterdiagnostiziert, wenn eine Familienanamnese mit wiederholter Expansionsstörung fehlt, als wenn sie vorhanden ist.10– 12

Die Laborbeurteilung wiederholter Expansionen beschränkt sich typischerweise auf die gezielte molekulare Beurteilung eines einzelnen Locus, geleitet von der vermuteten klinischen Diagnose, unter Verwendung von PCR-basierten oder Southern-Blot-Methoden,13 was kostspielig und zeitaufwändig sein kann. Darüber hinaus können aufgrund der unterschiedlichen und überlappenden phänotypischen Merkmale dieser Störungen krankheitsassoziierte Repeat-Expansion-Loci ungetestet bleiben.14

Die Sequenzierung des gesamten Genoms entwickelt sich zu einem diagnostischen Mittel der ersten Wahl bei Patienten mit seltenen Krankheiten15, aber bis vor kurzem wurde angenommen, dass sie nur begrenzt in der Lage sind, Loci zu beurteilen, die sich wiederholende Expansionen enthalten.16 Fortschritte in der Bioinformatik haben jedoch die Erkennung von Krankheiten möglich gemacht -Verursachen von Wiederholungsexpansionen aus Next-Generation-Sequenzierungsdaten.17–22 Hier berichten wir über die diagnostische Bewertung eines Gesamtgenom-Sequenzierungsansatzes zum Nachweis von Wiederholungsexpansionen unter Verwendung retrospektiver PCR-Daten und seine klinische Validierung bei Patienten im 100000 Genomes Project Who hatte eine vermutete neurologische Störung, die bei früheren Gentests nicht diagnostiziert wurde.

Methoden

Studiendesign und Teilnehmer

Diese Bewertung der Gesamtgenomsequenzierung zum Nachweis von Wiederholungsexpansionen umfasste sowohl diagnostische als auch klinische Genauigkeitsbewertungen. Die diagnostische Genauigkeit wurde anhand von Daten von Patienten bewertet, die zuvor mittels PCR auf wiederholte Expansionen getestet worden waren, von denen bekannt ist, dass sie neurologische Erkrankungen verursachen.4 Patienten wurden aus zwei Quellen identifiziert: dem 100 000 Genomes Project und dem Genomic Laboratory an den Cambridge University Hospitals ( Cambridge, Großbritannien). Bei beiden Patientengruppen wurden PCR-Tests an Patientenproben von Laboratorien des National Health Service (NHS) als Teil der routinemäßigen klinischen Bewertung durchgeführt: Für Proben im 100000-Genome-Projekt wurden PCR-Tests vor der Rekrutierung für das Projekt durch das durchgeführt Neurogenetik-Labor des University College London Hospital (London, UK); Proben mit PCR-bestätigten Wiederholungsexpansionen wurden von Patienten erhalten, die vom Genomic Laboratory in Cambridge getestet wurden. Patienten mit PCR-positiven und PCR-negativen Testergebnissen für wiederholte Expansionsstörungen wurden für die Aufnahme in unsere Studie durch Laboraufzeichnungssysteme identifiziert; Alle Patienten hatten eine schriftliche Einverständniserklärung zur Verwendung ihrer Probe für Qualitätssicherungs-, Forschungs- und Schulungszwecke im Rahmen der Optimierung und Validierung klinischer Dienstleistungen erteilt.

Die Gesamtgenomsequenzierung jeder Probe wurde in einem von zwei Labors durchgeführt: Genomics England (Hinxton, UK) für die Proben des 100000 Genomes Project (n=254) und das Illumina Clinical Services Laboratory (ICSL; San Diego, CA, USA) für Proben des Genomic Laboratory in Cambridge (n=150). Insgesamt wurde dieser Datensatz für den diagnostischen Genauigkeitsteil der Studie verwendet und bestand aus PCR- und Gesamtgenom-Sequenzierungsdaten von 404 Patienten, die 13 Loci abdeckten, die die häufigsten neurologischen Wiederholungsexpansionsstörungen darstellen: 11 Loci, die mit Ataxie und spätem beginnende neurodegenerative Erkrankungen (HTT, AR, ATN1, ATXN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, TBP, C9orf72 und FXN), ein Locus im Zusammenhang mit geistiger Behinderung (FMR1) und ein Locus im Zusammenhang mit myotoner Dystrophie (DMPK). Für jeden Locus waren PCR-Testdaten für mindestens ein expandiertes Allel verfügbar (Anhang S. 24).

Die klinische Genauigkeit wurde bewertet, indem die Übereinstimmung von Wiederholungsexpansionen, die durch Gesamtgenomsequenzierung nachgewiesen wurden, mit der klinischen Verdachtsdiagnose nach PCR-Bestätigung bei Patienten mit vermuteten genetischen neurologischen Störungen (familiäre oder früh einsetzende Formen von Ataxie, Neuropathie, spastische Paraplegie, Demenz) untersucht wurden , Motoneuronerkrankung,ParkinsonBewegungsstörungen, geistige Behinderung oder neuromuskuläre Störungen), die 2013–17 für das 100000 Genomes Project rekrutiert wurden. Das 100000 Genomes Project ist ein britisches Programm zur Bewertung des Werts der Gesamtgenomsequenzierung bei Patienten mit unerfülltem diagnostischem Bedarf bei seltenen Krankheiten und Krebs. Nach der ethischen Genehmigung des 100000-Genome-Projekts durch das East of England Cambridge South Research Ethics Committee (Referenz 14/EE/1112), einschließlich der Datenanalyse und der Rückgabe diagnostischer Befunde an die Patienten, wurden diese Patienten von medizinischem Fachpersonal und Forschern rekrutiert 13 Genomic Medicine Centres in England und wurden in das Projekt aufgenommen, wenn sie oder ihre Erziehungsberechtigten eine schriftliche Zustimmung zur Verwendung ihrer Proben und Daten für Forschungszwecke, einschließlich dieser Studie, gegeben haben. Probanden und, falls möglich, andere Familienmitglieder wurden gemäß den Eignungskriterien aufgenommen, die für spezifische seltene Erkrankungen festgelegt wurden (Anhang, S. 5–11). Die Patienten wurden für das 100000-Genome-Projekt nach standardmäßigen Gentests im NHS rekrutiert, wie in den Auswahlkriterien angegeben. Standardisierte klinische Ausgangsdaten wurden unter Verwendung von Human Phenotyping Ontology (HPO)23 gegen krankheitsspezifische Datenmodelle aufgezeichnet.24 Der Krankheitsstatus von Familienmitgliedern im Verhältnis zur klinischen Testindikation des Probanden wurde ebenfalls erfasst.

Um ursächliche wiederholte Ausbreitungen bei Patienten mit genetisch nicht diagnostizierter Krankheit zu identifizieren, testeten wir Patienten mit vermuteten genetischen Störungen, die mit einer wiederholten Ausbreitungskrankheit übereinstimmen. Die Patienten wurden auf der Grundlage der Übereinstimmung ihrer Krankheit und der HPO-Begriffe mit wiederholten expansionsbedingten Störungen ausgewählt. Die Gesamtgenom-Sequenzierungsdaten der Patienten wurden abgefragt, um nach Erweiterungen in bestimmten Sätzen von Repeats zu suchen, wobei vier verschiedene Repeat-Expansion-Panels gemäß ihren klinischen Merkmalen verwendet wurden (Anhang S. 5). Die Repeat-Expansion, die für die Einbeziehung in diese Panels ausgewählt wurden, sind die häufigsten neurologischen krankheitsverursachenden Loci der Repeat-Expansion. Patienten mit klinischen Merkmalen, die möglicherweise mit mehr als einer wiederholten Expansionsstörung vereinbar waren, wurden in mehreren Panels getestet. Wenn ein wiederholter Expansions-Call unter Verwendung von Gesamtgenomsequenzierung durchgeführt wurde, wurde ein Bestätigungstest durch PCR durchgeführt.

Für jeden Patienten mit einer bestätigten Wiederholungsexpansion wurde der örtliche Kliniker über das potenzielle diagnostische Ergebnis informiert und der Beitrag der Wiederholungsexpansion zu den klinischen Merkmalen des Patienten bewertet. Für wiederholte Erweiterungen, die die klinischen Merkmale des Patienten vollständig oder teilweise erklärten, wurde ein Diagnosebericht gemäß den lokalen Standardverfahren erstellt.

Verfahren

Für die historischen NHS-Proben, die im Teil der diagnostischen Genauigkeit unserer Studie verwendet wurden, wurden Wiederholungsexpansionen zuvor mit PCR-Amplifikation und Fragmentanalyse getestet. Southern-Blotting wurde für große C9orf72-Expansionen durchgeführt. Im Teil der klinischen Genauigkeit unserer Studie wurden Wiederholungsexpansionen, die durch Gesamtgenomsequenzierung bei Patienten des 100 000 Genomes Project entdeckt wurden, durch PCR in Proben getestet, die in NHS-Genlabors gelagert wurden. Weitere Einzelheiten, einschließlich Primersequenzen, sind im Anhang (S. 2–3, 25–26) enthalten.

Die DNA wurde für die Gesamtgenomsequenzierung mithilfe der TruSeq DNA PCR-Free-Bibliotheksvorbereitung vorbereitet, und die 150-bp- oder 125-bp-Paired-End-Sequenzierung wurde entweder auf HiSeq 2000- oder HiSeq X-Plattformen in der Hochdurchsatz-Genome-Einrichtung von Genomics England und am ICSL durchgeführt . Genome wurden bis zu einer durchschnittlichen Tiefe von 35× (31× bis 37×; Anhang S. 27) sequenziert. Short-Tandem-Repeat-Genotypisierung wurde unter Verwendung des ExpansionHunter-Softwarepakets Version 3.1.2.25,26 durchgeführt. Kurz gesagt, ExpansionHunter richtet Sequenzierungs-Reads über einen vordefinierten Satz kurzer Tandem-Repeats neu aus, um die Größe beider Allele eines Individuums abzuschätzen (Anhang S. 3).

Die Ausgabe von ExpansionHunter umfasst eine Schätzung der Anzahl der Wiederholungselemente, der Gesamtgröße und der Konfidenzgrenze für jeden bewerteten Locus. Richtlinien der Association for Medical Pathology und des College of American Pathologists empfehlen die visuelle Inspektion von Varianten-Calls während der routinemäßigen Bewertung von Hochdurchsatz-Sequenzierungsvarianten.27

Kurze Tandem-Wiederholungsvarianten können jedoch mit gängigen Visualisierungstools wie dem Integrative Genomics Viewer nicht angemessen visualisiert werden.28 Um die gesamten Genomsequenzierungsdaten zu untersuchen, die jedem Genotyp-Call zugrunde liegen, wurde ein Graph-Visualisierungstool verwendet, das eine direkte Visualisierung von Haplotypen und dem entsprechenden Read-Pileup ermöglicht von ExpansionHunter-Genotypen (Anhang S. 3, 15). An allen Short-Tandem-Repeat-Calls zur Sequenzierung des gesamten Genoms wurde eine visuelle Inspektion des Pileup-Diagramms durchgeführt, um zu bestätigen, dass die ExpansionHunter-Vorhersage für Allele vollständig in jedem Read enthalten war (dh die Wiederholungssequenz war kleiner als die Länge des Sequenz-Read); um das Vorhandensein einer monoallelischen oder biallelischen Expansion zu bestätigen; um vermeintliche falsch-positive Anrufe zu erkennen; und um falsch-negative Allele in biallelischen Wiederholungsexpansionen wie FXN nachzuweisen (Anhang S. 4, 16).

ExpansionHunter schätzt die Wiederholungsgröße anhand von Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms, indem Sequenzierungs-Reads analysiert werden, die ganz oder teilweise eine kurze Tandem-Wiederholung enthalten. Wenn ein kurzes Tandem-Repeat-Allel kürzer als die Read-Länge ist, sagt ExpansionHunter die genaue Größe voraus; Wenn ein kurzes Tandem-Repeat-Allel länger als die Read-Länge ist, schätzt ExpansionHunter die Repeat-Größe innerhalb eines CI, abhängig von der Zusammensetzung der Locus-Sequenz, der Sequenzierungstiefe und der Sequenzierungsqualität.

statistische Analyse

Wir klassifizierten Repeats als durch Gesamtgenomsequenzierung erweitert, wenn die von ExpansionHunter vorhergesagte Größe über dem Prämutations-Cutoff lag, oder als nicht erweitert, wenn die vorhergesagte Größe unter dem Cutoff lag (Anhang S. 28).

Sensitivität und CIs für die Erkennung von Repeat-Expansion durch Sequenzierung des gesamten Genoms wurden als Anteil der Allele mit erweiterten Repeats unter zuvor PCR-bestätigten Allelen mit erweiterten Repeats berechnet. Die Spezifität wurde als Anteil nicht-expandierter Allele unter zuvor getesteten nicht-expandierten Wiederholungen durch PCR geschätzt. Eine vollständige Beschreibung der statistischen Formeln befindet sich im Anhang (S. 1).

Um Wiederholungsgrößen durch PCR mit Schätzungen der Wiederholungsgröße durch Gesamtgenomsequenzierung zu vergleichen, wurden PCR-quantifizierte Allele mit Wiederholungsgrößen verglichen, die von ExpansionHunter für Allele vorhergesagt wurden, die kürzer als die Leselänge über alle 13 kurzen Tandem-Wiederholungsorte sind. Die Übereinstimmung wurde anhand des Prozentsatzes der von ExpansionHunter vorhergesagten Wiederholungsgrößen berechnet, die mit der PCR-quantifizierten Größe übereinstimmten, wobei der PCR-Fehler von plus oder minus einer Wiederholung berücksichtigt wurde. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung der Statistiksoftware R, Version 3.6.3, durchgeführt.

Rolle der Finanzierungsquelle

Das Studiendesign, die Patientenrekrutierung, die Datenerhebung und die Sequenzierung wurden von Mitarbeitern von Genomics England und akademischen Forschern geleitet. Mitarbeiter von Illumina führten die Sequenzierung von 150 Patientenproben als geplante Komponente der diagnostischen Genauigkeitsstudie der gesamten Genomsequenzierung durch und entwickelten ExpansionHunter. Mitarbeiter von Genomics England, akademische Forscher und die Koautoren RTH, ED und MAE führten die Analyse und Interpretation wiederholter Expansionen bei Patienten durch, die für das 100 000 Genomes Project rekrutiert wurden. Die Finanzierungsquellen spielten keine Rolle bei der Dateninterpretation oder dem Verfassen des Berichts.

Ergebnisse

Die diagnostische Genauigkeit der Gesamtgenomsequenzierung zum Nachweis von Repeat-Expansion wurde anhand von 793 PCR-Tests bewertet, die zuvor innerhalb des NHS bei 404 Patienten durchgeführt wurden (64 Patienten wurden auf mehr als eine Wiederholung getestet; Abbildung 1). Von diesen Tests wurden 183 als mit einer erweiterten Wiederholung und 610 als ohne eine Wiederholungserweiterung durch PCR klassifiziert, was insgesamt 221 erweiterte und 1321 nicht-erweiterte einzelne Allele über 13 Krankheitsloci ergab (Anhang S. 24, 28). Die Gesamtgenomsequenzierung klassifizierte 215 von 221 expandierten Allelen und 1316 von 1321 nicht-expandierten Allelen im Vergleich zu den PCR-Testergebnissen (Anhang S. 27, 29) korrekt und zeigte eine anfängliche Sensitivität von 97,3 Prozent (95-Prozent-KI 94,2–99 ·0) und eine Spezifität von 99,6 Prozent (99,1–99,9; Tabelle 1). Nach der visuellen Korrektur aller Calls basierend auf der Qualität der Reads stieg die Sensitivität auf 99,1 Prozent (96,8–99,9) und die Spezifität auf 100 Prozent (99,7–100; Abbildung 2A, Tabelle 1). Die Visualisierung der expandierten Allele ermöglichte die Erkennung falsch-positiver Ergebnisse und die Neuklassifizierung aller falsch-negativen Allele in FXN, von denen nur ein Allel in Proben mit biallelischen Expansionen korrekt als expandiert klassifiziert wurde (Anhang S. 17, 18).

Die Repeat-Länge wurde durch PCR in 509 PCR-Tests quantifiziert, bei denen 945 Allele über 13 Repeat-Expansion-Loci abgefragt wurden. Korrelationen zwischen ExpansionHunter und PCR für Wiederholungsgrößen, die kürzer und größer als die Sequenzierungsleselänge (dh 150 bp) sind, sind im Anhang (Anhang S. 19) gezeigt. Eine hohe Übereinstimmung wurde für Wiederholungen beobachtet, die kürzer als die Leselänge waren, mit einer Übereinstimmung von 92,7 Prozent (836 von 902) zwischen PCR und ExpansionHunter. Es wurde eine Locus-Variabilität beobachtet, mit hoher Übereinstimmung zwischen ExpansionHunter und PCR für ATXN2, ATXN7, CACNA1A und HTT und geringer Übereinstimmung für DMPK oder TBP (Anhang S. 30). Die Längen von Allelen, die größer als die Leselänge sind, wurden von ExpansionHunter unterschätzt, was die Genauigkeit des Calls in DMPK, FMR1 und FXN beeinträchtigte (Abbildung 2B, Anhang S. 19, 31).

Obwohl ExpansionHunter in der Lage war, große expandierte Allele in FMR1, DMPK, C9orf72 und FXN (Anhang S. 29) korrekt zu identifizieren, waren die vorhergesagten Größenschätzungen tendenziell niedriger als die durch PCR erhaltenen, da die Wiederholungsgröße innerhalb des pathogenen Bereichs zunahm, was die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen großen und kleinen Erweiterungen in DMPK, C9orf72 und FXN oder zwischen vollständigen Erweiterungen und Permutationen in FMR1 (Anhang S. 31). Beispielsweise hatten Loci mit einer PCR-bewerteten Wiederholungslänge von mehr als 200 Wiederholungen in FMR1 und als vollständige Mutation klassifiziert eine mittlere Wiederholungsgröße, die von ExpansionHunter auf 92,6 (SD 17,8; Anhang S. 31) geschätzt wurde.

Um die Fähigkeit der Erkennung von Wiederholungsexpansionen durch Gesamtgenomsequenzierung zu testen, um die Diagnose von zuvor getesteten und genetisch nicht diagnostizierten Patienten zu lösen, testeten wir 11 631 Patienten mit einer vermuteten genetischen neurologischen Störung, die für das 100000 Genomes Project (Abbildung 1) rekrutiert wurden. Die Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms wurden anhand von vier verschiedenen Repeat-Expansion-Panels gemäß den klinischen Merkmalen des Patienten ausgewertet. Die Anzahl der mit jedem der vier Panels getesteten Patienten ist in Tabelle 2 aufgeführt.

Insgesamt haben wir Wiederholungsexpansionen in Proben von 105 Patienten festgestellt und visuell bestätigt (Tabelle 2, Anhang S. 20, 33). Davon standen 81 Proben für Bestätigungstests durch PCR zur Verfügung, und bei 68 wurde bestätigt, dass sie eine Wiederholungsexpansion aufwiesen (0·6 Prozent Ausbeute): 45 (1,2 Prozent) von 3692 in Feld A, acht ({ {18}}·3 Prozent ) von 2743 in Feld B, fünf (0,6 Prozent ) von 860 in Feld C und zehn (0,1 Prozent ) von 6731 in Feld D. Dreizehn von 81 Erweiterungsaufrufen wurden nicht als pathogene Wiederholungsexpansionen bestätigt (16 Prozent Falschentdeckungsrate). Davon waren zwei nicht-expandierte Allele in ATXN1 und ATXN2, vier waren FMR1-Calls mittlerer Größe (Anhang S. 21) und sieben waren FMR1-Permutationen.

Klinische Details der 68 Patienten mit durch PCR bestätigter wiederholter Expansion, einschließlich ihrer klinischen Präsentation, der identifizierten wiederholten Expansion und des Beitrags der wiederholten Expansion zu den klinischen Merkmalen des Patienten, sind in Tabelle 3 aufgeführt; die HPO-Begriffe, die von ExpansionHunter geschätzte Wiederholungsgröße und ob ein Diagnosebericht ausgestellt wurde, sind im Anhang aufgeführt (S. 33).

Expansionen wurden bei Patienten mit einer Vielzahl sich überschneidender klinischer Präsentationen beobachtet, die mit Panel A (Tabelle 3, Anhang S. 22) getestet wurden, einschließlich einer wiederholten ATXN2-Expansion bei einem Patienten mit früh einsetzender Parkinson-Krankheit, die auf Levodopa anspricht, und einer Vorgeschichte mit progressiver zerebellärer Ataxie und AR-Erweiterungen bei vier Patienten mit klinisch diagnostizierter Charcot-Marie-Tooth-Krankheit, darunter einer mit einer genetisch bestätigten demyelinisierenden Neuropathie (dh Charcot-Marie-Tooth-Krankheit Typ 1, Patient 42; Anhang S. 33). Bei Patienten mit pathogenen Wiederholungsexpansionen wurde ein breites Spektrum früherer klinischer Diagnosen beobachtet.

Beispielsweise wurden bei sieben Patienten mit amyotropher Lateralsklerose oder einer anderen Motoneuronerkrankung Erweiterungen in AR (n=4) und C9orf72 (n=3) identifiziert. Bei Patienten mit Verdacht auf hereditäre Ataxie identifizierten wir Erweiterungen an Loci, die zum Zeitpunkt der Rekrutierung nicht im Rahmen der routinemäßigen diagnostischen Abklärung innerhalb des NHS untersucht worden waren, einschließlich ATN1, ATXN2, ATXN3, ATXN7, CACNA1A, FXN, TBP und HTT ( Tisch 3). Wir entdeckten auch wiederholte Expansionen bei Patienten mit klinischen Merkmalen, die mit alternativen Erkrankungen mit wiederholter Expansion vereinbar waren, einschließlich einer C9orf72-Expansion bei früh einsetzender und familiärer Parkinson-Krankheit (Patient 24, Tabelle 3) und wiederholte Expansionen im Bereich reduzierter Penetranz bei HTT (38 Wiederholungen). bei zwei Schwestern mit einer Bewegungsstörung, Demenz, Depression und Sprachschwierigkeiten (Patientinnen 44 und 45), was die diagnostische Herausforderung unterstreicht, die diese wiederholten Expansionsstörungen darstellen.

Bei acht Kindern, die mit Panel B getestet wurden, wurde festgestellt, dass sie große CAG-Wiederholungsexpansionen hatten (Abbildung 3), von denen sieben die klinischen Merkmale des Patienten vollständig erklärten. Sechs Patienten hatten keine aussagekräftige Familienanamnese und ihnen war zum Zeitpunkt der Rekrutierung kein erneuter Expansionstest als Teil ihrer klinischen Beurteilung angeboten worden (Patienten 48–53; Tabelle 3, Anhang S. 33). Zwei dieser Kinder trugen große HTT-Erweiterungen (90–100 CAG-Wiederholungen). Bemerkenswerterweise hatte ein Kind die Wiederholung von einem nicht betroffenen Elternteil ohne Familiengeschichte der Huntington-Krankheit geerbt. Familientests sind im Gange, aber in der Großfamilie wurde ein Allel mit reduzierter Penetranz identifiziert, was darauf hinweist, dass sich die Wiederholung um über 60 Wiederholungseinheiten in einer einzigen Generation (Patient 52) ​​ausgebreitet hatte. Zum Zeitpunkt des Verfassens dieses Artikels zeigte niemand in der Familie irgendwelche Anzeichen der Huntington-Krankheit, und genetische Beratung und Tests für die Eltern sind im Gange. Zwei Kinder unter 5 Jahren trugen große wiederholte Expansionen in ATXN7 und stellten sich mit einer komplexen Multisystemerkrankung vor. Bei einem dieser Kinder (Patient 50) zeigten die Eltern 2 Jahre nach der Aufnahme in das 100000-Genome-Projekt Gangprobleme. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, dass ein 10-jähriges Mädchen mit geistiger Behinderung eine 99-wiederholte Expansion in ATXN2 hatte, obwohl beide Elternteile als nicht betroffen eingestuft wurden, und bei einem 18-jährigen Mädchen mit Demenz wurde festgestellt, dass es ein 99- trägt. {19}}Wiederholen Sie die Erweiterung in ATN1 (Anhang S. 33).

Fünf Expansionen in DMPK (Tafel C) wurden festgestellt, darunter bei einem Kind und einer Mutter mit einer klinischen Diagnose von Muskeldystrophie, bei zwei Geschwistern mit Verdacht auf distale Myopathie und bei einem Jugendlichen mit angeborener Myopathie (Patienten 54–58). FMR1-Expansionen (Tafel D) wurden bei neun Jungen und einem Mädchen festgestellt, und eine Diagnose des Fragile-X-Syndroms erklärte die vorliegenden klinischen Merkmale vollständig oder teilweise (Patienten 59–68).

Diskussion

Die Diagnose wiederholter Expansionsstörungen ist im Gesundheitswesen eine Herausforderung aufgrund heterogener und sich überschneidender klinischer Merkmale und unspezifischer klinischer Befunde, die mit zunehmendem Alter und in jeder nachfolgenden Generation an Schwere zunehmen können. Wiederholte Expansionsstörungen gehören zu den häufigsten Ursachen für erbliche neurologische Erkrankungen.4 Dennoch können Patienten unterdiagnostiziert werden, entweder weil unzureichende Gentests durchgeführt wurden oder weil die ursächlichen genetischen Varianten noch entdeckt werden müssen. Die Testansätze sind derzeit fragmentiert, und bei Patienten könnte der falsche Repeat-Expansion-Locus getestet werden29 oder sie erhalten einen molekularen Test für eine andere Klasse von Varianten, da sich klinische Merkmale mit anderen neurologischen genetischen Störungen überschneiden.30

Die Sequenzierung des gesamten Genoms wurde in mehreren Situationen als diagnostischer Erstlinientest für seltene neurologische Erkrankungen verwendet, es wurde jedoch früher angenommen, dass sie eine geringe Fähigkeit zum Nachweis von Wiederholungsexpansionen besitzt.16 Es wurden mehrere Werkzeuge entwickelt, um Wiederholungsexpansionen aus dem gesamten Genom zu identifizieren Sequenzierung in der Forschung31, aber keiner dieser Ansätze wurde auf Sequenzierungsdaten des gesamten Genoms angewendet, die von einer großen Anzahl von Patienten in einer einzigen Gesundheitsversorgung gesammelt wurden. Wir legen Beweise dafür vor, dass ein Algorithmus, der darauf ausgelegt ist, Wiederholungsexpansionen aus der Gesamtgenomsequenzierung zu erkennen, die häufigsten krankheitsverursachenden Wiederholungsexpansionen zuverlässig beurteilen und zuvor genetisch nicht diagnostizierte Fälle in einer großen Kohorte von Patienten mit neurologischen Erkrankungen lösen kann. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Gesamtgenomsequenzierung zwischen nicht-expandierten und expandierten Allelen mit hoher Empfindlichkeit und Spezifität über 13 Repeat-Expansion-Loci unterscheiden kann (was durch visuelle Inspektion weiter verbessert werden kann) und die Größe von Allelen, die kleiner als die Leselänge sind, genau berechnen kann , und unterschätzen möglicherweise die Größe großer Erweiterungen in FMR1, DMPK, FXN und C9orf72.

Als der Nachweis wiederholter Expansionen durch Gesamtgenomsequenzierung mit positiven und negativen Ergebnissen verglichen wurde, die zuvor in klinisch-diagnostischen Genomlabors unter Verwendung von Goldstandardmethoden erhalten wurden, fanden wir eine Sensitivität von mindestens 97,3 Prozent und eine Spezifität von 99,6 Prozent. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass sowohl die Spezifität als auch die Sensitivität durch manuelle Kuration des Read-Pileups verbessert werden können, was die Erkennung falsch positiver Ergebnisse und die Neuklassifizierung falsch negativer Allele in Proben mit biallelischen Erweiterungen ermöglicht. Von den 6731 auf FMR1 getesteten Patienten (Tafel D) wurde für 124 Anrufe eine Ausweitung prognostiziert. Wir konnten 97 durch visuelle Inspektion als wahrscheinlich falsch positive Ergebnisse ausschließen. Dies weist darauf hin, dass 1 von 54 Tests zur Sequenzierung des gesamten Genoms einen FMR1-Call aufweisen würde, der visuell untersucht werden müsste, um einen potenziell falsch-positiven Call zu verwerfen. Es wird weiter daran gearbeitet, die Genotypisierungsmethode von ExpansionHunter zu verbessern, um die Anzahl falsch positiver Anrufe für FMR1 zu reduzieren.

We show that repeat sizing is accurate for repeats smaller than the sequencing read lengths, and therefore that most non-expanded and premutation CAG repeat expansion disorder alleles can be sized accurately. These results are consistent with other studies showing a strong correlation between whole genome sequencing and PCR quantification of repeat lengths smaller than the sequencing read length.19,25,26 Whole genome sequencing expansion detection is limited in its sizing of alleles considerably larger than the read length, such as in Fragile X syndrome. We note that all FMR1 repeats previously classified by PCR as fully expanded (ie, >200 repeats) were classified by whole genome sequencing as permutation (50–200 repeats) in this study. Repeat size estimation for repeats larger than the read length is particularly important for loci in which the length of the repeat correlates with the disease clinical features. This includes DMPK, for which small expansions (50–150 repeats) cause mild myotonic dystrophy type 1 and large expansions (>1000 Wiederholungen) verursachen eine schwerere Erkrankung und spinozerebelläre Ataxie Typ 36 (NOP56), für die Erweiterungen von mehr als 650 Wiederholungen als pathogen und Wiederholungsgrößen von 15–650 als intermediär und Varianten von unsicherer Bedeutung angesehen werden.

Mehr als 40 Repeat-Expansion-Loci wurden identifiziert; Viele dieser Loci wurden erst vor kurzem identifiziert und sind nun mit bisher ungeklärten Zuständen verbunden, einschließlich zerebellärer Ataxie mit Neuropathie und vestibulärem Areflexie-Syndrom (RFC1) 32 und myoklonischer Epilepsie (SAMD12).33 Die häufigsten neurologischen krankheitsverursachenden Loci waren für unsere Studie ausgewählt, basierend auf der Verfügbarkeit positiver und negativer Kontrollproben.

Die hier präsentierten Ergebnisse deuten darauf hin, dass ExpansionHunter in der Lage sein sollte, nicht-expandierte und expandierte Allele an jedem Repeat-Expansion-Locus genau zu klassifizieren, wenn die nicht-expandierten Allele kleiner als die Leselänge (dh 150 bp) sind. Obwohl die meisten Repeat-Expansion-Loci Allele haben, die kleiner als 150 bp sind, wenn sie nicht expandiert sind, könnten einige Loci, für die die Größe des nicht expandierten Allels nahe bei 150 bp liegt (z. B. NOTCH2NLC)34, mit diesem Ansatz schwieriger zu genotypisieren sein. Für Loci, bei denen die erweiterte Wiederholung deutlich größer als die Read-Länge ist, kann die Gesamtgenomsequenzierung pathogene Expansionen erkennen (z. B. NOP56,35 RFC120,32). Neue Long-Read-Sequenzierungstechnologien könnten ergänzende Ansätze bei der Genotypisierung großer Expansionen bieten.36

Die Bewertung wiederholter Expansionen mittels Gesamtgenomsequenzierung bei 11 631 nicht diagnostizierten Patienten, die für das 100 000 Genomes Project rekrutiert wurden, ergab 68 Patienten mit erklärenden Befunden. Die Patienten wurden nach Standard-Gentests für das 100 000 Genomes Project rekrutiert; Daher stellt der Anteil der in dieser Kohorte identifizierten wiederholten Expansionen eine Steigerung der diagnostischen Ausbeute von Standard-NHS-Tests dar, die lokusspezifische Tests auf Störungen der wiederholten Expansion wie FXN oder DMPK umfassen. Zu beachten ist, dass einige Diagnosen aufgrund der klinischen Merkmale des Patienten nicht vermutet wurden, darunter sechs pädiatrische Patienten, bei denen in der Familienanamnese keine wiederholte Expansionsstörung bekannt war. Die durch die Gesamtgenomsequenzierung bei pädiatrischen Patienten, die in dieser Studie beschrieben wurden, vorhergesagten mittleren Repeat-Expansion-Größen sind wesentlich größer als der Mittelwert bei Erwachsenen, was mit der Erwartung übereinstimmt, dass größere Expansionen mit einem früheren und schwereren Beginn verbunden sind, sogar bei Kindern. Weitere Arbeiten sind erforderlich, aber dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass eine altersabhängige und von der Wiederholungsgröße abhängige Beurteilung der Pathogenität eine pädiatrische Diagnose unterstützen könnte, indem die potenzielle Gefahr der Identifizierung von Risikoallelen mit Beginn im Erwachsenenalter verringert wird, was zu unaufgeforderten prädiktiven Tests bei Kindern führt.

Unsere Ergebnisse ermöglichen die Etablierung eines klinischen diagnostischen Arbeitsablaufs für die Gesamtgenomsequenzierung (Anhang S. 23). Wir schlagen vor, dass eine visuelle Inspektion für alle als expandiert klassifizierten Calls durchgeführt wird, um falsch positive Ergebnisse zu erkennen, und für biallelische Expansionen, für die nur ein expandiertes Allel nachgewiesen wurde (z. B. FXN). Wir empfehlen, dass Labore ExpansionHunter verwenden, um das Vorhandensein einer Expansion ohne Einhaltung der Größenschätzung zu beurteilen und bestätigende PCR-Tests als Standardkomponente des Testablaufs durchzuführen.

Seltene Erbkrankheiten umfassen ein breites Spektrum klinischer Merkmale, die ortsspezifische Genomtests ineffizient, mühsam und teuer machen. Wir legen Beweise dafür vor, dass die Sequenzierung des gesamten Genoms in klinischer Qualität mit dem Potenzial, eine Reihe seltener neurologischer Erkrankungen zu diagnostizieren, die typischerweise mit einer einzelnen Base, Indel oder Kopienzahlvarianten auftreten, nun auf Wiederholungsexpansionen ausgeweitet werden könnte. Da die Gesamtgenomsequenzierung einen einzigen Test bietet, der die häufigsten Wiederholungsexpansionen identifizieren kann, und gleichzeitig das Testen von Punktmutationen und Kopienzahlvarianten in Genen ermöglicht, die mit diesen Erkrankungen assoziiert sind, bietet sie die Möglichkeit, die meisten Patienten mit diesen heterogenen Erkrankungen zu identifizieren die nicht mit locusspezifischen Tests diagnostiziert wurden. Im Zeitalter neuer Therapien für diese Erkrankungen könnte die Früherkennung entscheidend werden.37 Diese Ergebnisse unterstützen die Implementierung der Gesamtgenomsequenzierung zum Nachweis wiederholter Expansionen in klinisch-diagnostischen Labors, ein Ansatz, der bereits in das NHS England National Genomic aufgenommen wurde Testverzeichnis38 zur Untersuchung nicht diagnostizierter seltener neurologischer Erkrankungen.

Verweise

1 Ngo KJ, Rexach JE, Lee H, et al. Eine diagnostische Obergrenze für die Exomsequenzierung bei zerebellärer Ataxie und verwandten neurologischen Störungen. Hum Mutat 2020; 41: 487–501.

2 Lynch DS, Koutsis G, Tucci A, et al. Hereditäre spastische Paraplegie in Griechenland: Charakterisierung einer bisher unerforschten Population mittels Next-Generation-Sequencing. Eur J Hum Genet 2016; 24: 857–63.

3 Graziola, F., Garone, G., Stregapede, F., et al. Diagnostische Ausbeute eines zielgerichteten Next-Generation-Sequencing-Gen-Panels für pädiatrisch beginnende Bewegungsstörungen: eine 3--Jahres-Kohortenstudie. Vordere Ginsterkatze 2019; 10: 1026.

4 Paulson H. Wiederholen Sie Expansionskrankheiten. Handb Clin Neurol 2018; 147: 105–23.

5 Gossye H, Engelborghs S, Van Broeckhoven C, van der Zee J. C9orf72 frontotemporale Demenz und/oder amyotrophe Lateralsklerose. Seattle, WA: Universität Washington, 2015.

6 Klockgether T., Mariotti C., Paulson HL. Spinozerebelläre Ataxie. Nat Rev Dis Primers 2019; 5:24.

7 Shakkottai VG, Fögel BL. Klinische Neurogenetik: autosomal-dominante spinozerebelläre Ataxie. Neurol Clinic 2013; 31: 987–1007.

8 La Spada A. Spinale und bulbäre Muskelatrophie. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., Hrsg. GeneReviews. Seattle, WA: Universität Washington, 1999.

9 Gousse G., H. Natural, R. Touraine et al. Letale Form der spinozerebellären Ataxie Typ 7 mit frühem Beginn in der Kindheit. Arch Pediatr 2018; 25: 42–44.

10 Ansorge O., Giunti P., Michalik A., et al. Ataxin-7-Aggregation und Ubiquitination bei infantiler SCA7 mit 180 CAG-Wiederholungen. Ann Neurol 2004; 56: 448-52.

11 MB Ramocki, L. Chapieski, RO McDonald, F. Fernandez, AD Malphrus. Spinozerebelläre Ataxie Typ 2 mit kognitiver Regression in der Kindheit. J Child Neurol 2008; 23: 999–1001.

12 Mitchell N., LaTouche GA, Nelson B., Figueroa KP., Walker RH, Sobering AK. Spinozerebelläre Ataxie 3 im Kindesalter: Zungendystonie als Frühmanifestation. Tremor Andere Hyperkinetic Mov 2019; online veröffentlicht am 13.

13 Vogel TD. Myotone Dystrophie Typ 1. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al, Hrsg. GeneReviews. Seattle, WA: Universität Washington, 2019.

14 Aydin G, Dekomien G, Hoffman S, Gerding WM, Epplen JT, Arning L. Häufigkeit von SCA8-, SCA10-, SCA12-, SCA36-, FXTAS- und C9orf72-Repeat-Expansion bei SCA-Patienten, die für die häufigsten SCA-Subtypen negativ sind. BMC Neurol 2018; 18:3.

15 Turro E, Astle WJ, Megy K, et al. Gesamtgenomsequenzierung von Patienten mit seltenen Krankheiten in einem nationalen Gesundheitssystem. Natur 2020; 583: 96–102.

16 AshleyEA. Auf dem Weg zur Präzisionsmedizin. Nat Rev. Genet 2016; 17: 507–22.

17 Liu HY, Zhou L., Zheng MY, et al. Diagnostischer und klinischer Nutzen der Gesamtgenomsequenzierung in einer Kohorte nicht diagnostizierter chinesischer Familien mit seltenen Krankheiten. Wissenschaftlicher Vertreter 2019; 9: 19365.

18 N. Mousavi, S. Shleizer-Burko, R. Yanicky, M. Gymrek. Nucleic Acids Res 2019; 47: e90.

19 Tankard RM, Bennett MF, Degorski P, Delatycki MB, Lockhart PJ, Bahlo M. Detecting expansions of tandem repeats in cohorts sequenced with short-read sequencing data. Am J Hum Genet 2018; 103: 858–73.

20 Rafehi ​​H., Szmulewicz DJ, Bennett MF, et al. Bioinformatik-basierte Identifizierung erweiterter Wiederholungen: Eine Nicht-Referenz-Intron-Pentamer-Expansion in RFC1 verursacht CANVAS. Am J Hum Genet 2019; 105: 151–65.

21 Gross AM, Ajay SS, Rajan V, et al. Copy-Number-Varianten in der klinischen Genomsequenzierung: Einsatz und Interpretation für seltene und nicht diagnostizierte Krankheiten. Genet Med 2019; 21: 1121–30.

22 Trost B, Engchuan W, Nguyen CM, et al. Genomweiter Nachweis von Tandem-DNA-Wiederholungen, die bei Autismus erweitert werden. Natur 2020; 586: 80–86.

23 Robinson PN, Kohler S, Bauer S, Seelow D, Horn D, Mundlos S. The Human Phenotype Ontology: a tool for annotating and analysis human ereditary disease. Bin J Hum Genet 2008; 83: 610–15.

24 Genomik England. Klinische Datenmodelle für seltene Erkrankungen. 2018. https://www.genomicsengland.co.uk/?wpdmdl=5500 (abgerufen am 4. August 2021).

25 Dolzhenko E, van Vugt JJFA, Shaw RJ, et al. Nachweis langer Repeat-Expansion aus PCR-freien Gesamtgenom-Sequenzdaten. Genomres 2017; 27: 1895-903.

26 Dolzhenko E, Deshpande V, Schlesinger F, et al. ExpansionHunter: ein Sequenzgraph-basiertes Tool zur Analyse von Variationen in kurzen Tandem-Wiederholungsregionen. Bioinformatik 2019; 35: 4754–56.

27 Roy S., Coldren C., Karunamurthy A. et al. Standards und Richtlinien zur Validierung von Bioinformatik-Pipelines für die Sequenzierung der nächsten Generation: eine gemeinsame Empfehlung der Association for Molecular Pathology und des College of American Pathologists. J MolDiagnose 2018; 20: 4–27.

28 Robinson JT, Thorvaldsdottir H, Winckler W, et al. Integrativer Genomik-Viewer. Nat. Biotechnologie 2011; 29: 24–26.

29 Schneider SA, van de Warrenburg BPC, Hughes TD, et al. Phänotypische Homogenität der Huntington-Krankheit-ähnlichen Präsentation in einer SCA17-Familie. Neurologie 2006; 67: 1701–03.

30 Schneider SA, Bird T. Huntington-Krankheit, Doppelgänger der Huntington-Krankheit und gutartige erbliche Chorea: Was gibt es Neues? Mov Disord Klinikum 2016; 3: 342–54.

31 Bahlo M., Bennett MF, Degorski P., Tankard RM, Delatycki MB, Lockhart PJ. Jüngste Fortschritte bei der Erkennung von Wiederholungsexpansionen mit Short-Read-Sequenzierung der nächsten Generation. F1000Res 2018; 7: 736.

32 Cortese A., Simone R., Sullivan R., et al. Die biallelische Expansion eines intronischen Repeats in RFC1 ist eine häufige Ursache für spät einsetzende Ataxie. Nat Genet 2019; 51: 649–58.

33 H. Ishiura, K. Doi, J. Mitsui et al. Erweiterungen von intronischen TTTCA- und TTTTA-Wiederholungen bei gutartiger familiärer myoklonischer Epilepsie bei Erwachsenen. Nat Genet 2018; 50: 581–90.

34 H. Ishiura, S. Shibata, J. Yoshimura et al. Nichtkodierende CGG-Repeat-Expansion bei neuronaler intranukleärer Einschlusskrankheit, okulopharyngodistaler Myopathie und einer überlappenden Krankheit. Nat Genet 2019; 51: 1222–32.

35 Rafehi ​​H, Szmulewicz DJ, Papst K, et al. Schnelle Diagnose der spinozerebellären Ataxie 36 in einer Drei-Generationen-Familie unter Verwendung von Short-Read-Gesamtgenom-Sequenzierungsdaten. Mov Disord 2020; 35: 1675–79.

36 Mantere T, Kersten S, Hoischen A. Long-Read Sequencing Emerging in Medical Genetics. Vordere Ginsterkatze 2019; 10: 426.

37 Ellerby LM. Repeat Expansion Disorders: Mechanismen und Therapien. Neurotherapeutika 2019; 16: 924–27.

38 Nationales Gesundheitssystem. National Genomic Test Directory: Testkriterien für seltene und erbliche Krankheiten. Oktober 2021.