Schutzwirkung von Mikrovesikeln von Endothel-Vorläuferzellen auf Ang II‑induzierte Nierenzellschädigung bei Ratten
Mar 11, 2022
Abstrakt.Chronischer Bluthochdruck kann dazu führenNierenschäden,bekannt als hypertensive Nephropathie oder hypertensive Nephrosklerose. Ein weiteres Verständnis der molekularen Mechanismen, über die sich eine hypertensive Nephropathie entwickelt, ist für eine effektive Diagnose und Behandlung unerlässlich. Die vorliegende Studie untersuchte die Mechanismen, durch die endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) primäre Ratten reparierenNiereZellen (PRKs). ELISA, Cell Counting Kit-8 und Durchflusszytometrie-Assays wurden verwendet, um die Auswirkungen von EPCs oder EPC-MVs auf oxidativen Stress, Entzündung, Zellproliferation, Apoptose und den Zyklus von PRKs, die durch AngII induziert werden, zu analysieren. Ein PRK-Verletzungsmodell wurde unter Verwendung von Angiotensin II (Ang II) erstellt. Nach der Ang II-Induktion war die PRK-Proliferation verringert, die Apoptose erhöht und der Zellzyklus in der G1-Phase vor dem Eintritt in die S-Phase blockiert. Es wurde festgestellt, dass die Konzentrationen an reaktiven Sauerstoffspezies und Malondialdehyd erhöht waren, während die Konzentrationen an Glutathionperoxidase und Superoxiddismutase verringert waren. Außerdem waren die Spiegel der Entzündungszytokine IL‑1, IL‑6 und TNF‑ signifikant erhöht. Somit beschädigte Ang II PRKs, indem es oxidativen Stress stimulierte und die Entzündungsreaktion förderte. Wenn jedoch PRKs mit EPCs kokultiviert wurden, war der durch Ang II induzierte Schaden signifikant reduziert. Die aktuelle Studie sammelte die von EPCs sezernierten Mikrovesikel (MVs) und kokultivierte sie mit Ang II-induzierten PRKs und stellte fest, dass EPC-MVs ihre schützende Wirkung auf PRKs beibehielten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass EPCs PRKs vor Ang II-induzierten Schäden durch sezernierte MVs schützen.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENERKRANKUNGEN VERBESSERN
Einführung
Bluthochdruck ist ein Risikofaktor für das Auftreten von kardiovaskulären und zerebrovaskulären Erkrankungen und der damit verbundenen Mortalität (1). DasNierenkönnen Bluthochdruck verursachen und sind eines der Zielorgane von Bluthochdruckschäden (2). ChronischNierenerkrankung(CKD) war in den letzten zwei Jahrzehnten weltweit eine der Hauptursachen für die erhöhte Sterblichkeit von Menschen mit Bluthochdruck (3,4). Daher besteht eine dringende Notwendigkeit, die Behandlung der hypertensiven Nephropathie zu fördern und ihren pathologischen Mechanismus zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Angiotensin II (Ang II) Gefäßschäden induziert und über mehrere Mechanismen eine Schlüsselrolle bei Gefäßerkrankungen spielte, wie z. 7), Förderung der Reaktion auf oxidativen Stress durch Erhöhung der Sekretion von Malondialdehyd (MDA) und Verringerung der Sekretion von Glutathionperoxidase (GSH‑Px) und Superoxiddismutase (SOD) (8,9). Ang II fördert auch die Produktion von entzündungsbezogenen Faktoren wie IL-6, IL-1 und TNF- (10-12). Ang II-induzierte Schäden wurden daher verwendet, um Bluthochdruck in vitro zu modellieren, einschließlich bei primären RattenNiereZellen (PRKs) (13,14).
Für Patienten mitNierenfunktionBeeinträchtigung, Schädigung von Endothelzellen und verminderte Regeneration und Reparatur sind die Hauptursachen für den Verlust von peritubulären Mikrovesikeln (MVs) (15). Aus dem Knochenmark stammende endotheliale Vorläuferzellen (EPCs) können die Endothelreparatur fördern (16,17). Frühere Studien haben gezeigt, dass EPCs die kardiovaskuläre Regeneration verbessern (18) und die Angiogenese regulieren (19) sowie therapeutische Wirkungen auf akute Erkrankungen ausüben könnenNieren-Ischämie‑Reperfusionsverletzung (20) und bei Patienten mitNierentransplantation(21). Nach unserem besten Wissen wurde jedoch bisher nicht über die Wirkung von EPCs auf hypertensive Nephropathie berichtet. Wir stellten die Hypothese auf, dass EPCs eine schützende Wirkung gegen hypertensive Nephropathie haben könntenNieren-Zellen. MVs werden kontinuierlich von einer Vielzahl von Körperzellen wie Epithelzellen, Tumorzellen und Stammzellen sezerniert und kommen in mehreren Körperflüssigkeiten wie Blut, Urin und Milch vor, wo sie biologische Funktionen vermitteln (22). Es häufen sich Hinweise darauf, dass die Schutzwirkung von EPCs eng mit der Freisetzung von MVs verbunden ist (23,24). In der vorliegenden Studie wurde die potenzielle Anwendung von EPC-MVs zur Behandlung von hypertensiver Nephropathie untersucht, indem die Schutzwirkungen und -mechanismen untersucht wurden über die EPC-MVs vor Ang II-induzierter PRK-Schädigung schützen, um eine biologische theoretische Grundlage für die Behandlung von hypertensiver Nephropathie bereitzustellen.
Schlüsselwörter:EPC-MVs, hypertensive Nephropathie, Ang II, ROS, MVs, Entzündung, Niere, Niere
Materialen und Methoden
Tiere.Insgesamt 12 8 Wochen alte männliche Wistar-Kyoto (WKY)-spezifische Pathogen-freie Ratten (Gewicht: 80 - 120 g) wurden von der Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Lizenz Nr Nr. SCXK, Guangdong, 2015‑0063). Die Ratten wurden in einem Raum mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit (Temperatur 23 ± 2 °C; Luftfeuchtigkeit 50 ± 10 Prozent) unter einem 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus mit unbegrenztem Zugang zu Standard-Rattenfutter und Wasser untergebracht ein Styroporkäfig. Alle Tierversuche wurden vom Animal Care and Use Committee der Hainan Medical University (Haikou, China; Genehmigungsnummer HYLL‑2021‑053) genehmigt und gemäß den Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt (25).
CISTANCHE WIRD DIE NIEREN-/NIERENFUNKTION VERBESSERN
Isolierung und Kultur von PRKs.WKY-Ratten mit freiem Zugang zu Wasser haben 12 h vor dem Experiment gefastet. WKY-Mäuse wurden unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital-Natrium (200 mg/kg Körpergewicht) eingeschläfert, dann dieNierenwurden aseptisch entfernt, und der kortikale Teil derNierewurde herausgeschnitten und in ein kleines Becherglas verpflanzt. DasNieren-Cortex wurde in Gewebefragmente von ~1 mm3 geschnitten, dreimal mit PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gewaschen, bei 1,000 xg bei 25°C für 5 min zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Die Gewebefragmente wurden zu Typ-I-Kollagenase (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) in einer Endkonzentration von 1 g/l gegeben, und die Gewebefragmente wurden oszilliert und bei 37°C für 3 0 min verdaut. Nach Filtration durch ein 200-Mesh (0,075 mm) Edelstahlsieb wurden die Zellen durch Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) Dichtegradientenzentrifugation (26) getrennt. Nach 2-minütiger Zentrifugation bei 1,000 xg bei 25 °C wurde die Zwischensuspension gesammelt und mit MEM/F12-Medium (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gemischt, in eine Platte mit 6 Vertiefungen inokuliert und kultiviert bei 37˚C unter 5 Prozent CO2. Nach 24 h wurde das Medium entfernt und durch ein frisches Medium ersetzt, und das unbefestigteNieren-Zellen und Gewebe wurden verworfen. Nach 48 h wurde das Medium wieder entfernt, die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und als PRKs bezeichnet (27,28); Hauptbestandteil waren glomeruläre Mesangialzellen der Ratte. PRKs wurden über drei Generationen kultiviert und mit Ang II (1 µM; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) bei 37 °C für 24 h behandelt, um die PRK zu etablierenNierenschädenModell. Die Ang II‑induzierte Entzündung bei RattenNieren-tubuläre Epithelzellen wurde wie zuvor von Nair et al. (29) beschrieben durchgeführt.
PRKs wurden unter Verwendung eines Immunfluoreszenz(IF)-Assays identifiziert.Nach dreimaligem Spülen mit PBS und Fixieren mit 4 % Paraformaldehyd bei 25 °C für 1 h wurden die Zellen (25 °C) mit Triton X-100 für 2 h inkubiert, gefolgt von 5 % BSA (Peking Solar Science & Technology Co., Ltd.) bei 25 °C für 30 min. Die PRKs wurden dann über Nacht im Dunkeln mit ‑SMA; 1 μg/ml; Kat.-Nr. ab7817; Abcam) und Vimentin (1:250; Kat.-Nr. ab92547; Abcam) bei 4 °C inkubiert. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen mit Alexa Fluor® 488‑ (1:100; Kat.-Nr. ab150077; Abcam) oder 647‑markierten (1:200; Kat.-Nr. ab150075; Abcam) sekundären Antikörpern bei 37 inkubiert ˚C für 1 h. Dann wurden die Zellen mit DAPI (0,5 &mgr;g/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) bei 25°C für 5 min gefärbt. Schließlich wurden Bilder unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Vergrößerung, x400; Leica Microsystems GmbH) aufgenommen.
Kultur und Identifizierung von EPCs.Femur und Tibia der Ratte wurden präpariert und jedes Knochenmarksröhrchen wurde mit sterilem PBS gespült. Die resultierende Mischung wurde zentrifugiert (1,000 xg; 25 °C; 15 min) und die Partikel wurden in MEM/F12-Medium resuspendiert. Die Zellen wurden durch Ficoll (Sigma-Aldrich; Merck KGaA)-Dichtegradientenzentrifugation (1,000 xg; 25 °C; 20 min) isoliert und in eine 25-cm2-Kulturflasche gegeben, die mit Fibronectin (BD Biosciences) beschichtet war. Die Zellen wurden in Vollmedium unter Standardbedingungen (37 °C; 5 % CO2) gehalten. Das Kulturmedium wurde nach 4 Tagen gewechselt und die adhärenten Zellen wurden für weitere 3 Tage kultiviert (30). Dil-Komplex-Acetyliertes-Lipoprotein niedriger Dichte (Dil-Ac-LDL)-Färbung (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) wurde verwendet, um EPCs zu identifizieren. Für das Kokultursystem wurden PRKs (1x104) in die untere Kammer einer Kokultivierungsplatte (Corning, Inc.) für 24 h gegeben und dann Ang II (1 µM) oder 200 µl PBS und EPCs (3x104) hinzugefügt in die obere Kammer gegeben und 24 h bei 37 °C inkubiert, bevor weitere Zellfunktionsanalysen durchgeführt wurden. Beim Screening von PRKs und dem besten Anteil an EPCs betrugen die Zellzahlverhältnisse 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 und 1:7.
Erstellung von EPC‑MVs. EPCs wurden für 7 Tage wie zuvor beschrieben (30) kultiviert, zweimal mit PBS gewaschen und für 12 h an Serummangel gehindert. Anschließend wurde MEM/F12-Medium mit kultivierten EPCs gesammelt und bei 4 °C zentrifugiert (1,000 xg; 15 min), und der Überstand wurde bei 4 °C extrahiert (100,000 xg; 60 min) für die Sammlung sekretierter EPC‑MVs. Nach dem Einbetten in Epoxidharz Pon 812 (Structure Probe, Inc.) wurde es über Nacht bei 37°C gehalten. Dann wurde eine elektronenmikroskopische Fixierlösung (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) für 4 h zugegeben und Uranacetat (2 Prozent; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) und Bleicitrat (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ) wurden 15 min lang bei 25 °C gefärbt. MVs wurden mittels Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt. Im Kokultursystem wurden 50 µg/ml EPC-MVs (31) in die obere Kammer einer Transwell-Testplatte gegeben, und Parks wurden wie zuvor beschrieben in die untere Kammer gegeben und 24 h lang inkubiert.
Zellproliferationsassay.PRKs wurden mit Trypsin verdaut, in Platten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 3 x 103 Zellen/Vertiefung inokuliert und für 24 h kultiviert. Die optische Dichte bei 450 nm wurde mit 10 µl Cell Counting Kit‑8 Reagenz (CCK‑8; Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.) bei 37 °C für 60 Minuten gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen, um die Zellproliferationsrate.
CISTANCHE WIRD NIEREN-/NIERENSCHMERZEN VERBESSERN
Zell-Apoptose-Assay.Ein Zellapoptose-Assay wurde unter Verwendung eines Annexin V‑FITC Apoptose-Erkennungskits (BD Biosciences) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. PRKs wurden geerntet, zweimal mit eiskaltem PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) gewaschen und in 500 µl Bindungspuffer resuspendiert. Die resuspendierten PRKs wurden dann mit 5 µl Annexin V-FITC und 5 µl PI im Dunkeln für 15 min bei 23±2˚C inkubiert. Die Zellapoptose wurde unter Verwendung von Durchflusszytometrie (FCM; FACSCanto II; BD FACSChorus™-Software, Version: 1.0; BD Biosciences) bewertet.
EPC-MV- und PRK-Fusion.Um zu beobachten, ob EPC-MVs mit PRKs fusioniert waren, wurden EPC-MVs vor der Co-Inkubation mit einem in die Lipidmembran eingebetteten Fluoreszenzfarbstoff (PKH26) markiert. Kurz gesagt, 50 µg/ml EPC-MVs wurden mit 2 ml PKH26 (2 x 10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) kombiniert und 5 min bei 23 ± 2 °C gemischt. Die markierte Mischung wurde zu 2 ml 1 % BSA (v) gegeben und bei 100,000 xg bei 4°C für 60 min zentrifugiert, dann mit kaltem PBS gespült. Das Präzipitat wurde in 1 ml MEM/F12-Medium suspendiert, zu PRKs gegeben und 24 h bei 37 °C inkubiert. Schließlich wurde 1 µg/ml DAPI zur Kernfärbung bei 25 °C für 15 min hinzugefügt. Zellbilder wurden unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops (Vergrößerung x400; Leica Microsystems GmbH) aufgenommen.
Zellzyklus-Assay.Der Zellzyklusassay wurde unter Verwendung des Cell Cycle Detection Kits (BD Biosciences) durchgeführt. EPCs oder PRKs (1x106 ) wurden geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und dann in 500 µl 70-prozentigem eiskaltem Ethanol für 2 h bei 25 °C fixiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit kaltem PBS gewaschen und in PI (400 &mgr;l) und RNase (100 &mgr;l) für 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Das PI-Signal wurde mit FCM (FACSCanto II) detektiert. Die Prozentsätze der Zellen in der G1-, S- und G2-Phase wurden gezählt und unter Verwendung der FlowJo-Software (Version 10.0.6; FlowJo LLC) verglichen.
ROS-Messung durch FCM.Die PRKs wurden bis zu einer Konfluenz von 60–70 Prozent kultiviert und durch Trypsinisierung geerntet. Alle Zellen wurden mit 1,0 µM 2',7'-Dichlordihydrofluoresceindiacetat für 15 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und mittels FCM analysiert, um ROS unter Verwendung eines 488-nm-Lasers zur Anregung und eines 535-nm-Lasers zur Detektion nachzuweisen.
ELISA.Nach Zentrifugation (1,000 xg; 25˚C; 5 min) wurde der Zellüberstand jeder Untergruppe gesammelt, um die Spiegel von MDA, GSH-Px, SOD und den Entzündungsfaktoren IL-6, IL- 1 und TNF‑. Die folgenden Kits wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet: Micro-MDA-Assay-Kit (Kat.-Nr. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), GSH-Px-Assay-Kit (Kat.-Nr. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), SOD-Aktivitätsnachweiskit (Kat.-Nr. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), Ratten-IL-1-ELISA-Kit (Kat.-Nr. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), Ratten-IL-6-Quantikine-ELISA-Kit (Kat.-Nr. R6000B; R&D Systems, Inc.) und Ratten-TNF-Quantikine-ELISA-Kit (Kat.-Nr. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Statistische Analyse.Alle Experimente wurden dreimal wiederholt, und alle Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Die Daten wurden mit der SPSS-Softwareversion 21.0 (IBM Corp.) analysiert. Unterschiede zwischen mehreren Gruppen wurden mittels einfacher ANOVA und Dunnetts Post-hoc-Test bewertet. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Ergebnisse
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 Prozent, was bestätigt, dass EPCs erfolgreich isoliert wurden. Isolierte PRKs wurden mittels IF (Vimentin/ ‑SMA) analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das Expressionsniveau von Vimentin/-SMA in PRKs hoch und positiv war, was auf die erfolgreiche Isolierung von PRKs hindeutet (Abb. 1B).
Das optimale Verhältnis von EPCs zu PRKs.Die Wirkung der Kombination verschiedener Anteile von PRKs/EPCs in einem Kokultursystem wurde untersucht, und es wurde festgestellt, dass PRKs, die in einem Verhältnis von 1:3 PRKs/EPCs gezüchtet wurden, keine erhöhten Proliferationsraten im Vergleich zu PRKs aufwiesen, die mit einem 2:3-Verhältnis gezüchtet wurden: 1, 1:1 oder 1:2 Verhältnis von PRKs/EPCs (Abb. 1C). Darüber hinaus führten zunehmende Anteile von EPCs (1:4, 1:5, 1:6 und 1:7) zu einer signifikanten Zunahme der PRK-Proliferation im Vergleich zu der von EPCs (1:3). Daher wurde für weitere Studien ein Verhältnis von 1:3 PRKs/EPCs ausgewählt, um eine mögliche Störung durch übermäßige EPCs in nachfolgenden Experimenten zu verhindern.
Wirkung der EPC-Kokultur auf den Ang II-induzierten Schaden.PRKs (1 × 10 4 ) wurden 24 h im Voraus in das untere Kompartiment einer Transwell-Platte inokuliert. Die obere Kammer enthielt 200 ul PBS in der Kontrollgruppe und 200 ul EPCs (3 · 10&sup4;) in der Versuchsgruppe. Zum ModellierenNierenschäden,1 &mgr;M Ang II wurde in das untere Kompartiment gegeben. Nach 24 h wurden CCK-8- und FCM-Assays durchgeführt, um die Proliferationsrate von PRKs zu messen. PRKs, die Ang II in Abwesenheit von EPCs erhielten, hatten eine signifikant verringerte (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">NiereZellmodell.
EPCs schützen PRKs vor Ang II-induzierten Schäden, das Niveau von oxidativem Stress, der durch Ang II in mit EPCs kokultivierten PRKs induziert wird, wurde untersucht. Die Ergebnisse des FCM-Assays zeigten, dass Ang II signifikant anstieg (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 vs. PRKs:EPCs, 2:1-Gruppe; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">NiereZellen; FCM, Durchflusszytometrie; CCK‑8, Zellzählkit‑8; Dil-Ac-LDL, Dil-Komplex acetyliertes Low-Density-Lipoprotein; OD, optische Dichte; -SMA, Aktin der glatten Muskulatur; NS, nicht signifikant. gegenteilige Ergebnisse in Bezug auf die Sekretion dieser Enzyme. Die Bildung von ROS kann daher an Ang II‑induzierten Zellschäden beteiligt sein und kann durch Kokultur mit EPCs verbessert werden.
Ang II kann auch Zellen schädigen, indem es die Sekretion von entzündlichen Zytokinen fördert, während EPCs Entzündungen verhindern können (32). Als nächstes wurde untersucht, ob Ang II die Sekretion von entzündlichen Zytokinen in PRKs fördert und ob EPCs ihre Schutzfunktion ausüben könnten, indem sie die Sekretion von entzündlichen Zytokinen hemmen. Die Sekretion von IL‑1, IL‑6 und TNF‑ wurde in PRKs durch die Zugabe von Ang II signifikant hochreguliert. Im Gegensatz dazu waren die Spiegel von IL‑1, IL‑6 und TNF‑ (Abb. 2E‑G) in PRKs, die mit EPCs kokultiviert wurden, vergleichsweise niedriger (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Die Schutzwirkung von EPCs wird über MVs ausgeübt.Die Mechanismen, über die EPCs schützende Wirkungen auf Ang II‑induzierte ausübenNiereDie Zellen wurden weiter analysiert, indem MVs aus EPCs isoliert wurden (Abb. 3A). EPC-MVs wurden mit PKH26 markiert und wie zuvor beschrieben zusammen mit Ang II in einer Transwell-Platte zu PRKs gegeben. PKH26-Fluoreszenz wurde im Zytoplasma von PRKs nachgewiesen (Abb. 3B), was darauf hinweist, dass EPC‑MVs mit PRKs fusioniert waren. Dann wurde festgestellt, dass die Ang II-induzierte verringerte Proliferationsrate, die Apoptose und den Zyklusarrest in der G1-Phase förderten, durch EPC-MVs gehemmt wurden (Abb. 3C-E). Ähnlich wie PRKs, die mit EPCs kokultiviert wurden, hatten PRKs, die in Gegenwart von EPC‑MVs gezüchtet und Ang II ausgesetzt wurden, reduzierte ROS- und MDA-Spiegel (Abb. 4A und B), erhöhte GSH- und SOD-Spiegel (Abb. 4C und D). und verringerte Sekretion der Entzündungszytokine IL‑1, IL‑6 und TNF‑ (Abb. 4E‑G) im Vergleich zur Ang II-Gruppe.
Diskussion
Nach unserem besten Wissen hat die vorliegende Studie zum ersten Mal gezeigt, dass EPCs PRKs vor Ang II-induzierten Zellschäden schützen können. Diese Schutzwirkung wird zumindest teilweise durch MVs vermittelt, die von EPCs sezerniert werden und während der Kokultur mit PRKs fusionieren. Durch Zugabe von angereicherten MVs zu PRKs, die Ang II ausgesetzt waren, wurde festgestellt, dass EPC-MVs allein PRKs vor Ang II-induzierten Schäden schützen können, indem sie oxidativen Stress und Entzündungen hemmen. MVs werden als Membran-Nanodebris (0.05-1 µm) (33) definiert und werden nach Aktivierung, Stress oder Apoptose von der Zelloberfläche abgestoßen. Darüber hinaus können MVs von verschiedenen Zelltypen wie Blutplättchen, Endothelzellen, EPCs und weißen Blutkörperchen stammen (34, 35). MVs exprimieren spezifische Zelloberflächenmarker, die je nach Ursprungszelle und deren Bildung variieren und entzündungshemmende, gerinnungshemmende und angiogene Wirkungen ausüben können (36). Aus EPCs freigesetzte MVs können die biologische Information ihrer Elternzelle tragen und somit eine ähnliche Funktion auf die Zielzellen ausüben (33). Zum Beispiel schützen EPC‑MVs Kardiomyozyten vor Ang II‑induzierter Hypertrophie und Apoptose (28), verbessern die Endothelfunktion und die Fähigkeit zur Regulierung der Angiogenese (37) und lindern die durch oxidativen Stress induzierte Endothelfunktionsstörung (38). Nach unserem besten Wissen wurde jedoch bisher nicht über die Wirkung von EPC-MVs auf hypertensive Nephropathie berichtet. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, die potenziellen Schutzwirkungen von EPCs und EPC-MVs in zu untersuchenNierenzellschädigung.
In der vorliegenden Studie wurde ein PRK-Verletzungsmodell durch Induktion von Schäden mit Ang II etabliert. In Übereinstimmung mit früheren Berichten (26, 39) verringerte Ang II die PRK-Proliferation, erhöhte die Apoptose und hielt den Zellzyklus in der G1-Phase an, bevor es in die S-Phase eintritt. Basierend auf diesen Hypertonie-bezogenen Markern wurde der Schluss gezogen, dass das Ang II-induzierte PRK-Hypertoniemodell erfolgreich etabliert wurde. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Co-Kultur mit EPCs PRKs vor Ang II-induzierten Schäden schützte. Nach gleichzeitiger Inkubation von EPCs mit PRKs plus Ang II waren die Konzentrationen von oxidativen Stressenzymen und Entzündungsfaktoren in den PRKs verringert. Daher können die potenziellen Mechanismen, über die EPCs ihre Schutzwirkung auf PRKs ausüben, die Regulierung von oxidativem Stress und Entzündungen umfassen. Nach unserem besten Wissen hat die aktuelle Studie zum ersten Mal gezeigt, dass EPCs die Ang II‑induzierte Reaktion auf oxidativen Stress und Entzündungen bei PRKs lindern können.
EPCs schützen effektivNierenfunktionbei CKD (40) und spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Gefäßintegrität und der Reparatur von Endothelverletzungen (15) sowie bei der Reduzierung von Gefäßleckagen, der Verbesserung der Organfunktion und der Erhöhung der Überlebensrate bei Sepsis (41). Es häufen sich Hinweise darauf, dass EPCs über die Sekretion von MVs eine schützende Rolle spielen könnten (37,42,43). Um die Schutzwirkung von EPC-MVs in PRKs zu testen, wurden EPC-MVs isoliert und mit PKH26 markiert, und dann wurden die markierten MVs mit PRKs plus Ang II co-inkubiert. Die EPC‑MVs fusionierten mit PRKs und hemmten signifikant die durch Ang II induzierte oxidative Stressreaktion und Entzündung, und diese Ergebnisse ähneln denen von Fu et al. (44). Die hemmende Wirkung von EPC‑MVs auf die Konzentration von oxidativen Stressenzymen war größer als die von EPCs allein; dies kann darauf zurückgeführt werden, dass die MVs in den PRKs, die mit EPC‑MVs behandelt wurden, in einer höheren Konzentration vorhanden waren als in denjenigen, die mit EPCs kokultiviert wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Schutzwirkung von EPCs auf PRKs gegen Ang II-induzierte Zellschädigung von sezernierten MVs abhängen könnte. Eine Einschränkung der vorliegenden Studie besteht darin, dass die potenziellen Mechanismen, über die die EPC‑MVs microRNAs/mRNAs/Signaltransduktionsachsen regulieren, nicht vollständig untersucht wurden. Rolle und Mechanismen, über die EPC‑MVs Schutz vorNierenschädensollte in einem Tiermodell der hypertensiven Nephropathie evaluiert werden, was eine vielversprechende Richtung für die zukünftige Forschung darstellt. Zusammenfassend zeigte die vorliegende Studie, dass EPCs PRKs vor Ang II-induziertem oxidativem Stress und verstärkter Entzündung durch die Sekretion von MVs schützen können. Dies stellt eine neue Richtung für die Behandlung von hypertensiver Nephropathie bereit und etabliert ein In-vitro-Modell für StudienNierenverletzung.
