Zielidentifizierung und Mechanismusanalyse für die Makrophagenaktivierung von Sacchariden mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche Deserticola basierend auf molekularer Affinitätschromatographie

[Abstrakt]Ziel dieser Studie ist es, die Ziele und den an Zielen beteiligten Mechanismus für die Makrophagenaktivierung von Sacchariden mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola (LMSC) zu untersuchen. Die phagozytische Aktivität und NO-Freisetzung von RAW264. Es wurden 7 Zellen nachgewiesen und die Ergebnisse zeigten, dass LMSC eine immunaktivierende Wirkung ausübt, indem es die phagozytische Aktivität und die NO-Freisetzung deutlich erhöht. Als Affinitätsreagenz zum Einfangen der Zielproteine ​​wurden LMSC-konjugierte epoxidaktivierte Sepharose-Kügelchen hergestellt. Vierundzwanzig Proteine ​​wie Eef2 wurden durch LC-MS/MS-Analyse identifiziert. Die Pathway-Anreicherungsanalyse zeigte, dass LMSC RAW264 aktivierte. 7-Zellen durch Regulierung der Fcgamma-Rezeptor-abhängigen Phagozytose, des TNF-alpha-NF-κB-Signalwegs, der Glykolyse/Glukoneogenese sowie des Zitronensäurezyklus und des respiratorischen Elektronentransportwegs.

[Schlüsselwörter]Cistanche deserticola; Saccharide mit niedrigem Molekulargewicht; Makrophagenaktivierung; molekulare Affinitätschromatographie; Zielidentifizierung; Mechanismusanalyse

Wüstenginseng

Cistanches Herba ist ein berühmtes traditionelles chinesisches Arzneimittel zur Stärkung der Nieren und des Yang, zur Verbesserung der Essenz und des Blutes sowie zur Ernährung des Darms und des Stuhlgangs. Er ist als „Wüstenginseng“ bekannt. Moderne analytische Chemieforschung zeigt, dass Cistanche deserticola eine Vielzahl von Kohlenhydratkomponenten enthält, darunter Monosaccharidverbindungen, hauptsächlich Fruktose, Oligosaccharidverbindungen wie Saccharose und Polysaccharide wie ACDP-2, die wirksame Substanzen sind, in denen Cistanche deserticola eine Rolle spielt Immunregulierung, Stuhlgang usw. [2-5]. Die Polysaccharide von Cistanche deserticola gelten weithin als Wirkstoffklasse mit immunmodulatorischer Wirkung, während Zucker mit niedrigem Molekulargewicht (LMSCs) wie Oligosaccharide und Monosaccharide selten untersucht wurden. Eine Studie unserer Forschungsgruppe zur Makrophagenaktivierung der Hauptwirkstoffe in Cistanche deserticola ergab, dass niedermolekularer Zucker eine Art Wirkstoff mit Makrophagenaktivierung ist, sein Immunaktivierungsziel und sein Wirkungsmechanismus jedoch noch unklar sind.

Wirkung von Cistanche – Verbesserung der Immunität

Klicken Sie hier, um die Produkte von Cistanche Enhance Immunity anzusehen

【Fragen Sie nach mehr】 E-Mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Die molekulare Affinitätschromatographie ist eine chromatographische Methode, die die Trennung und Reinigung von Zielmolekülen durch spezifische Bindung an eine stationäre Phase erreicht [6]. Diese Methode weist eine hohe Affinität und Spezifität auf und eignet sich besonders für komplexe organische Systeme mit extrem niedrigen Zielproduktkonzentrationen [7]. In den letzten Jahren hat es sich nach und nach zu einem leistungsstarken Instrument zur Identifizierung natürlicher Wirkstoffziele entwickelt. In dieser Studie wurde eine auf molekularer Affinitätschromatographie basierende Technologie zur Erfassung von Zielproteinen kleiner Moleküle verwendet, um LMSC-Zielproteine ​​mit Makrophagenaktivierung zu identifizieren. Durch bioinformatische Analyse werden Informationen über den Signalregulationsweg der Zielgruppe gewonnen, um die immunregulatorische Aktivität und die damit verbundenen Mechanismen von LMSC zu untersuchen.

1 Werkstoff

1.1 Zellen

Maus-Makrophagen-Linie RAW264 7 Gekauft vom Cell Center der Chinese Academy of Medical Sciences.

1.2 Medikamente und Reagenzien

Fetales Rinderserum (FBS) wurde von PAN Biotech in Deutschland gekauft; Antibiotika, DMEM-Medium mit hohem Zuckergehalt und 6 × Der Proteinprobenpuffer wurde von Zhongke Maichen Technology Co., Ltd. gekauft. Der Zucker mit niedrigem Molekulargewicht von Cistanche deserticola wurde von unserer Forschungsgruppe selbst hergestellt und durch HPLC wurde festgestellt, dass er hauptsächlich Mannitol enthält ( 16 53 Prozent), Saccharose (8 34 Prozent), Fruktose (25 38 Prozent), Glucose (7 75 Prozent) und andere Monomerkomponenten. Lipopolysaccharid aus Escherichia coli O55: B5, LPS, 3 - (4,5-Dimethylthiazol-2) - 2,5-Diphenyltetrazoliumbromid (MTT) und {{ Eine 14-prozentige neutrale rote Lösung wurde von Sigma Aldrich in den Vereinigten Staaten gekauft. Das Stickoxid (NO)-Reagenzienkit wurde vom Nanjing Jiancheng Biotechnology Research Institute erworben. Epoxidaktiviertes Sepharose-Gel (6B) wurde von GE Health Care in Schweden gekauft. Das Kit zur schnellen Silberfärbung wurde vom Biyuntian Biotechnology Research Institute erworben. Sowohl Ameisensäure als auch Acetonitril für die Massenspektrometrie wurden von Thermo Fisher Scientific in den USA bezogen. Alle anderen Reagenzien sind inländischer analytischer Reinheit.

Cistanche-Pulver

1.3 Instrumente

CO2-Zellinkubator (SANYO, Japan); CIX100-Mikroskop (Olympus Corporation, Japan); 5424R-Zentrifuge (Eppendorf, Deutschland); Automatischer Wasserreiniger (Millipore, USA); Sunrise Basic ELISA (TECAN, Schweiz); THZ-C Desktop-Konstanttemperaturoszillator (Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd.); EAS Y-nLC-II-Flüssigkeitschromatographen (Thermo Fisher Scientific, USA); LTQ-Orbitrap-Ionenfallen-Tandem-Massenspektrometrie (Thermo Fisher Scientific, USA); Kapillarflüssigkeitschromatographiesäule (Michrom Bioresources, USA).

2 Methoden

2.1 Zellkultur und Verabreichung

RAW264. 7 Zellen wurden in DMEM-Medium mit hohem Glucosegehalt, das 1 0 Prozent fötales Rinderserum und 1 Prozent Dual-Antikörper enthielt, kultiviert und in einen Inkubator mit gesättigter Luftfeuchtigkeit und konstanter Temperatur von 37 Grad und 5 Prozent CO2 gegeben. Gehen Sie alle 2-3 Tage einmal durch und führen Sie Experimente durch, wenn die Zellen in die logarithmische Wachstumsphase eintreten. Teilen Sie die Zellen in eine leere Gruppe, eine Lipopolysaccharidgruppe oder eine Zuckergruppe mit niedrigem Molekulargewicht von Cistanche deserticola ein. Zellen der LPS-Gruppe wurden mit 1 mg · L-1 LPS-Lösung als Positivkontrolle behandelt; Den Zellen der LMSC-Gruppe wurden LMSC-Lösungen unterschiedlicher Massenkonzentrationen zugesetzt (0 25,0,5,1,2 g·L － 1; vor der Verabreichung mit einer Filtermembran filtern); Den leeren Gruppenzellen ein gleiches Volumen serumfreies Kulturmedium hinzufügen.

2.2 Bestimmung der phagozytischen Aktivität von Makrophagen mit der Neutralrot-Methode

RAW264. 7 Zellen wurden auf einer 96--Wellplatte ausgesät und über Nacht kultiviert, bevor sie durch serumfreies Medium oder serumfreies Medium, das LPS oder unterschiedliche Konzentrationen an LMSC enthielt, ersetzt wurden. Nach 48-stündiger Kultivierung wurden die Zellen durch eine 0 075-prozentige neutrale rote Lösung ersetzt und weitere 4 Stunden bei 37 Grad inkubiert. Den Überstand absorbieren und verwerfen, zweimal mit PBS waschen und Zelllyselösung (Eisessig-Ethanol 1:1) verwenden, um die Zellen bei 4 Grad zu lysieren. Messen Sie nach vollständiger Lyse die Absorption jeder Vertiefung (A540 nm).

2.3 Nachweis der NO-Freisetzung im Zellüberstand

RAW264. 7 Zellen wurden auf einer 48--Wellplatte ausgesät und über Nacht kultiviert, bevor sie durch serumfreies Medium oder serumfreies Medium, das LPS oder unterschiedliche Konzentrationen an LMSC enthielt, ersetzt wurden. Sammeln Sie nach 24 Stunden Induktionskultur den Überstand und messen Sie den NO-Gehalt im Überstand jeder guten Zelle gemäß den Anweisungen des Reagenzienkits.

2.4 MTT-Assay für die Lebensfähigkeit von Makrophagen

RAW264. 7 Zellen wurden auf einer 96--Wellplatte inokuliert und nach der Kultivierung über Nacht durch serumfreies Medium oder serumfreies Medium, das LPS oder unterschiedliche Konzentrationen von LMSC enthielt, ersetzt und 24 Stunden lang weiter kultiviert. Ersetzen Sie jede gute Zelle durch 0. Inkubieren Sie 5 g · L-1 MTT-Lösung 4 Stunden lang bei 37 °C, lösen Sie dann das MTT-Reaktionsprodukt mit Dimethylsulfoxid auf und messen Sie die Absorption jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 570 nm unter Verwendung eines enzymgebundenen Immunosorbens-Assays.

Herstellung eines 2,5-Cistanche-Deserticola-Zuckeraffinitätsmediums mit niedrigem Molekulargewicht

Referenzmethode [8], epoxidaktiviertes Agaroseharz 0 5 g abwiegen, 40 min in entionisiertem Wasser auflösen, zentrifugieren und den Überstand verwerfen und den Vorgang dreimal wiederholen, um das Gel vollständig herzustellen geschwollen (sein Volumen beträgt etwa 1 ml), für den Standby-Modus. Nehmen Sie 0 Mischen Sie 5 ml gequollenes epoxidaktiviertes Agarosegel mit 1 ml LMSC-Lösung (1 g · ml − 1) oder einem äquivalenten Volumen Lösungsmittel und inkubieren Sie es über Nacht in einem Schüttler mit konstanter Temperatur bei 37 Grad. Waschen Sie den Blindwert oder das LMSC-gekoppelte Agarosemedium mehrmals mit entionisiertem Wasser, bis der Überstand farblos ist, geben Sie dann 1 ml Ethanolaminlösung (1 mol · L-1) hinzu und versiegeln Sie es auf einem Schütteltisch mit konstanter Temperatur bei 37 Grad 2 Tage. Nachdem die Reaktion abgeschlossen ist, reinigen Sie jeweils fünfmal mit doppelt destilliertem Wasser, NaCl-Hac-Puffer und NaCl-Tris-HCl-Puffer und verwenden Sie abschließend zweimal 0 Wash mit 01 Prozent NP40-Eluent als Backup.

2.6 Anreicherung und Identifizierung von Zielgruppen

Zu RAW264 Gesamtproteinextrakt aus 7 Zellen (0 Fügen Sie 50 zu 5 g · L-1 bzw. μ L Leermedium oder LMSC-Affinitätsmedium als Leerkontrollgruppe und LMSC-Bindungsgruppe hinzu ; Richten Sie eine Konkurrenzgruppe ein, die gleichzeitig LMSC-Lösung und LMSC-Affinitätsmedium hinzufügt. Nach dem Mischen jeder Gruppe über Nacht bei 4 Grad inkubieren, um LMSC vollständig an das Zielprotein zu binden. Nach der Reaktion 0 verwenden. Waschen Sie das Affinitätsmedium sechsmal mit 01 Prozent NP40-Eluent, um restliche freie Proteine ​​aus dem Affinitätsmedium zu entfernen. Gewaschenes Affinitätsmedium zu einem gleichen Volumen von 2 × Probenladepuffer hinzufügen, denaturiert bei 98 Grad für 8 Minuten, um das Bindungsprotein zu dissoziieren. Den Überstand absaugen, SDS-PAGE-Gel durchführen Elektrophorese durchführen und dann eine Silberfärbungsanalyse gemäß den Anweisungen des Kits durchführen.

2.7 LC-MS/MS-Methode zur Identifizierung von Zielproteingruppen

Die Referenzmethode [8] wurde verwendet, um spezifische Bindungsproteine ​​mithilfe einer zweidimensionalen Nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS-Tandem-Linear-Ionenfallen-Massenspektrometrie (Nano-HPLC-LTQ-Orbitrap/MS) zu identifizieren. Die spezifische Methode ist wie folgt: Zunächst wird Trypsin verwendet, um die unterschiedlich exprimierten Proteinbanden innerhalb des Gels zu hydrolysieren, um eine Mischung aus Zielpeptidsegmenten zu erhalten. Die Peptidmischung wurde 0 22 μm unterzogen. Nach der Filtration mit einer mikroporösen Membran wurden 10 % μ extrahiert. L-Probenlösung zur Kapillarflüssigkeitschromatographiesäule hinzufügen. Chromatografische Bedingungen: mobile Phase 0 1 Prozent wässrige Ameisensäurelösung (A) – Acetonitril (B), Gradientenelutionsbedingungen sind in Tabelle 1 aufgeführt. Bedingungen des Massenspektrums: elektrische Sprühspannung beträgt 1 8 kV, positives Ion Modus Datenerfassung, vollständiger Scanbereich auf m/z 350-2 000 eingestellt; Führen Sie einen MS/MS-Scan an den 15 stärksten Peaks durch, wobei die sekundäre Kollisionsenergie auf 35 V eingestellt ist. Verwenden Sie abschließend die SEQUEST-Suchsoftware, um die erhaltenen Peptidsegmentdaten zu suchen und abzugleichen.

Tabelle 1 Gradientenprofil der Nano-HPLC-Analyse

Hinweis: Die Flussraten betragen alle 300 nL · min-1.

2.8 Aktionszielgruppenpfad und Funktionsanalyse

Importieren Sie das identifizierte Zielprotein in Cytoscape 3. In der 5.1-Software wurde das ClueGO-Plugin für die KEGG-, REACTOME Pathways- und Wiki Pathways-Analyse verwendet und die Spezies wurde als Mäuse mit P festgelegt<0 05 as the significance threshold, and the rest use default parameters.

2.9 Statistische Analyse

Alle experimentellen Daten werden in x-Feld ± s ausgedrückt. Mithilfe der Statistiksoftware GraphPad Prism-6 02 wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt, wobei P<0 01 having a very significant difference.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1 Niedermolekularer Zucker aus Cistanche deserticola beeinflusst RAW264 Die Wirkung der 7-Zellphagozytoseaktivität

In einer anderen Studie unserer Forschungsgruppe zu den aktiven Komponenten der Makrophagenaktivierung in Cistanche deserticola könnte LMSC eine Art Komponente mit Makrophagenaktivierung sein.

Experimentelle Studie zu Cistanche deserticola

In diesem Experiment wurde zunächst die Neutralrot-Methode zur Bestimmung von RAW264 verwendet. Das In-vitro-Kultursystem von 7 Peritonealmakrophagen der Maus wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen von LMSC stimuliert, um die Wirkung von LMSC auf RAW264 zu untersuchen. Die Wirkung der phagozytischen Aktivität von 7 Zellen. Verglichen mit der Blindkontrollgruppe steigerte das Positivkontrollmedikament LPS, das die Zellen 48 Stunden lang stimulierte, die zelluläre Phagozytenaktivität deutlich (P<0 01); LMSC at 0 Each administration group of 25-2 g · L-1 significantly increased RAW264 The phagocytic activity of 7 cells (P<0 01), and exhibit dose-dependent characteristics. The above results suggest that LMSC may have activated RAW264 The role of 7 cells is shown in Figure 1.

Verglichen mit der leeren Kontrollgruppe, 1) P<0 01 (same as Figure 2).

Abb. 1 Auswirkungen der Saccharide mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola auf die phagozytische Aktivität von RAW264. 7 Zellen

3.2 Niedermolekularer Zucker aus Cistanche deserticola beeinflusst RAW264 Die Wirkung der NO-Freisetzung in 7 Zellen

NO ist ein wichtiges Zytokin mit immunregulatorischer Wirkung im Körper [9], von dem weithin berichtet wird, dass es an der Regulierung der Aktivierungsreaktion von RAW264 7--Zellen beteiligt ist. Um den Einfluss von LMSC auf RAW264 weiter zu untersuchen, wurde der Aktivierungseffekt von 7 Zellen bestimmt und der NO-Gehalt im Zellüberstand nach LMSC-Stimulation gemessen. Die NO-Freisetzung in der LPS-Gruppe mit positivem Medikament zur Makrophagenaktivierung war signifikant höher als in der Blindkontrollgruppe (P<0. 05) 01), similar to it, 0 RAW264 in the LMSC administration group with 3 doses of 5, 1, 2 g · L-1 The NO release of 7 cells was significantly higher than that of the blank control group (P<0. 05) 01), and it is dose-dependent, as shown in Figure 2. The above results indicate that LMSC can promote RAW264 The effect of 7 cells releasing NO confirms its macrophage activation effect.

Abb. 2 Auswirkungen der Saccharide mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola auf die NO-Freisetzung aus RAW264. 7 Zellen

3.3 Niedermolekularer Zucker aus Cistanche deserticola beeinflusst RAW264 Die Auswirkung auf die 7-Lebensfähigkeit der Zellen

Zytotoxizität ist ein wichtiger Faktor, der die Entwicklung neuer Medikamente einschränkt und deren Wirksamkeit beeinträchtigt. Um zu untersuchen, ob die in diesem Experiment verwendete LMSC-Dosierung potenziell zytotoxisch ist, wurde die MTT-Methode verwendet, um RAW264 nach LMSC-Verabreichung nachzuweisen. 7 Zelllebensfähigkeit. LMSC bei 0 25-2 g · L-1-Intervention RAW264 Nach 24 Stunden mit 7 Zellen gab es keine signifikante Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit, und die obigen Ergebnisse legen nahe, dass 0 25-2 g · L{{8 }} LMSC vs. RAW264 7 weist keine Zytotoxizität auf, wie in Abbildung 3 dargestellt.

Abb. 3 Auswirkungen der Saccharide mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola auf RAW264. 7 Lebensfähigkeit der Zellen

3. 4 Anreicherung und Identifizierung von Zielgruppen für die Makrophagenaktivierung von Zucker mit niedrigem Molekulargewicht in Cistanche deserticola

Epoxidaktiviertes Agarosegel ist ein Festphasenträger, der häufig zur Kopplung von Sacchariden, Proteinen und anderen Molekülen mit Hydroxyl- oder Aminogruppen verwendet wird. LMSC besteht hauptsächlich aus hydroxylreicher Fructose, Mannitol und anderen Komponenten. In dieser Studie kann das enthaltene Hydroxyl mit aktiven Epoxidgruppen reagieren, um den niedermolekularen Zucker von Cistanche deserticola an die Oberfläche von Epoxid-aktivierten Agarosegel-Mikrokügelchen zu binden und so ein LMSC-Affinitätsmedium aufzubauen, wie in Abbildung 4A dargestellt. Mithilfe der Technologie der molekularen Affinitätschromatographie wurde das LMSC-Affinitätsmedium mit RAW264 gemischt. Der gesamte Proteinextrakt von 7 Zellen wurde inkubiert, um die Zielproteingruppe direkt zu erfassen. Bei der Zielgruppe wurde eine Silberfärbung durchgeführt, wie in Abbildung 4B dargestellt. Die Proteinbanden der LMSC-Affinitätsmedium-Bindungsgruppe waren signifikant höher als die der ungekoppelten LMSC-Leermedium-Gruppe, während die LMSC-Kompetitivgruppe die Anzahl der im Affinitätsmedium eingefangenen Ziele aufgrund einer übermäßigen freien LMSC-Konkurrenzbindung mit dem Zielprotein deutlich reduzierte. Anschließend wurde die HPLC-MS/MS-Methode zur Identifizierung jeder Proteinbande verwendet und insgesamt 24 Zielproteine ​​wie Eef2 erhalten, was darauf hindeutet, dass niedermolekularer Zucker aus Cistanche deserticola durch die kombinierte Wirkung dieser Zielproteine ​​eine Makrophagenaktivierung bewirken kann.

3. 5 Analyse des Wirkmechanismus im Zusammenhang mit der Aktivierungszielgruppe niedermolekularer Zuckermakrophagen in Cistanche deserticola

Um das niedermolekulare Zuckerzielprotein von Cistanche deserticola zu untersuchen, das RAW264 verursacht, wird in dieser Studie der Mechanismus der Makrophagenaktivierung mithilfe von KEGG-, REACTOME- und Wiki-Signalwegdatenbanken analysiert, um die biologischen Wege zu untersuchen, die an der LMSC-Zielproteingruppe beteiligt sind. Die Analyseergebnisse der Signalweganreicherung sind in Abbildung 5 und Tabelle 2 dargestellt. Die Zielproteine ​​der LMSC-Makrophagenaktivierung sind hauptsächlich an 10 Signalwegen im Zusammenhang mit der Makrophagenaktivierung beteiligt, die in den folgenden vier Kategorien zusammengefasst werden können: Fc-Rezeptor-abhängige Phagozytose, TNF-NF - κ B-Signalweg, Glykolyse/Glukoneogenese, Zitronensäurezyklus (TCA) und respiratorischer Elektronentransport.

4. Diskussion

Moderne Forschungen berichten, dass die traditionelle chinesische Medizin und natürliche Arzneimittel über ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten verfügen. Aufgrund ihrer komplexen chemischen Zusammensetzung gibt es jedoch immer noch Herausforderungen bei der Aufklärung des Wirkmechanismus der komplexen Komponentensysteme der traditionellen chinesischen Medizin und natürlichen Arzneimittel. Basierend auf der Technologie zur Erfassung von Zielproteinen kleiner Moleküle der molekularen Affinitätschromatographie kombinierte diese Studie mit der Gemeinsamkeit der chemischen Zusammensetzung, dass die Hauptkomponenten des molekularen Zuckers von Cistanche deserticola (LMSC) alle Hydroxylgruppen aufweisen, und konstruierte LMSC-gebundene Epoxid-aktivierte Agarosegel-Mikrokügelchen als Affinitätsmedium, um LMSC-Zielproteingruppen mit Makrophagenaktivierung zu identifizieren und die mit der Zielgruppe verbundenen Signaltransduktionswege zu analysieren. Darüber hinaus wurde der Mechanismus der LMSC-Makrophagenaktivierung aufgedeckt.

Wirkung von Cistanche – Verbesserung der Immunität

Makrophagen sind eine Art wichtiger Immunantwortzellen im Körper, die granuläre Antigene phagozytieren können. Die durch exogene Reize verursachte Aktivierung von Makrophagen äußert sich hauptsächlich in der Verbesserung der Phagozytenfunktion und der Freisetzung von NO und anderen Faktoren, die durch eine Reihe von Signalwegen verursacht werden. LMSC-dosisabhängige Verbesserung RAW264 Die phagozytische Aktivität von 7 Zellen und ein signifikanter Anstieg der NO-Freisetzung weisen darauf hin, dass LMSC einen Makrophagen-Aktivierungseffekt hat. Die Anreicherungsanalyse der Signalwege von LMSC-Makrophagenaktivierungszielen, die durch molekulare Affinitätschromatographie mit bioinformatischen Mitteln erfasst wurden, legt nahe, dass LMSC Fc durch rezeptorabhängige Phagozytose, TNF-NF-κ, den B-Signalweg, Glykolyse/Glukoneogenese, Zitronensäurezyklus (TCA) und reguliert Der respiratorische Elektronentransport spielt eine Rolle bei der Aktivierung von Makrophagen.

A. Mikroskopische Charakterisierung des Affinitätsmediums (bar=25 μ m); B. Silbergefärbte Gelelektrophorese angereicherter Ziele.

Abb. 4 Die Zielidentifizierung für die Saccharide mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola

Abb. 5 Pathway-Anreicherungsanalyse für die Ziele von Sacchariden mit niedrigem Molekulargewicht aus Cistanche deserticola

Fc-Rezeptoren sind Zelloberflächenrezeptoren und einer der Makrophagen-Mustererkennungsrezeptoren [11]. Sie befinden sich auf der Zelloberfläche und können körperfremde Partikel gezielt erkennen und veranlassen, diese an die Zelloberfläche zu binden. Die durch den Fc-Rezeptor vermittelte Phagozytose-Signaltransduktion kann eine nachgeschaltete Aktinpolymerisation und Phagozytenbildung verursachen [11]. LMSC verbessert die phagozytische Aktivität von RAW264 7-Zellen erheblich, was möglicherweise mit der Bindung verschiedener Fcs wie Hsp90-Rezeptor-Signalisierungsproteinen zusammenhängt, die die Fc-Rezeptor-abhängige Phagozytose regulieren. NF-κ Der B-Signalweg gilt als wichtiger Signalweg für die Makrophagenaktivierung [12]. NF-κ B ist ein wichtiger Transkriptionsregulationsfaktor im Zellkern. Die Aktivierung des B-Signalwegs kann dazu führen, dass NF im Zytoplasma-κ B aktiviert und in den Zellkern verlagert wird, wodurch die Genexpression verschiedener Zytokine und NO vermittelt wird Vermittler. Die LMSC-Stimulation kann dazu führen, dass RAW264 7-Zellen eine große Menge NO freisetzen, was möglicherweise mit TNF in Zusammenhang steht, indem es an verschiedene Faktoren wie den Eef2- NF-κ B-Signalweg bindet und andere verwandte Proteine ​​NF aktivieren - κ Der B-Signalweg und die damit verbundenen eukaryotischen Translationsinitiierungs- und -verlängerungsprozesse werden implementiert. Darüber hinaus umfassen LMSC-bezogene Ziele auch zwei Kohlenhydratstoffwechselwege: Glykolyse/Glukoneogenese, Zitronensäurezyklus (TCA) und respiratorischer Elektronentransport. Es wird spekuliert, dass LMSC verschiedene niedermolekulare Zucker wie Fructose und Mannitol enthält, die RAW264 7-Zellen beeinflussen können, indem sie Energie liefern und an Proteine ​​wie Aldoa binden, die mit dem Glukosestoffwechsel in Zusammenhang stehen, und so die mit dem Glukosestoffwechsel verbundenen Wege regulieren.

Zusammenfassend identifizierte diese Studie 24 verschiedene funktionelle Zielproteine ​​für die Aktivierung von LMSC-Makrophagen mithilfe der Zielproteinerkennungstechnologie im Zusammenhang mit der molekularen Affinitätschromatographie. Die Anreicherungsanalyse von Zielprotein-bezogenen Signalwegen legt nahe, dass LMSC auf die Fc-Rezeptor-abhängige Phagozytose, TNF-NF-κ, einwirkt. Der B-Signalweg und der Glukosestoffwechselprozess wirken letztendlich auf RAW264 7. Aktivierung von Makrophagen. Diese Studie liefert theoretische Unterstützung für die Aufdeckung der aktiven Komponenten und der damit verbundenen Mechanismen der Immunregulation in Cistanche deserticola und liefert außerdem Ideen für die Zielerkennung und Mechanismusforschung komplexer aktiver Komponenten in natürlichen Arzneimitteln.

Tabelle 2 Pathway-Anreicherungsanalyse für die Ziele von LMSC

[Referenz]

[1] Chinesisches Arzneibuch Teil 1 [S]. 2010:126

［2］ Xu Wenhao, Qiu Shengxiang, Zhao Jihong, et al. Eine Studie über die chemischen Bestandteile von Cistanche deserticola ［ J ］. Chinesische Kräutermedizin, 1994, 25 (10): 509

[3] Wu XM, Gao XM, Tsim KW, et al. Ein aus den Stängeln von Cistanche deserticola isoliertes Arabinogalactan induziert die Proliferation kultivierter Lymphozyten［J］． Int J Biol Macromol,2005,37 ( 5): 278．

［4］ Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Runlan, et al. Makrophagenaktivierung von Polysacchariden aus Cistanche deserticola ［ J ］. Chinese Pharmacological Bulletin, 2009, 25 (6): 787

［5］ Gao Yunjia, Jiang Yong, Dai Fang, et al. Eine Studie über die pharmakodynamischen Substanzen von Cistanche deserticola zur Ernährung des Darms und Linderung des Stuhlgangs ［ J ］. Moderne Chinesische Medizin, 2015, 17 (4): 307

[6] Liu Wangcai, Zhu Jiawen Forschungsfortschritt in der Affinitätschromatographie-Technologie [J]. Shanghai Chemical Industry, 2007, 32 (4): 27

[7] Hong Minghan Affinitätschromatographie. Chemical World, 1981, 9:281

[8] Liao LX, Song XM, Wang LC, et al. Die hochselektive Hemmung von IMPDH2 bildet die Grundlage der Antineuroinflammationstherapie［J］． Proc Natl Acad Sci USA,2017,114 (29): E5986．

［9］ Wang Jing, Zhang Chundan, Yang Limin, et al. Die Aktivierungswirkung extrazellulärer Polysaccharide aus Pleurotus ferulae auf Mausmakrophagen [J]. Food Industry Technology, 2016, 37 (10): 356

［10］ Zhang Pengyu, Ruan Yingxin, Wang Yinan et al. Activin A fördert die phagozytische Aktivität von Peritonealmakrophagen der Maus ［ J ］. Zeitschrift der Akademie der Militärmedizinischen Wissenschaften, 2009, 33 (4): 330

［11］ Xie Zhijian, Xiong Xiaodong, Zuo Yun Fc Signaltransduktionsmechanismus der R-vermittelten Makrophagen-Phagozytose ［ J ］. Foreign Medicine Immunology, 2002, 25 (1): 5

［12］ Yuan Xiaolin, Zhang Chunlei, Li Dianjun Forschungsfortschritte zur Aktivierung von Makrophagen und ihren Signalmechanismen ［ J ］. International Journal of Immunology, 2007, 30 (5): 333