Der aktuelle Stand der Neuroprotektion bei angeborenen Herzfehlern Teil 3

3.2. Semiquantitative Bewertung ektopischer mitochondrialer DNA

Bilder der Hsp60-Färbung (der mitochondrialen Matrix) und der Histon-H2B-Färbung (der Kernmarker) wurden von Bildern der dsDNA-Färbung abgezogen. Anschließend wurden die Bilder mit der Funktion „AdjustThreshold“ der Image-Software (National Institutes of Health) binarisiert.

Mitochondrien sind die Energiefabriken in Zellen, die für die Synthese von ATP verantwortlich sind, um die von den Zellen benötigte Energie bereitzustellen. Die mitochondriale Matrix ist die innere Flüssigkeit der Mitochondrien, die eine Vielzahl von Enzymen und Ionen enthält und ein wichtiger Ort für verschiedene biochemische Reaktionen der Mitochondrien ist. Das Gedächtnis ist eine der wichtigsten kognitiven Fähigkeiten des Menschen. Obwohl die beiden scheinbar nichts miteinander zu tun haben, sind sie doch eng miteinander verbunden.

Untersuchungen zeigen eine Wechselwirkung zwischen der mitochondrialen Matrix und dem Gedächtnis. Enzyme und Ionen in der mitochondrialen Matrix können die Erregbarkeit von Neuronen direkt beeinflussen, indem sie den Energiestoffwechsel und den Ionenkanalstatus in neuronalen Zellen regulieren und so das Gedächtnis beeinflussen. Darüber hinaus gibt es in der mitochondrialen Matrix eine Vielzahl von Signalmolekülen, die über die Axone und Synapsen von Neuronen an nachgeschaltete Neuronen übertragen werden können, wodurch die Signaltransduktionseffizienz von Neuronen und damit die Bildung und Festigung des Gedächtnisses beeinflusst werden.

Gleichzeitig beeinflusst die Gedächtnisaktivität auch direkt den Zustand der mitochondrialen Matrix. Gedächtnisaktivitäten erhöhen den Energieverbrauch von Neuronen und fördern die Redoxreaktion in der mitochondrialen Matrix, wodurch das Stoffwechselniveau der Mitochondrien und das intrazelluläre Ionengleichgewicht beeinflusst werden, was sich weiter auf die Erregbarkeit und Signaltransduktionseffizienz von Neuronen auswirkt.

Daher ist die Aufrechterhaltung einer guten mitochondrialen Gesundheit von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung einer guten Gedächtnisfunktion. Durch die Beibehaltung guter Lebensgewohnheiten wie regelmäßige Ernährung, mäßige Bewegung, ausreichend Schlaf usw. können Sie dazu beitragen, die Gesundheit der mitochondrialen Matrix zu erhalten. Darüber hinaus kann die Gedächtnisfunktion auch durch geeignete pharmazeutische Interventionen verbessert werden, um biochemische Reaktionen und Signale innerhalb der mitochondrialen Matrix zu fördern.

Im täglichen Leben können wir unser Gedächtnis auf viele Arten trainieren, z. B. durch Lesen, Lernen, Denken, Spielen usw. Gleichzeitig sollten wir auch auf die Erhaltung unserer Gesundheit achten, um die Gesundheit der mitochondrialen Matrix besser zu erhalten. Ich glaube, dass wir durch diese Bemühungen sicherlich ein besseres Gedächtnis haben und die verschiedenen Herausforderungen im Leben und bei der Arbeit besser meistern werden. Es ist ersichtlich, dass wir das Gedächtnis verbessern müssen, und Cistanche deserticola kann das Gedächtnis erheblich verbessern, da Cistanche deserticola auch das Gleichgewicht von Neurotransmittern regulieren kann, beispielsweise durch die Erhöhung des Acetylcholin- und Wachstumsfaktorspiegels. Diese Stoffe sind sehr wichtig für das Gedächtnis und das Lernen. Darüber hinaus kann Cistanche deserticola auch die Durchblutung verbessern und die Sauerstoffversorgung fördern, wodurch sichergestellt werden kann, dass das Gehirn ausreichend Nährstoffe und Energie erhält, wodurch die Vitalität und Ausdauer des Gehirns verbessert werden.

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Wir haben dsDNA-Puncta mit einer Größe von 2 bis 20 um' (Rundheit 0.1-1.0) mithilfe der Funktion „Partikel analysieren-analysieren“ ausgewählt. Bei Bedarf wurden die Originalbilder für die endgültige Zählung untersucht. Wenn das Signal von Histon H2B klein war. dann zeigten die subtrahierten Bilder donutartige Strukturen.

Diese stellen zytosolische dsDNA nuklearen Ursprungs dar und sollten aus der Menge der zytosolischen dsDNA mitochondrialen Ursprungs eliminiert werden. Der Größenbereich kann je nach Zelltyp oder Herkunft histologischer Proben geändert werden. Abbildung lE zeigt ein Beispiel für die Zählung ektopischer mitochondrialer DNA

Punkte mit 1B D.

Alternativ wurden Bilder der Hsp60-Färbung von Bildern der dsDNA-Färbung subtrahiert. Anschließend wurde die Anzahl der dsDNA-Punkte mithilfe der Funktionen „Adjust-Threshold“ und „Analyze-Analyze Particles“ gezählt. Anschließend wurden dsDNA-Punkte ohne das Histon-H2B-Signal durch direkte Beobachtung gezählt. Die letztere Methode eignet sich für die Histon-H2B-Bilder weisen ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis auf.

Insgesamt kann diese Methode deutlich zeigen, dass ektopische mitochondriale DNA in das Zytoplasma gelangt, und ermöglicht eine objektive und statistische Auswertung solcher ektopischer mitochondrialer DNA in Zellen.

4. Diskussion

In unserer Studie haben wir eine Methode entwickelt, die die Zählung der zytoplasmatischen mitochondrialen DNA ermöglicht. Über den Nachweis zytoplasmatischer mitochondrialer DNA wurde mithilfe von Immunfluoreszenztechniken berichtet, die Methoden waren jedoch in den meisten Fällen nicht quantitativ für die Bewertung zytoplasmatischer mitochondrialer DNA [15,25]. In einer anderen Studie wurde eine Tröpfchen-PCR durchgeführt, um zirkulierende mitochondriale DNA zu quantifizieren [9].

kürzlich haben Sato et al. [26,27]veröffentlichte ein hervorragendes Protokoll zur Bewertung zytoplasmatischer DNA mittels Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Lamin B1 (LMNB1)-Antikörpern als Kernstrukturmarker und Cytochrom-C-Oxidase-Untereinheit 4 (COX4) als Mitochondrienstrukturmarker. Dieses Protokoll scheint für die Quantifizierung zytoplasmatischer dsDNA nuklearen Ursprungs sehr nützlich zu sein.

Als wir jedoch COX4 oder andere mitochondriale Membranmarker ausprobierten, darunter sowohl innere als auch äußere Marker, war es sehr schwierig, das Zytoplasma genau von den Mitochondrien zu unterscheiden.

Wenn wir beispielsweise zirkuläre Signale mithilfe eines mitochondrialen Membranmarkers und dsDNA-Signale darin beobachten würden, dann könnte diese dsDNA entweder mitochondriale DNA innerhalb der zirkulären Mitochondrien (normal) oder zytoplasmatische mitochondriale DNA außerhalb der Donut-ähnlichen Mitochondrien (ektopisch) darstellen. Daher verwendeten wir Hsp60 als Marker zur Markierung der Mitochondrienmatrix, um die ektopische mitochondriale DNA im Zytoplasma zu bewerten.

Wie in einer aktuellen Übersicht [23] beschrieben, gibt es viele verschiedene Arten von zytoplasmischer DNA nuklearen Ursprungs, und die meisten von ihnen sind positiv für Histonmarker. Aufgrund der begrenzten Kombination von Antikörpern, die für die Dreifachfärbung verwendet werden, verwendeten wir Histon H2Ba als Histonmarker.

Wenn diese Einschränkung jedoch gelöst wird, könnte H2AX ein besserer Marker für zytoplasmatische dsDNA nuklearen Ursprungs sein. Histon-H2B-negative zytoplasmatische dsDNA wurde in den in dieser Studie verwendeten Kontroll-HeLa-Zellen selten beobachtet, aber solche dsDNA nuklearen Ursprungs kann vorhanden sein, wenn andere Zelllinien oder Bedingungen verwendet werden.

Die in unserer aktuellen Arbeit verwendete In-situ-Hybridisierung mitochondrialer DNA eignet sich für die qualitative Bewertung, es könnte jedoch schwierig sein, die In-situ-Hybridisierung für die quantitative Bewertung zu nutzen [8].

Bei der In-situ-Hybridisierung wird die Probe hohen Temperaturen ausgesetzt, was zu Verformungen oder Geräuschen in einigen Teilen der Probe führen kann. Andererseits kann die in dieser Arbeit vorgestellte immunzytochemische Methode Signale mit geringem Hintergrundrauschen erhalten. In unserer jüngsten Arbeit haben wir in menschlichen Zellen und Zebrafischen, die als Modelle für die Parkinson-Krankheit verwendet wurden, gezeigt, dass mitochondriale DNA in das Zytoplasma gelangt ist, was für sie toxisch ist Zellen. Wir beobachteten auch, dass die Menge der zytosolischen mitochondrialen DNA im postmortalen Hirngewebe von Patienten mit Parkinson-Krankheit erhöht war [8].

Diese Belege deuten darauf hin, dass eine erhöhte Menge ektopischer mitochondrialer DNA, die aus den Mitochondrien austritt, akute und chronische Entzündungen hervorrufen kann, die zu verschiedenen Krankheiten führen können, darunter Parkinson-Krankheit und Herzversagen; Daher könnte die Hochregulierung des zytosolischen DNA-Abbaus oder die Hemmung seiner Sensoren ein potenzielles therapeutisches Ziel für diese Krankheiten sein [8,28].

Die in dieser Arbeit vorgestellte Methode zur quantitativen Auswertung ektopischer mitochondrialer DNA dient als wichtiges Instrument für die weitere Forschung auf diesem Gebiet.

Beiträge der Autoren: HM und MTH formulierten die Hypothesen, entwarfen die meisten Experimente, führten die Experimente durch, analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. NM führte die Experimente im Zusammenhang mit kultivierten Zellen durch. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und sind damit einverstanden.

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von AMED (Zuschussnummern JP21gm6110028 und JP19dm0107154 (HM)), der Takeda Science Foundation (HM), JSPS KAKENHI (Zuschussnummern JP14516799 (HM), JP 16690735 (HM) und JP 17925674 (HM) unterstützt. ), JST (Moonshot R&D; Fördernummer JPMJMS2024 (HM)) und Grants-in-Aid von TBRF (Fördernummer TBRF-RF 21-135 (HM)).

Erklärung zur Datenverfügbarkeit: Die in diesem Manuskript beschriebenen Daten und Tools sind auf Anfrage erhältlich.

Danksagungen: Wir danken Shinano Kobayashi für seine Teilnahme an hilfreichen Diskussionen und die kontinuierliche Unterstützung. Wir danken der Tokyo Biochemical Research Foundation (TBRF) für die Bereitstellung eines TBRF-Postdoktorandenstipendiums für ausländische Forscher an MH (TBRF-RF 21-135).

Interessenkonflikte: Die Autoren geben an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Verweise

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